本發(fā)明涉及治療奶牛乳房炎的藥物，具體涉及一種治療奶牛乳房炎的中藥組合物及其貼膜劑的制備方法。
背景技術：
：奶牛乳房炎的研究現(xiàn)狀：奶牛乳房炎是病原微生物感染、環(huán)境、飼養(yǎng)管理等因素綜合作用引起的奶牛乳腺炎癥，中獸醫(yī)稱為乳癰。奶牛乳房炎常造成奶牛泌乳量下降、鮮奶質(zhì)量降低、治療費用增加、牛群更替成本增加、影響人體健康等危害。作為奶牛生產(chǎn)中最常見的一種疾病，奶牛乳房炎給奶牛業(yè)造成了巨大損失。我國奶牛子宮內(nèi)膜乳房炎的發(fā)病率達20％～70％。我國對奶牛乳房炎的研究起于20世紀80年代初，現(xiàn)已取得了一定成績。研究顯示，引起奶牛乳房炎的主要致病菌以鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和霉形體為主。發(fā)病過程為：微生物入侵—乳腺內(nèi)建立感染—乳房形成炎癥。奶牛乳房炎治療方法的研究現(xiàn)狀：奶牛乳房炎常用的治療措施有：全身治療、局部治療(乳房灌注、乳房軟膏劑涂抹)和封閉治療。全身性治療主要有飼喂或灌服抗生素、中草藥散劑或湯劑，或注射大劑量抗菌藥物。全身用藥時乳房局部的藥物難以達到或維持有效濃度，且大量使用抗生素可導致血液和奶產(chǎn)品中抗生素殘留量超標。局部治療主要采用乳房灌注或乳房涂抹軟膏劑。局部治療雖有利于增加藥物利用率，但仍有乳房灌注操作繁瑣，對乳房形成刺激，軟膏劑不易保持，損失藥物的缺點。中醫(yī)對奶牛乳房炎的研究簡況：中獸醫(yī)認為，奶牛乳房炎屬乳癰范疇。多因肝氣郁滯，乳汁瘀積，兼感風寒之邪結(jié)聚而發(fā)。治宜舒肝理氣，活血清熱，通乳散結(jié)。根據(jù)中醫(yī)藥學理論，選擇合適的中藥進行組方，不僅可收到理想的治療效果，而且可以解決抗生素和激素殘留、耐藥菌株產(chǎn)生等問題。故根據(jù)中醫(yī)辨證施治原則，分析藥材現(xiàn)代藥理研究，采用治療乳癰的金銀花、蒲公英、等中藥材配合活血清熱、通乳散結(jié)的藥材，用于治療奶牛乳房炎，分析嚴謹，思路新穎，具有明顯優(yōu)勢，可制成療效確切、能廣泛應用于市場的新藥，填補國內(nèi)空白。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種用于治療奶牛乳房炎的中藥組合物，可以改善病牛的癥狀，無激素殘留，無耐藥菌株產(chǎn)生，提高用藥安全性。本發(fā)明還提供該中藥組合物的貼膜劑的制備方法，可以延長作用時間、增加藥物利用率、避免藥物損失、減少乳房刺激。本發(fā)明的解決方案是：一種治療奶牛乳房炎的中藥組合物，其特殊之處在于：包括以下重量份數(shù)的原料：金銀花20～40份、蒲公英40～80份、紫花地丁40～80份、蜂房8～16份、漏蘆16～30份、栝樓16～30份、黃芩15～25份、木通0～24份、絲瓜絡0～30份、薄荷腦0～3份。本發(fā)明的中藥組合物主治奶牛乳汁瘀滯，乳頭破損，致乳汁排出不暢，余乳積存，致使乳絡閉阻，乳汁瘀滯，日久敗乳蓄積，化熱而成癰腫。奶牛乳癰，多為頻繁擠奶所致乳房受損、皮膚受損，加之環(huán)境影響，后繼邪毒入侵，發(fā)乳房紅腫硬痛，乳汁狀態(tài)改變，并可能出現(xiàn)體溫升高、反芻減少、沉郁等全身癥狀。治宜清熱解毒、消癰散結(jié)，通乳排毒，消腫定痛。方以金銀花為君，其性甘、寒善清熱解毒，消炎退腫。《本草正》：“其性微寒，善于化毒。故治癰疽腫毒，瘡癬，楊梅，風濕諸毒，誠為要藥。毒未成者能散，毒已成者能潰。但其性緩，用須倍加或用酒煮服，或搗汁摻酒頓飲，或研爛拌酒厚敷。”主治癰腫疔瘡及多種感染性疾病。蒲公英、紫花地丁、栝樓、漏蘆均清熱解毒、消癰散結(jié)，共為臣藥。絲瓜絡、木通通經(jīng)下乳，黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，蜂房祛風止痛，諸藥疏經(jīng)通絡，消腫止痛，共為佐藥。薄荷腦為使，辛涼走竄，即疏散風熱，疏肝行氣，又助藥力直達病所。諸藥合用，共奏清熱解毒，消癰散結(jié)之功。優(yōu)選的，治療奶牛乳房炎的中藥組合物原料中，木通12～24份、絲瓜絡16～30份、薄荷腦1～3份。優(yōu)選的，治療奶牛乳房炎的中藥組合物原料中，金銀花30份、蒲公英60份、紫花地丁60份、蜂房12份、漏蘆24份、栝樓24份、黃芩20份，木通18份、絲瓜絡24份、薄荷腦2份。上述中藥組合物的中藥制劑，所述制劑類型為內(nèi)用制劑或外用制劑；所述內(nèi)用制劑包括顆粒劑、片劑、膠囊、丸劑、煎膏劑、糖漿劑、露劑；所述外用制劑包括貼膜劑、粉劑、溶液劑、軟膏劑、糊劑、酊劑、凝膠劑。上述中藥組合物的貼膜劑，其特殊之處在于：原料還包括防腐劑0～3重量份、聚乙烯醇178820～40重量份、羧甲基纖維素鈉8～16重量份、保濕劑10～40體積份、促滲劑3～8體積份、聚乙烯醇17990～40重量份、吐溫-800～5體積份，重量份的單位為g，體積份的單位為ml。具體的，上述保濕劑為甘油，防腐劑為苯甲酸鈉，促滲劑為氮酮。優(yōu)選的，上述苯甲酸鈉1～3重量份、聚乙烯醇179920～40重量份、吐溫-802～5體積份。優(yōu)選的，上述苯甲酸鈉1重量份、聚乙烯醇178830重量份、羧甲基纖維素鈉12重量份、聚乙烯醇179930重量份、甘油30體積份、氮酮5體積份、吐溫-803體積份。上述貼膜劑的制備方法，其特殊之處在于：包括按照時間順序的以下步驟：(1)各中藥原料分別稱重；(2)將蒲公英、紫花地丁、蜂房、漏蘆、栝樓、黃芩混合，有木通和絲瓜絡時，一塊混合加水煎煮；(3)過濾步驟2的煎煮液，將濾液靜置后，取上清液；(4)步驟3得到的上清液濃縮至每毫升含藥材0.8-1.2g，加入金銀花，停止加熱，自然冷卻，過濾；(5)向步驟4的濾液中加入聚乙烯醇1788浸泡溶脹；(6)將羧甲基纖維素鈉加入步驟5得到的溶液中，邊加邊攪拌，溶脹；(7)將加入聚乙烯醇1788、羧甲基纖維素鈉的藥液水浴加熱，攪拌混勻；(8)向步驟7得到的溶液中加入防腐劑、保濕劑、吐溫-80、促滲劑，水浴加熱，攪拌混勻；原料中有薄荷腦時，再向水浴加熱后的溶液中加入薄荷腦快速攪勻；(9)將步驟8得到的溶液平鋪在涂抹過液體石蠟的水平板上，使每平方厘米含藥材0.03-0.045g；(10)放置干燥，形成藥膜；(13)將藥膜揭下，敷于防粘紙上。優(yōu)選的，上述貼膜劑的制備方法中，步驟10和13之間還保護步驟11和步驟12，步驟(11)將聚乙烯醇1799加水浸泡溶脹，加入保濕劑，水浴加熱至均一透明膠體；步驟(12)將步驟11得到的透明膠體平鋪至步驟10得到的干燥的藥膜上，放置干燥。本發(fā)明的優(yōu)點是：(1)本發(fā)明的中藥組合物，具有良好的抑菌效果:抑菌試驗表明本發(fā)明制備的中藥組合物提取液具有優(yōu)良的抑菌效果。①抑菌圈測定試驗表明貼膜劑藥材提取液對黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有不同程度的抑制作用，對金黃色葡萄球菌高度敏感，對大腸桿菌中度敏感。②最低抑菌濃度試驗表明提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有一定的抑制作用，中對金黃色葡萄菌的抑菌效果好于大腸桿菌，其MIC分別為8mg/mL、31mg/mL。③最低殺菌濃度試驗結(jié)果顯示，藥材提取液對2種試驗菌均有一定的殺菌效果，其中對金黃色葡萄菌的殺菌效果優(yōu)于對大腸桿菌的殺菌效果。對金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度為31mg/mL，對大腸桿菌的最低殺菌濃度為125mg/mL。(2)本發(fā)明的中藥組合物，具有良好的抗炎效果：抗炎試驗結(jié)果表明本發(fā)明制備的中藥組合物及中藥制劑具有優(yōu)良的抗炎效果。給藥1h、2h后，與空白組比較，在左右耳片差值、腫脹率、腫脹抑制率方面，各給藥組均有顯著性減小。且貼膜劑與等劑量提取液比較，在左右耳片差值、腫脹率、腫脹抑制率方面，均有顯著性減小。(3)本發(fā)明的中藥組合物，與西藥特別是抗生素類藥物相比，殘留量小，毒副作用小，可避免耐藥性和藥物殘留的發(fā)生；各藥材配伍發(fā)揮綜合作用、可扶正祛邪，提高機體抗病能力：藥物殘留試驗結(jié)果表明本發(fā)明制備的中藥組合物及中藥制劑藥物殘留量不影響乳液發(fā)酵，可克服抗生素殘留影響；貼膜劑在給藥及停藥過程中病牛牛乳均發(fā)酵正常，外觀均勻凝固，其乳酸菌發(fā)酵不受影響。急性毒性與皮膚刺激性試驗表明本發(fā)明的中藥組合物毒副作用小。(4)本發(fā)明制成的中藥貼膜劑：能夠在較長時間內(nèi)保持相對恒定的血藥濃度。貼膜劑直接作用于發(fā)病部位，貼膜劑的有效成分經(jīng)皮膚吸收直接進入體內(nèi)，可避免藥物的“首過效應”及胃腸道反應，故而收效快，又在延長作用時間、增加藥物利用率、避免藥物損失、減少對乳房刺激等方面具有優(yōu)于灌注劑和軟膏劑的優(yōu)勢；具有使用方便的優(yōu)點，減少工作時間與勞動量。(5)本發(fā)明中藥貼膜劑的制備工藝：采用雙層膜制備工藝，利用不同規(guī)格聚乙烯醇的物理性能差異，使含藥的內(nèi)層吸水溶脹迅速，利于貼敷于乳房表面，使外層的膜光潔致密，起到保護內(nèi)層、防水及防污的作用。附圖說明圖1混合對照品HPLC色譜圖(327.0nm)；圖2混合對照品HPLC色譜圖(280.0nm)；圖3貼膜劑樣品HPLC色譜圖(327.0nm)；圖4貼膜劑樣品HPLC色譜圖(280.0nm)；圖5金銀花陰性貼膜劑樣品HPLC色譜圖(327.0nm)；圖6黃芩陰性貼膜劑樣品HPLC色譜圖(280.0nm)。具體實施方式實施例一：本發(fā)明的中藥組合物原料見表A：表A：中藥組合物原料實施例1.1-1.8中的中藥原料可以做成內(nèi)用制劑或外用制劑；所述內(nèi)用制劑包括顆粒劑、片劑、膠囊、丸劑、煎膏劑、糖漿劑、露劑，內(nèi)用制劑都需將原料煎煮；煎煮方法可以采用現(xiàn)有常規(guī)煎煮方法，包括但不限于以下方法：(1)各中藥原料分別稱重；(2)除金銀花以外的中藥原料混合，按10、8、6倍加水量煎煮3次，煎煮時間分別為1h、1h、0.5h；(3)以80-120目(優(yōu)選100目)濾布過濾煎煮液，濾液靜置過夜，上清液合并；(4)步驟3得到的上清液濃縮至每毫升含原藥材0.8-1.2g，優(yōu)選1g，加入金銀花，停止加熱，自然冷卻，過濾；實施例1.1-1.8中的中藥原料還可以做成外用制劑；所述外用制劑包括貼膜劑、溶液劑、軟膏劑、糊劑、酊劑、凝膠劑，優(yōu)選制成貼膜劑，在實施例1.1-1.8的中藥原料的基礎上加入表B中的輔料組分，可以制成貼膜劑。表B:本發(fā)明的中藥組分制成貼膜劑所需的輔料組分輔料組分實施例2.1實施例2.2實施例2.3苯甲酸鈉0g2g6g聚乙烯醇178840g60g80g羧甲基纖維素鈉16g23.2g32g聚乙烯醇17990g60g80g甘油20ml60ml80ml吐溫-800ml5ml10ml氮酮6ml10ml16ml制成貼膜劑的具體方法包括前述步驟1-4，還包括按照時間順序進行的以下步驟：(5)步驟4的濾液加入聚乙烯醇1788，浸泡12小時左右；(6)將羧甲基纖維素鈉加入，邊加邊攪拌，溶脹12小時左右；(7)將加入聚乙烯醇1788、羧甲基纖維素鈉的藥液水浴加熱，攪拌混勻；(8)加入苯甲酸鈉、甘油、吐溫-80、氮酮，水浴加熱，攪拌混勻；(9)原料中有薄荷腦時，加入薄荷腦快速攪勻，平鋪至75％酒精消毒、涂抹液體石蠟的水平玻璃板上，使每平方厘米含藥材0.03-0.045g，優(yōu)選0.039g；(10)放置干燥，形成藥膜；(13)將藥膜揭下，敷于防粘紙上，裁剪為10×14cm2的片狀藥貼100片，自封口塑料袋包裝。上述步驟制成的貼膜劑是單層膜，該單層膜含藥，吸水溶脹迅速，具粘合力，可直接貼敷于乳房表面，但是在外力下不易保持。因此，在上述步驟10和步驟13之間，加入步驟11和12，此時，制成的貼膜劑是雙層膜(在內(nèi)層膜的基礎上加了外層膜)。外層膜具有光潔致密的特點，起到保護內(nèi)層、防水、防污的作用。(11)將聚乙烯醇1799加水浸泡過夜，加入甘油，水浴加熱至均一透明膠體；(12)將步驟11得到的透明膠體平鋪至步驟10得到的干燥的藥膜上，放置干燥。以下通過實驗證明本發(fā)明的有益效果。1、本發(fā)明中藥組合物的抑菌效果試驗。1.1材料1.1.1藥材提取液的制備按照上述步驟1-4，制備實施例1.1-1.8的藥材提取液，下面以1.2為例，驗證抑菌效果。1.1.2對照品溶液的制備精密稱取泰樂菌素、林可霉素、慶大霉素對照品(編號分別為K0160911、K0100708、W-Z-5-02，含量分別為1026、843、635μ/mg，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)適量，滅菌水稀釋為1000μ/mL；精密稱取粘菌素對照品(編號K0270905，含量22156μ/mg，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所號)適量，滅菌水稀釋為25000μ/mL。1.1.3菌液的制備1.1.3.1取生長于普通營養(yǎng)瓊脂平板上的金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、大腸埃希菌CMCC(B)44102(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)用接種環(huán)蘸取少量菌落，接種到5mL的MH肉湯中，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)4～6h；1.1.3.2取對數(shù)生長期的菌液，用滅菌生理鹽水將濃度調(diào)至0.5標準麥氏比濁管，使其含菌量約1～2×108CFU/mL；1.1.3.3再將上述菌液用滅菌生理鹽水進行1:1000稀釋，此時菌液濃度約為1～2×105CFU/mL，稀釋好的菌液應在15min內(nèi)使用。1.2方法1.2.1抑菌圈的測定以打孔器制作直徑6.5mm的濾紙圓片，160℃干烤滅菌。將試驗菌液均勻接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿上，用滅菌鑷子夾取濾紙片，排列貼附于瓊脂表面，用微量移液器向濾紙片滴加藥材提取液、對照品溶液20μL，做好標記，37℃培養(yǎng)24小時，用游標卡尺測抑菌圈的直徑，以抑菌圈直徑來評定藥物的抑菌效果，每株菌種重復六次，取平均值。1.2.2最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度的(MBC)測定采用連續(xù)倍比試管稀釋法。取MH肉湯培養(yǎng)基按說明配制，于121℃高壓滅菌30min，取10支滅菌試管，各管分別加入MH肉湯1mL；用無菌槍頭吸取ImL藥材提取液于第1管中，混勻后吸取ImL于第2管中，依次稀釋到第8管，第8管混勻后吸取ImL棄去，第9、10管不加藥材提取液做對照；在第1管至第9管中分別加入己稀釋好的菌液O.1mL，使每管的最終菌液濃度約為1～2×104CFU/mL，此時第1管至第8管的藥物濃度分別為500、250、125、63、31、16、8、4mg/mL，第9管做陽性對照，在第10管中加入O.1mL滅菌生理鹽水做陰性對照；將接種好的稀釋管塞好塞子，置37℃培養(yǎng)箱中孵育16～20h，肉眼觀察，不發(fā)生渾濁變化的最高藥物稀釋倍數(shù)為該藥物的MIC值；用移液器從各個清晰無細菌生長的試管中吸取0.1mL培養(yǎng)液接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，以菌落數(shù)不超過5個的最低藥物濃度為該藥物的MBC值；每組藥物均應做三次重復試驗，取平均值。連續(xù)倍比試管稀釋法試驗操作詳見表1。表1連續(xù)倍比試管稀釋法注:“-”表示不加該種試劑。1.3試驗結(jié)果1.3.1抑菌圈測定結(jié)果藥材提取液對2種試驗菌具有不同程度的抑制作用，對金黃色葡萄球菌高度敏感，對大腸桿菌中度敏感；各抗生素對照品對2種細菌也產(chǎn)生了不同的抑菌效果，結(jié)果見表2。表2抑菌圈測定結(jié)果(直徑mm)藥材提取液泰樂菌素林可霉素粘菌素慶大霉素金黃色葡萄球菌16.5819.7818.93/24.08大腸桿菌10.99//11.7518.30注：抑菌圈直徑<10mm為耐藥(-)，10～15mm為中度敏感(+)，15mm以上為高度敏感(++)；“/”為未出現(xiàn)抑菌圈。1.3.2貼膜劑藥材提取液對試驗菌株的MIC測定結(jié)果藥材提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有一定的抑制作用。其中對金黃色葡萄菌的抑菌效果好于大腸桿菌。其MIC分別為8mg/mL、31mg/mL，結(jié)果見表3。表3貼膜劑藥材提取液MIC測定結(jié)果注：“+”表示試管有菌生長，“-”表示試管無菌生長1.3.3藥材提取液對試驗菌株的最低殺菌濃度(MBC)測定結(jié)果最低殺菌濃度試驗結(jié)果顯示，藥材提取液對2種試驗菌均有一定的殺菌效果，其中對金黃色葡萄菌的殺菌效果優(yōu)于對大腸桿菌的殺菌效果。對金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度為31mg/mL，對大腸桿菌的最低殺菌濃度為125mg/mL，結(jié)果見表4。表4貼膜劑藥材提取液MBC測定結(jié)果注：“-”表示試管無菌生長抑菌圈直徑測定、MIC和MBC試驗結(jié)果表明，本制劑對奶牛乳房炎的2種主要致病菌—金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有不同程度的抑制作用，較泰樂菌素、林可霉素、粘菌素抑菌范圍廣。結(jié)合其他實施例抑菌實驗的結(jié)果，得出以下結(jié)論：實施例1.1-1.8均有明顯的抗菌效果，實施例1.6的抗菌效果優(yōu)于其他實施例，但經(jīng)濟效益低；實施例1.1-1.4的抗菌效果均略次于實施例1.6，實施例1.7的抗菌效果次于實施例1.1-1.4，實施例1.5的抗菌效果最差。2、本發(fā)明的貼膜劑對小鼠的抗炎作用。2.1試驗方法SPF級KM小鼠，日齡25～30d，體質(zhì)量18～22g，雌雄各半，購自山東綠葉制藥有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(魯)20140002。取小鼠300只隨機分為10組，1組為空白組，2～4組分別為提取液A、B、C組(提取液A、B、C組是將實施例1.3組方的中藥提取液濃縮成不同的濃度，用藥量為40μL，耳殼雙面涂抹，給藥量分別相當于原藥材0.04g、0.02g、0.01g)，5～7組為實施例1.3的中藥組分及實施例2.2的輔料組分制成的貼膜劑大、中、小面積組(耳殼雙面黏貼，面積分別為0.7×0.7cm2×2片，0.5×0.5cm2×2片，0.35×0.35cm2×2片，給藥量分別相當于原藥材0.04g、0.02g、0.01g)，8組為地塞米松對照組(20μL，耳殼雙面涂抹)，9～10組為實施例1.2的中藥組分和實施例1.1的中藥組分分別與實施例2.2的輔料組分制成的缺少藥材貼膜劑組(貼劑A組為缺少薄荷腦藥材組，貼劑B組為缺少薄荷腦、木通、絲瓜絡組，制備方式與貼膜劑制備方式相同，但缺少相應藥材。中面積給藥，給藥量相當于原藥材0.017g)。各組小鼠均于右耳正反面均勻涂抹二甲苯40μL[1]，，左耳作為空白對照。致炎1h后，分別在各組小鼠右耳按試驗設計給藥。于給藥1h后，每組處死15只小鼠；給藥2h后，處死剩余15只小鼠。小鼠處死后，剪下雙耳，耳緣對齊，用打孔器在同一部位摘取耳片，分別稱量左右耳質(zhì)量，計算小鼠左右耳片差值、腫脹率、腫脹抑制率[2]。左右耳片差值＝右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量腫脹率＝(右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量)/左耳質(zhì)量腫脹抑制率＝(空白組腫脹率-腫脹率)/空白組腫脹率2.2統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)以表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，若方差齊，組間均值兩兩比較采用S-N-K法，若方差不齊，組間均值兩兩比較采用DunnettT3法。所有統(tǒng)計均由SPSS13.0統(tǒng)計軟件完成，α＝0.05。2.3結(jié)果結(jié)果見表5。可知，給藥1h后，與空白組比較，左右耳片差值、腫脹率、腫脹抑制率方面，各給藥組、對照組均有顯著性減小(P＜0.01)。與等劑量提取液比較，左右耳片差值方面，給藥量0.01g貼膜劑有顯著性減小(P＜0.05)，給藥量0.04g、0.02g貼膜劑有顯著性減小(P＜0.01)；腫脹率方面，給藥量0.01g貼膜劑有顯著性減小(P＜0.05)，給藥量0.04g、0.02g貼膜劑有顯著性減小(P＜0.01)；腫脹抑制率方面，給藥量0.02g貼膜劑有顯著性減小(P＜0.01)，給藥量0.04g、0.01g貼膜劑有顯著性減小(P＜0.05)。全方組與缺少薄荷藥材組比較，左右耳片差值、腫脹率、腫脹抑制率方面，各給藥組、對照組均有顯著性減小(P＜0.05)；與缺少薄荷腦、木通、絲瓜絡3味藥材組比較，左右耳片差值、腫脹率、腫脹抑制率方面，各給藥組、對照組均有顯著性減小(P＜0.01)。缺少薄荷藥材組與缺少薄荷腦、木通、絲瓜絡3味藥材組比較，左右耳片差值、腫脹率、腫脹抑制率方面，各給藥組、對照組均有顯著性減小(P＜0.05)。給藥2h后，與空白組比較，左右耳片差值、腫脹率、腫脹抑制率方面，各給藥組、對照組均有顯著性減小(P＜0.01)。與等劑量提取液比較，左右耳片差值、腫脹率、腫脹抑制率方面，貼膜劑組均有顯著性減小(P＜0.01)。全方組與缺少薄荷藥材組比較，左右耳片差值、腫脹率、腫脹抑制率方面，各給藥組、對照組均有顯著性減小(P＜0.05)；與缺少薄荷腦、木通、絲瓜絡3味藥材組比較，左右耳片差值、腫脹率、腫脹抑制率方面，各給藥組、對照組均有顯著性減小(P＜0.01)。缺少薄荷藥材組與缺少薄荷腦、木通、絲瓜絡3味藥材組比較，左右耳片差值、腫脹率、腫脹抑制率方面，各給藥組、對照組均有顯著性減小(P＜0.05)。表5小鼠耳腫脹試驗結(jié)果(n＝15)注：與空白組比較：*P＜0.01；與同等劑量提取液比較：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與貼劑中面積組比較：△P＜0.05，△ΔP＜0.01；與貼劑B組比較：○P＜0.05。結(jié)論：同等用藥劑量，貼膜劑的抗炎效果優(yōu)于提取液的抗炎效果；同等原料用量的前提下，缺少薄荷腦的貼膜劑效果次于全方貼膜劑，缺少薄荷腦、木通、絲瓜絡的貼膜劑效果次于缺少薄荷腦的貼膜劑。3、貼膜劑對健康家兔的急性毒性與皮膚刺激性試驗。3.1透皮貼膜劑急性毒性試驗貼膜劑組方以傳統(tǒng)治療乳癰的中藥驗方為基礎，按照中醫(yī)藥理論，結(jié)合清熱解毒中藥，采用現(xiàn)代制藥方式制備的外用中藥復方制劑。組方中各藥材藥理學研究結(jié)果均顯示藥物作用溫和。為驗證新制劑技術對藥理作用的影響，故采用家兔按臨床給藥途徑進行急性毒性試驗。3.1.1實驗材料家兔，雌雄兼用，2.2-2.5kg，購自購自山東綠葉制藥有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(魯)20140002。貼膜劑(自制，批號20140411，每平方厘米相當于原藥材0.039g)。空白輔料膜(自制)。3.1.2.方法與結(jié)果取健康白色家兔20只，雌雄兼用，體重2.2-2.5kg，于給藥前24h，將家兔背部兩側(cè)用剃毛器剃去被毛，去毛面積分別為5Ocm2。皮膚損傷組用手術刀在剃毛區(qū)皮膚上劃出“井”切口，深度為2-3mm，以不損傷皮下組織并有滲血為止。第1組為空白對照組，敷空白輔料膜，藥膜面積7cm×7cm×2片；第2組為實施例1.3的中藥組分與實施例2.2的輔料組分制成的貼膜劑大劑量組(完整皮膚)，貼敷藥膜面積為7cm×7cm×2片(相當于3.82g原藥材)；第3組為貼膜劑小劑量組(完整皮膚)，貼敷藥膜面積為5cm×5cm×2片(相當于1.95g原藥材)。第4組，第5組分別為破損皮膚大、小劑量組，劑量設置同2、3組。取出貼膜劑，以溫水涂抹含藥層，使貼膜劑溶脹恢復粘性，貼于剃毛區(qū)，固定，保持24h后，除去貼膜劑，清理殘留藥物，觀察動物1,24,48,72h至第7天的體重、飲食、大小便、活動、皮膚、毛發(fā)、眼、粘膜和呼吸等癥狀，并與對照組比較。結(jié)果見表6。表6貼膜劑對皮膚的急性毒性實驗由結(jié)果可知，貼膜劑在急性毒性實驗中，無論是完整皮膚還是破損皮膚，給藥劑量為3.82g原藥材每只時，家兔無一死亡和異常反應，證明貼膜劑對家兔無急性毒性。3.2貼膜劑的皮膚局部刺激試驗3.2.1實驗材料家兔，雌雄兼用，2.2-2.5kg，購自購自山東綠葉制藥有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(魯)20140002。實施例1.3的中藥組分與實施例2.2的輔料組分制成的貼膜劑(自制，批號20140411，每平方厘米相當于原藥材0.039g)。空白輔料膜(自制)。3.2.2方法與結(jié)果取成年健康白色家兔16只，雌雄各半，體重2.2-2.5kg，將家兔背部脊柱兩側(cè)被毛剃除，剃毛面積每側(cè)約為25cm2。隨機分為4組，完整皮膚高、低劑量組與破損皮膚高、低劑量組。破損皮膚組用手術刀在左側(cè)脫毛區(qū)皮膚上劃出“井”切口，深度為2-3mm，以不傷皮下組織并有輕度滲血為止。采用同體左右兩側(cè)自身對比，右側(cè)去毛區(qū)敷貼膜劑，面積為3cm×3cm(相當于原藥材0.35g)，左側(cè)去毛區(qū)敷空白輔料膜作為對照，面積為3cm×3cm。取出貼膜劑，以溫水涂抹含藥層，使貼膜劑溶脹恢復粘性，貼于剃毛區(qū)，固定。高劑量組每日早、晚各給藥1次，低劑量組每日早上給藥1次，每次給藥保持時間4h，連續(xù)給藥7日。每次貼敷結(jié)束后，除去藥貼，清潔貼藥部位，一小時后觀察皮膚狀況并評分。末次給藥結(jié)束后，記錄去除受試藥物后24,48,72h的貼藥部位皮膚狀況并評分。評分標準見表7，評分結(jié)果見表8。表7皮膚刺激反應評分標準表8對家兔皮膚刺激分值表9皮膚刺激性強度評價標準由以上結(jié)果可見，無論高劑量還是低劑量，完整皮膚組受試兔均未出現(xiàn)紅斑和水腫，分值均記分為0，按評分標準判斷為未受刺激；破損皮膚組受試兔皮膚均未出現(xiàn)水腫，出現(xiàn)的輕微紅斑不在一只受試兔上，且下次觀察評分時均消褪，平均分值記為0.25，根據(jù)評分標準判定為無刺激性。在試驗的一周內(nèi)，16只受試兔精神良好，采食、尿液及糞便均正常，未見中毒或異常癥狀。說明透皮貼膜劑無皮膚刺激性。4、貼膜劑穩(wěn)定性試驗。采用加速試驗進行貼膜劑穩(wěn)定性考察。加速試驗在超常條件下進行，通過加速中藥、天然藥物的化學或物理變化，探討其穩(wěn)定性，為中藥、天然藥物制劑的審評、工藝改進、包裝、運輸及貯存提供必要的資料。4.1儀器與材料4.1.1儀器：HPS—250生化培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司)4.1.2材料：實施例1.3的中藥組分與實施例2.2的輔料組分制成的貼膜劑3批(批號：20140306、20140412、20140505，自制)；包裝材料：塑料袋，密封；Na2CrO4飽和溶液(30℃，RH64.8％)4.2方法：取3批制劑，在30℃±2℃、RH65％±5％的條件下放置6個月。在試驗期間第0、1、2、3、6個月末取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目檢測。4.3結(jié)果：各時間點貼膜劑性狀外觀、主成分含量、微生物限度試驗結(jié)果均符合質(zhì)量標準要求，結(jié)果見表10。表10貼膜劑穩(wěn)定性試驗結(jié)果試驗表明，在密封情況下，貼膜劑性狀外觀、主成分含量均無明顯變化，微生物限度符合質(zhì)量標準要求。5.貼膜劑治療中牛奶藥物殘留對乳酸菌發(fā)酵的影響5.1材料與方法5.1.1試驗藥物實施例1.3的中藥組分與實施例2.2的輔料組分制成的貼膜劑(自制，批號20140411，每平方厘米相當于原藥材0.039g)，放置于4℃冰箱中，備用。注射用氯唑西林鈉，上海康復特獸用化學制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格0.5g，批號20140301。5.1.2試驗動物于煙臺市萊山奶牛場選擇同處于泌乳期、日均產(chǎn)奶量相當?shù)拿谌槟膛＃?jīng)CMT乳房炎診斷試劑檢測呈強陽性的奶牛8頭。5.1.3試驗設計8頭奶牛隨機分成兩組，一組用貼膜劑外貼給藥，每天3次(每次擠奶后均貼敷)，另一組用氯唑西林鈉灌注給藥，每天上午、下午各一次，均連用4天。分別采集用藥前和用藥后第2天、第4天、第6天、第8天的乳樣，經(jīng)消毒滅菌后，按3％接種量接種保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌呈1:1的混合物，42℃培養(yǎng)3.5h后觀察酸乳樣外觀，并按照《GB5413.34-2010食品安全國家標準乳和乳制品酸度的測定》測定酸度。5.2結(jié)果與分析不同藥物治療對酸奶生產(chǎn)的影響如表11所示，氯唑西林鈉治療后第2天的乳樣進行培養(yǎng)時，發(fā)酵受到嚴重抑制，不能產(chǎn)生足夠的酸度使牛奶凝固，停藥后抑制逐漸降低，酸度增加，至停藥后第4天恢復至正常；而貼膜劑在給藥及停藥過程中均發(fā)酵正常，外觀均勻凝固。表11不同藥物治療對酸奶生產(chǎn)的影響本發(fā)酵試驗表明，與氯唑西林鈉治療相比，貼膜劑治療奶牛乳腺炎的乳樣，其乳酸菌發(fā)酵不受影響。6、實施例1.3的中藥組分與實施例2.2的輔料組分制成的貼膜劑主成分含量6.1儀器、試藥6.1.1儀器：Agilent1200型高效液相色譜儀(四元泵，柱溫箱，在線脫氣機，自動進樣器，二極管陣列檢測器，美國安捷倫公司)，AgilentZORBOXSB-C18色譜柱(5μm，4.6mm×250mm，美國安捷倫公司)，XS105十萬分之一電子分析天平(瑞士梅特勒公司)，U-2010紫外可見分光光度計(日本日立公司)，DHL-1001型電熱恒溫干燥箱(龍口市先科儀器公司)，SK8200H超聲清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)。6.1.2試藥：綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201314，ID：AK2V-A9LL，含量96.6％)；黃芩苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201318，ID：CT96-7QL7，含量93.3％)；乙腈(色譜純，天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心)；水為三蒸水，其余試劑為分析純。貼膜劑(自制，批號20140411，規(guī)格：每貼4.5g，含金銀花原藥材0.6g、黃芩原藥材0.4g)，金銀花、黃芩陰性貼膜劑樣品(自制)。6.2方法與結(jié)果6.2.1溶液制備6.2.1.1混合對照品溶液：精密稱取綠原酸36.08mg加甲醇溶解定容至100ml，黃芩苷38.42mg加甲醇溶解定容至50ml，得濃度為348.5μg/ml、716.9μg/ml的綠原酸、黃芩苷對照品溶液。將上述對照品溶液按1：1比例混合，得混合對照品溶液。混合對照品溶液中綠原酸、黃芩苷含量分別為：174.3μg/ml、358.5μg/ml。6.2.1.2供試品溶液及陰性樣品溶液：將貼膜劑剪碎，稱取4.5g，加蒸餾水40ml浸泡溶解，用鑷子將不溶的保護層取出，蒸餾水沖洗，洗液合并至浸泡溶液中，將溶液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，蒸餾水定容。精密量取浸泡液5ml至50ml離心管中，加無水乙醇30ml，搖勻，5000r/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干。加甲醇20ml研勻，轉(zhuǎn)移至25ml棕色容量瓶中，定容，超聲提取20min，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。同法制備不含金銀花與黃芩的陰性貼膜劑樣品溶液。6.2.2色譜分析條件的優(yōu)選經(jīng)比較文獻所采用的測定綠原酸、黃芩苷的方法[2、3、4、5]，發(fā)現(xiàn)有雜質(zhì)峰不能與綠原酸良好分離。為能達到同時測定樣品中綠原酸、黃芩苷兩種成分的目的，采用梯度洗脫方式，以二極管陣列檢測器進行檢測。通過系統(tǒng)優(yōu)化，確定色譜條件為：乙腈:0.2％磷酸水溶液20:80-60:40，30min線性梯度洗脫，流速：1.00ml/min，柱溫：40.0℃，檢測波長分別為綠原酸327.0nm,黃芩苷280.0nm，進樣量10μl。在此條件下，樣品分離效果好，其他成分對綠原酸、黃芩苷的測定無干擾(與相鄰共存物之間的分離度大于2.6)，綠原酸、黃芩苷保留時間分別為3.5min、10.4min左右，理論塔板數(shù)均大于6000。混合對照品溶液與樣品溶液色譜圖見圖1、圖2、圖3、圖4。6.2.3空白對照實驗按組方比例分別制得缺金銀花(綠原酸)和缺黃芩(黃芩苷)的兩種陰性樣品，按6.2.1.2項下方法制備2種陰性樣品溶液，按6.2.2項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，結(jié)果在綠原酸、黃芩苷對照品峰相對應處未出現(xiàn)色譜峰，見圖5、圖6。表明按本實驗條件，處方中的其他成分不干擾綠原酸、黃芩苷的測定。6.2.4線性關系考察精密量取混合對照品溶液1.00ml、2.50ml、5.00ml、7.50ml、10.00ml至25ml容量瓶中，加入甲醇至刻度，混勻，制成分別含綠原酸為7.0、17.4、34.9、52.3、69.7μg/ml，黃芩苷為14.3、35.8、71.7、107.5、143.4μg/ml的標準溶液。按6.2.2項下優(yōu)選出的色譜條件進樣，記錄液相色譜圖、峰面積。結(jié)果見表12、表13。表12綠原酸線性關系試驗結(jié)果表13黃芩苷線性關系試驗結(jié)果對表12、表13數(shù)據(jù)進行線性回歸，得綠原酸標準曲線為：Y＝725.1690X-0.8790，r＝0.9996；黃芩苷標準曲線為Y＝2098.2640X-24.8078，r＝0.9999。結(jié)果表明在此色譜條件下，綠原酸在0.14～1.39μg范圍內(nèi)，黃芩苷在0.29～2.87μg范圍內(nèi)線性關系良好。6.2.5精密度試驗取綠原酸濃度為34.9μg/ml，黃芩苷濃度為71.7μg/ml的混合對照品溶液，按6.2.2項下色譜條件，連續(xù)進樣5次，測定峰面積值，結(jié)果見表14。表14精密度試驗結(jié)果結(jié)果表明，本方法精密度良好。6.2.6穩(wěn)定性試驗取供試液，室溫下自然放置，分別于0、2、4、8、16小時，按6.2.2項下色譜條件進樣，測定峰面積值，結(jié)果見表15。表15穩(wěn)定性試驗結(jié)果結(jié)果表明，樣品溶液在16小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。6.2.7重現(xiàn)性試驗取同一批次樣品6份,按6.2.1.2項下方法制備供試液，按6.2.2項下色譜條件進樣測定，結(jié)果見表16。表中各成分含量為相當于每g制劑所含該成分的mg數(shù)。表16重現(xiàn)性試驗結(jié)果結(jié)果表明此方法重現(xiàn)性良好。6.2.8加樣回收試驗稱取已知含量的貼膜劑6份，每份約0.45g，精密加入綠原酸、黃芩苷混合對照品溶液(綠原酸濃度為174.3μg/ml，黃芩苷濃度為358.5μg/ml)10.00ml，浸泡混合均勻。按6.2.1.2項下方法制備供試液，按6.2.2項下色譜條件進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表17、表18。表17綠原酸加樣回收試驗結(jié)果表18黃芩苷加樣回收試驗結(jié)果結(jié)果表明，本法測定供試品中綠原酸、黃芩苷含量加樣回收率良好。6.2.9綠原酸、黃芩苷含量測定結(jié)果按上述含量測定方法，測定不同批次貼膜劑中綠原酸和黃芩苷的含量，結(jié)果見表19。表中各成分含量為相當于每g制劑所含該成分的mg數(shù)。表19樣品含量測定結(jié)果(mg·g-1,n＝3)7、臨床試驗研究為表明本發(fā)明的貼膜劑對奶牛乳房炎的治療效果，本發(fā)明經(jīng)144例臨床應用，對臨床型乳房炎治療總治愈率達79.4％，總有效率為91.2％；對隱性乳房炎治療總治愈率82.5％，總有效率92.5％。分別在煙臺市各縣市區(qū)奶牛養(yǎng)殖場進行了推廣試驗，從推廣應用的情況看，該制劑具有使用方便，療效可靠等優(yōu)點，值得進一步擴大應用。7.1臨床型乳房炎在煙臺市萊山奶牛場、山東荷斯坦奶牛繁育中心有限公司選擇臨床型病例患病奶牛，共64頭，依診斷標準區(qū)分為急性乳房炎型22頭和亞急性乳房炎型42頭，每型分別隨機分為兩組，一組以貼膜劑治療，一組以氯唑西林鈉乳房灌注治療。臨床型乳房炎診斷標準：(1)急性乳房炎。突然發(fā)病，乳房發(fā)紅、腫脹、變硬、疼痛，乳汁顯著異常和減少，出現(xiàn)全身癥狀。病牛體溫升高，食欲減退，反芻減少，脈搏增速，脫水，全身衰弱、沉郁。(2)亞急性乳房炎。病牛一般沒有全身癥狀，最明顯的異常是乳汁中有絮片、凝塊，并呈水樣。乳房有輕微發(fā)熱、腫脹和疼痛。使用方法：對病牛的患病乳區(qū)，先擠干奶，再將乳房洗凈擦干。取出貼膜劑，以溫水涂抹含藥層，使貼膜劑溶脹恢復粘性。選擇乳房被毛稀薄、表皮輕薄區(qū)域，將本品貼敷在患病乳區(qū)上，輕按保持數(shù)十秒，使貼膜劑與奶牛乳房表皮接合緊密。每個乳房兩貼，保持至下次擠奶。擠奶后重復貼敷。每天3次(每次擠奶后均貼敷)，連用3～4天。使用注意:(1)本品為外用藥，不可內(nèi)服。(2)乳房壞疽、損傷性乳房出血忌用。(3)如有嚴重性的全身癥狀，應配合其它藥物進行綜合對癥治療。(4)對急性病例，發(fā)病初期，只能冷敷。對亞急性病例，在使用本品前進行熱敷，可增強本品療效。(5)使用前一定要將乳房洗凈擦干，以免影響粘合效果并最終影響療效。效果評價標準：(1)痊愈：凡治療后病牛乳房紅腫消退，乳汁恢復正常，產(chǎn)奶量恢復病前水平，精神食欲等恢復正常。(2)有效或好轉(zhuǎn)：乳房紅、腫、熱、痛基本消失，乳汁尚有少量凝塊，產(chǎn)奶量回升。(3)無效:病牛乳房癥狀無好轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)為慢性炎癥。治療效果:在對重癥病例治療過程中，治愈率只有75.0％(9/12)，而對輕癥病例治愈率為81.8％(18/22)，總治愈率和總有效率分別為79.4％(27/34)和91.2％(31/34)；與此相對比，氯唑西林鈉灌注對照組，對重癥病例和輕癥病例治愈率可分別為80％(8/10)和85.0％(17/20)，總治愈率和總有效率分別為83.3％(25/30)和90.0％(28/30))。結(jié)果見表20。表20“貼膜劑”對臨床型乳房炎臨床治療結(jié)果從表中可以看出，貼膜劑對臨床乳房炎具有顯著的治療效果，與同是局部給藥的氯唑西林鈉灌注治療對照相比，治愈率略低，有效率略高，差異不顯著。但中藥貼膜劑不存在抗生素殘留、耐藥性問題，對后期牛奶收購影響較小。該結(jié)果也提示我們，對嚴重的臨床型病例可配合使用青霉素等抗生素，絕對排除抗生素也是不合理的。7.2隱性乳房炎在煙臺市萊山奶牛場、山東荷斯坦奶牛繁育中心有限公司選擇臨床型病例患病奶牛，共80頭。隨機分為兩組，一組以貼膜劑治療；另一組作為對照，不加處置。隱性乳房炎診斷標準：用CMT乳房炎診斷試劑檢測陽性程度在“++”以上為隱性乳房炎病例。使用方法：對病牛的患病乳區(qū)，先擠干奶，再將乳房洗凈擦干。取出貼膜劑，以溫水涂抹含藥層，使貼膜劑溶脹恢復粘性。選擇乳房被毛稀薄、表皮輕薄區(qū)域，將本品貼敷在患病乳區(qū)上，輕按保持數(shù)十秒，使貼膜劑與奶牛乳房表皮接合緊密。每個乳房兩貼，保持至下次擠奶。擠奶后重復貼敷。每天3次(每次擠奶后均貼敷)，連用6～8天。效果評價標準：(1)痊愈：經(jīng)治療后，用CMT檢測，凡從“+++”(強陽性)轉(zhuǎn)為“-”、“±”(陰性或可疑)判為治愈；(2)有效或好轉(zhuǎn)：“+++”～“+”為好轉(zhuǎn)；(3)凡“+++”“++”在治療后不變的為無效。治療效果:分別測定治療當日、治療第6天和治療第8天的測定結(jié)果。治療6天后，治愈率達65.0％(26/40)，有效率達82.5％(33/40)；至治療8天后治愈率和有效率分別達82.5％(33/40)和92.5％(37/40)。對照組未見一頭好轉(zhuǎn)。結(jié)果見表21。表21“貼膜劑”對隱性乳房炎臨床治療結(jié)果從表可以看出，貼膜劑對隱性乳房炎也有較好的治療效果，治療8天后，總治愈率達到了82.5％(33/40)，總有效率為92.5％(37/40)。根據(jù)該結(jié)果，在使用貼膜劑治療隱性乳房炎時，宜治療6～8天，可獲滿意療效。當前第1頁1 2 3