本發明涉及檢測
技術領域：
，特別涉及一種奶牛乳房炎檢測試劑盒。
背景技術：
：奶牛乳房炎(Mastitis)是奶牛乳腺受到物理、化學、微生物等因素刺激所引起的奶牛乳房的炎癥，表現為乳汁發生理化性質及細胞學性質的變化、乳腺組織發生病理學變化，是奶牛的常發病之一。根據乳房和乳汁有無臨床可見的變化將乳房炎分為臨床型乳房炎(ClinicalMastitis)和隱性型乳房炎(SubclinicalMastitis)。隱性乳房炎表現為患牛的乳房和乳汁肉眼觀察無異常，需要通過體細胞計數或借助其他診斷方法才能發現的乳房炎癥。據國際奶牛聯合會統計，20世紀70年代，奶牛臨床型乳房炎患病率約2％，隱性乳房炎病牛高達50％；美國飼養的1100萬頭奶牛中，半數患有各種類型乳房炎；日本全國平均乳房炎患病率為45.1％。我國乳房炎的發生率更高，一般在20％-70％。中國農科院中獸醫研究所對西北、華北、東北、華南地區22個城市32個奶牛場1037頭成年泌乳牛進行臨床型乳房炎病因及發病情況調查，并對其中5個地區20個奶牛場3384頭泌乳牛用蘭州乳房炎實驗進行隱性乳房炎調查，結果表明臨床型乳房炎發病率為33.41％，隱性乳房炎奶牛頭陽性率為73.91％，陽性乳區檢出率為44.74％。據報道，北京和天津地區的隱性乳房炎陽性率為50％-80.9％；蘭州和太原的隱性乳房炎的發病率為50％左右。青海省某奶牛場隱性乳房炎的乳頭患病率和乳區患病率分別為54.08％和25.89％。綜上所述，奶牛乳房炎在世界范圍內感染率都很高，在我國奶牛乳房炎的感染情況也相當嚴重，乳房炎感染類型主要以隱性型為主。乳房炎對奶牛養殖業、牛奶的營養價值和食品安全帶來巨大的危害。首先乳房炎引起嚴重的經濟損失，國外對奶牛乳房炎引起的經濟損失的傳統估計是根據奶產量的降低、奶的丟失、藥費開支、獸醫費用和勞動力費用等的增加來統計。據報道，英國每年治療奶牛乳房炎的平均花費為每頭奶牛187英鎊，美國每年用于每頭奶牛乳房炎的花費為177-182美元，芬蘭、挪威、瑞典每年因乳房炎問題淘汰的奶牛占淘汰奶牛的35％、19％和22％，可見乳房炎的發生給奶牛養殖業帶來的經濟損失巨大。在這些經濟損失中，由于產奶量的降低引起的損失占70％，由于患病而使奶牛提早淘汰占14％，廢棄乳汁占7％，治療及獸醫費用占8％等，而且經濟損失主要來自于隱性乳房炎，其造成的損失占母牛每年總生產能力的10-11％。其次，乳房炎使乳的品質大大下降，乳中含有豐富的蛋白質、脂肪和糖類，在乳房炎疾病期間，致病菌損害乳腺的分泌細胞，引起乳腺組織損傷，某些營養成分丟失，使營養成分不全而降低牛奶的保健作用。隱性乳房炎乳汁中氨基酸總量也由平均2.2387g/100mL降低了21％，其中蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸5種必需氨基酸及組氨酸、精氨酸顯著降低；乳糖、酪蛋白、脂肪、Ca2+、P3-、K+等有益成分的含量均降低或明顯降低；而免疫球蛋白、酯酶、炎性因子、致病菌及其產生的毒素等有害成分的含量則增加，熱穩定性降低。此外，奶?；加腥榉垦准膊『笏a的乳汁中含有大量的炎性因子、致病菌及其產生的毒素，如果飲用了消毒不嚴或攙雜了含有致病菌的牛奶，則會使人感到身體不適，嚴重者可誘發疾病。在治療乳房炎疾病過程中出現濫用抗生素，有些經營者不淘汰治療期間的患牛乳汁，造成抗生素在牛奶中殘留，引起食用者發生過敏反應，尤其對老年人和嬰幼兒危害會更大。因此，及時地、準確地對奶牛乳房炎疾病做出診斷極為重要。臨床型奶牛乳房炎主要通過臨床癥狀來進行診斷，隱性乳房炎則主要通過輔助診斷方法進行監測。乳房炎的發病率非常高，尤其隱性乳房炎，養牛場要隨時監測，及時作出診斷，以便整群預防。根據奶?；既榉垦子腥橹屑毎龆嗟奶卣鞫⒘酥苯訖z測法和間接檢測法。直接檢測法主要有體細胞直接計數法、電子計數法、熒光電子細胞計數法等，在國內目前最常采用的為體細胞直接計數法。病理學研究證實，乳房感染發炎后，大量白細胞進入乳腺，部分上皮細胞脫落，使乳汁中體細胞數顯著升高。根據這一原理，計算每毫升乳汁中的體細胞數，此法檢測結果最為準確，這是診斷隱性乳房炎的基準，也是其他診斷方法作對照的標準。間接法是目前臨床上最常用的方法，其分為化學檢測法和物理檢測法，其中目前在臨床上以化學檢測法最為常用。化學檢測法是間接測定乳汁細胞數和乳汁pH值的方法。房炎發生時，乳汁的pH值上升，通過測定乳汁pH值便可以達到判定的目的。但這些檢測方法均需要專門的檢測儀器，操作復雜，對操作人員要求高。因此，需要提供一種操作簡單、快速準確的奶牛乳房炎檢測方法。技術實現要素：有鑒于此，本發明提供了一種奶牛乳房炎檢測試劑盒。該奶牛乳房炎檢測試劑盒可快速準確檢測奶牛乳房炎，不需要借助特殊儀器，肉眼就可以直接判斷結果，技術人員很容易掌握，同時可以批量檢測。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了一種奶牛乳房炎檢測試劑盒，包括：革蘭氏陰性菌顯色培養基、革蘭氏陽性菌顯色培養基和腸球菌金色葡萄球菌共顯色培養基；革蘭氏陰性菌顯色培養基包括第一基礎培養基和第一牛肉粉基；第一基礎培養基為法國科瑪嘉革蘭氏陰性菌培養基；革蘭氏陽性菌顯色培養基包括第二基礎培養基、第二牛肉粉和氯化鈉；第二基礎培養基為法國科瑪嘉革蘭氏陽性菌培養基；腸球菌金色葡萄球菌共顯色培養基包括腸球菌基礎培養基和金黃色葡萄球菌基礎培養基。作為優選，革蘭氏陰性菌顯色培養基中，第一基礎培養基的濃度為10～20g/L，第一牛肉粉的濃度為2～4g/L；革蘭氏陽性菌顯色培養基中，第二基礎培養基的濃度為10～20g/L，第二牛肉粉的濃度為1～3g/L，氯化鈉的濃度為1～2g/L。優選地，革蘭氏陰性菌顯色培養基中，第一基礎培養基的濃度為15g/L，第一牛肉粉的濃度為3g/L；革蘭氏陽性菌顯色培養基中，第二基礎培養基的濃度為15g/L，第二牛肉粉的濃度為2g/L，氯化鈉的濃度為1.5g/L。作為優選，革蘭氏陰性菌顯色培養基的pH值為7.0±0.2。作為優選，革蘭氏陽性菌顯色培養基的pH值為6.9±0.2。作為優選，腸球菌金色葡萄球菌共顯色培養基的pH值為7.0±0.2。在本發明提供的實施例中，以重量份計，第一基礎培養基中：瓊脂15份，蛋白胨7份，酵母粉10份，色素1.2份。在本發明提供的實施例中，以重量份計，第二基礎培養基中：瓊脂15份，蛋白胨8份，酵母粉12份，鹽類5份，色素4.4份，增補劑2.0份。在本發明提供的實施例中，以重量份計，腸球菌基礎培養基包括：營養物質40.1份，吐溫801份，顯色劑0.25份，瓊脂15份。該培養基購買于青島海博生物腸球菌顯色培養基。在本發明提供的實施例中，以重量份計，金黃色葡萄球菌基礎培養基包括：營養物質25份，吐溫801份，顯色物質40.3份，瓊脂15份，抑菌成分6份。該培養基購買于青島海博生物腸球菌顯色培養基。作為優選，腸球菌基礎培養基與金黃色葡萄球菌基礎培養基的質量比為(10～15)：(1～5)。優選地，腸球菌基礎培養基與金黃色葡萄球菌基礎培養基的質量比為(11～12)：(4～5)。作為優選，奶牛乳房炎檢測試劑盒還包括三分格培養皿。本發明提供了一種奶牛乳房炎檢測試劑盒。該奶牛乳房炎檢測試劑盒包括：革蘭氏陰性菌顯色培養基、革蘭氏陽性菌顯色培養基和腸球菌金色葡萄球菌共顯色培養基；革蘭氏陰性菌顯色培養基包括第一基礎培養基和第一牛肉粉基；革蘭氏陽性菌顯色培養基包括第二基礎培養基、第二牛肉粉和氯化鈉；腸球菌金色葡萄球菌共顯色培養基包括腸球菌基礎培養基和金黃色葡萄球菌基礎培養基。本發明具有如下有益效果：1、本發明提供的奶牛乳房炎檢測試劑盒可快速準確檢測隱性型奶牛乳房炎，不需要借助特殊儀器，肉眼就可以直接判斷結果，技術人員很容易掌握，操作簡便，18h～24h內可出結果，同時可以批量檢測，成本低；2、本發明提供的奶牛乳房炎檢測試劑盒中，革蘭氏陰性菌顯色培養基和革蘭氏陽性菌顯色培養基經過改良后，可顯著促進細菌的生長，可縮短檢測時間；3、腸球菌金色葡萄球菌共顯色培養基中，腸球菌基礎培養基與金黃色葡萄球菌基礎培養基按特定比例組合后，可同時檢測腸球菌和金黃色葡萄球菌。附圖說明圖1示本發明制備的包括乳腺炎革蘭氏陰性菌顯色培養基、乳腺炎革蘭氏陽性菌顯色培養基和腸球菌金黃色葡萄球共顯色培養基的三分格培養皿；圖2示采用本發明培養基對奶牛乳房炎的病菌檢測結果；圖3示采用本發明培養基檢測飛鶴乳液牧場采集的乳液的檢測結果；圖4示本發明革蘭氏陰性菌顯色培養基與改良前的檢測效果的比較；圖5示本發明革蘭氏陽性菌顯色培養基與改良前的檢測效果的比較；圖6示本發明腸球菌和金色葡萄球菌共顯色培養基的檢測效果。具體實施方式本發明公開了一種奶牛乳房炎檢測試劑盒，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。術語解釋：1、奶牛乳房炎奶牛乳房在產乳過程中受到機械性刺激、病原微生物浸入及化學物理性損傷所引起的乳房病理變化，分為漿液性乳房炎、纖維素性卡他乳房炎、化膿性乳房炎、出血性乳房炎、壞疽性乳房炎和隱性乳房炎。2、病原體感染由寄生蟲或微生物引起的感染，目前為止，人們已從奶牛乳腺組織中分離出了150種病原微生物，最常見的有23種，其中細菌14種，支原體2種，真菌和病毒7種。其中發病率最高的是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌，近年來支原體、真菌引起的乳房炎發病率逐年上升。3、微生物培養基供微生物生長繁殖的營養基質。分為液體培養基和固體培養基。一般，在液體培養基加入瓊脂來制得瓊脂固體培養基。培養基有不同的配方一般都含有碳源、氮源和無機鹽。本發明提供的奶牛乳房炎檢測試劑盒中所用培養基原料均可由市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例11.乳腺炎革蘭氏陰性菌顯色培養基配制本發明改良后的革蘭氏陰性菌顯色培養基配方為：15g/L基礎培養基+3g/L牛肉粉。其中，基礎培養基：瓊脂15.0g/L，蛋白胨7g/L，酵母粉10g/L，色素1.2g/L，pH值7.0±0.2，購買于法國科瑪嘉革蘭氏陰性菌培養基。制備方法如下：(1)按上述配方稱取基礎培養基和牛肉粉，溶于1000mL去離子水的潔凈三角瓶中。也可根據需要按照比例擴大或縮小制備培養基的量。(2)加熱至100℃，不停攪拌，使其完全溶解。切勿加熱超過100℃。若使用微波爐加熱，應將培養基加熱沸騰，立即移出，輕輕搖勻，再放入微波爐加熱，觀察小氣泡變為大氣泡，直至完全溶解即可。切勿使培養基溢出。(3)將溶解好的培養基冷卻至45℃～50℃，輕輕混勻，傾注平皿，使其凝固，晾干備用。2.乳腺炎革蘭氏陽性菌顯色培養基配制本發明改良后的革蘭氏陽性菌顯色培養基配方為：15g/L基礎培養基+2g/L牛肉粉+1.5g/L氯化鈉。其中，基礎培養基：瓊脂15.0g/L，蛋白胨8g/L和酵母粉12g/L，鹽類5.0g/L，色素4.4g/L；增補劑：2.0g/L；pH值6.9±0.2，購買于法國科瑪嘉革蘭氏陽性菌培養基。制備方法如下：(1)按上述配方稱取基礎培養基、牛肉粉和氯化鈉，溶于1000mL去離子水的潔凈三角瓶中，充分攪拌混勻。也可根據需要按照比例擴大或縮小制備培養基的量。(2)加熱至100℃，不停攪拌，使其完全溶解。切勿加熱超過100℃。若使用微波爐加熱，應將培養基加熱沸騰，立即移出，輕輕搖勻，再放入微波爐加熱，觀察小氣泡變為大氣泡，直至完全溶解即可。切勿使培養基溢出。(3)將溶解好的培養基冷卻至45℃～50℃，輕輕混勻，傾注平皿，使其凝固，晾干備用。3.腸球菌和金色葡萄球菌共顯色培養基配制(1)腸球菌基礎培養基：營養物質40.1g/L；吐溫801.0g/L；顯色劑0.25g/L；瓊脂15.0g/L；pH值7.0±0.2，購買于青島海博生物腸球菌顯色培養基。(2)金黃色葡萄球菌基礎培養基：營養物質25g/L；吐溫801.0g/L；顯色物質40.3g/L；瓊脂15.0g/L；抑菌成分6.0g/L；pH值7.0±0.2，購買于青島海博生物腸球菌顯色培養基。(3)腸球菌和金色葡萄球菌共顯色培養基配制：250mL培養基：腸球菌培養基11.28g+4.315金黃色葡萄培養基。(2)稱取培養基，水浴加熱溶解于250mL蒸餾水，冷至45-50℃時，傾入無菌平皿，備用。4.制備奶牛乳房炎檢測培養皿將乳腺炎革蘭氏陰性菌顯色培養基、乳腺炎革蘭氏陽性菌顯色培養基和腸球菌金黃色葡萄球共顯色培養基分別倒在90mm的三分格培養皿中，并且標記(圖1)。將制備好的檢測皿用封口膜封好，避光低溫保存(4-8℃)。5.奶牛乳房炎檢測步驟(1)用無菌采乳杯子采集乳液；(2)用無菌棉花棒將乳液均勻涂在培養皿中的培養基上；(3)倒扣培養皿，37℃培養24小時；(4)菌種判斷(參照表1)。表1不同區菌種判斷顏色1區菌種顏色大腸桿菌紅色克雷伯氏菌深藍色變形桿菌棕色暈環假單胞菌奶油狀，半透明白色念珠菌白色，不透明，小菌落2區菌種顏色無乳鏈球菌藍綠色乳房鏈球菌深藍色金黃色葡萄球菌淡紫色帶有淡紫色暈環3區菌種顏色腸球菌紅色至紫色菌落金黃色葡萄球菌淡藍色至藍色(5)圖2為檢測結果。通過本方法檢測到6種引起奶牛乳房炎的病菌。分別是大腸桿菌(紅色)、克雷伯氏菌(深藍)、變形桿菌(棕色暈環)、無乳鏈球菌(藍綠)、乳房鏈球菌(深藍)、腸球菌(紫色)。(6)本方法與體細胞計數儀比較從飛鶴乳液牧場采集乳液進行檢測。試驗結果如下：體細胞檢測儀顯示奶液中細胞數量為60萬個/mL，奶牛有乳房炎感染。本方法檢測，經過乳液涂板，培養，檢測到細菌4種(圖3)。克雷伯氏菌(深藍)、無乳鏈球菌(藍綠)、乳房鏈球菌(深藍)、腸球菌(紫色)。通過比較發現，本方法能簡便、快捷的檢測出奶牛乳房炎引起的致病菌類型，為精確治療乳房炎奠定了基礎。(7)本方法革蘭氏陰性菌顯色培養基與改良前比較將采集新鮮牛奶均勻涂在兩種培養板上，倒置于37℃培養箱中，培養24小時。一種培養板采用改良前的基礎培養基(瓊脂15.0g/L，蛋白胨和酵母粉17.0g/L，色素1.2g/L，pH值7.0±0.2)，另一種培養板采用本發明改良后的革蘭氏陰性菌培養基。試驗結果見圖4、表2。通過上述試驗結果可以看出，革蘭氏陰性菌區域改良后，紅色大腸桿菌生長明顯。表2改良前后革蘭氏陰性菌顯色培養基的比較(8)本方法革蘭氏陽性菌顯色培養基與改良前比較將采集新鮮牛奶均勻涂在兩種培養板上，倒置于37℃培養箱中，培養24小時。一種培養板采用改良前的基礎培養基(瓊脂15.0g/L，蛋白胨和酵母粉20.0g/L，鹽類5.0g/L，色素4.4g/L；增補劑：2.0g/L；pH值6.9±0.2)，另一種培養板采用本發明改良后的革蘭氏陽性菌培養基。試驗結果見圖5、表3。通過上述試驗結果可以看出，革蘭氏陽性菌區域改良后，淡紫色金色葡萄球菌生長明顯。表3改良前后革蘭氏陽性菌顯色培養基的比較(9)腸球菌和金色葡萄球菌共顯色培養基的檢測效果將采集新鮮牛奶均勻涂在培養板(本發明腸球菌和金色葡萄球菌共顯色培養基)上，倒置于37℃培養箱中，培養24小時。試驗結果如圖6。由圖6可以看出，本發明腸球菌和金色葡萄球菌共顯色培養基可同時檢測腸球菌和金黃色葡萄球菌，其中，淡紫色菌落為腸球菌，淡藍色或藍色菌落為金黃色葡萄球菌。注意事項：保證涂板使用棉花棒為無菌。請在光線明亮地方判斷菌落顏色。請將產品低溫(4℃)避光保存。實施例21.乳腺炎革蘭氏陰性菌顯色培養基配制本發明改良后的革蘭氏陰性菌顯色培養基配方為：10g/L基礎培養基+4g/L牛肉粉。其中，基礎培養基與實施例1革蘭氏陰性菌顯色培養基中的基礎培養基相同。制備方法同實施例1。2.乳腺炎革蘭氏陽性菌顯色培養基配制本發明改良后的革蘭氏陽性菌顯色培養基配方為：10g/L基礎培養基+3g/L牛肉粉+1g/L氯化鈉。其中，基礎培養基與實施例1革蘭氏陽性菌顯色培養基中的基礎培養基相同。制備方法同實施例1。3.腸球菌和金色葡萄球菌共顯色培養基配制配方與制備方法同實施例1。4.制備奶牛乳房炎檢測培養皿將乳腺炎革蘭氏陰性菌顯色培養基、乳腺炎革蘭氏陽性菌顯色培養基和腸球菌金黃色葡萄球共顯色培養基分別倒在90mm的三分格培養皿中，并且標記。將制備好的檢測皿用封口膜封好，避光低溫保存(4-8℃)。5.奶牛乳房炎檢測步驟(1)用無菌采乳杯子采集乳液；(2)用無菌棉花棒將乳液均勻涂在培養皿中的培養基上；(3)倒扣培養皿，37℃培養24小時；(4)菌種判斷(參照表1)。(5)試驗結果見表4、5。表4本發明革蘭氏陰性菌顯色培養基檢測結果表5本發明革蘭氏陽性菌顯色培養基檢測結果試驗結果顯示，本實施例革蘭氏陰性菌顯色培養基上紅色大腸桿菌生長明顯，本實施例革蘭氏陽性菌顯色培養基上淡紫色金色葡萄球菌生長明顯。實施例31.乳腺炎革蘭氏陰性菌顯色培養基配制本發明改良后的革蘭氏陰性菌顯色培養基配方為：20g/L基礎培養基+2g/L牛肉粉。其中，基礎培養基與實施例1革蘭氏陰性菌顯色培養基中的基礎培養基相同。制備方法同實施例1。2.乳腺炎革蘭氏陽性菌顯色培養基配制本發明改良后的革蘭氏陽性菌顯色培養基配方為：20g/L基礎培養基+1g/L牛肉粉+2g/L氯化鈉。其中，基礎培養基與實施例1革蘭氏陽性菌顯色培養基中的基礎培養基相同。制備方法同實施例1。3.腸球菌和金色葡萄球菌共顯色培養基配制配方與制備方法同實施例1。4.制備奶牛乳房炎檢測培養皿將乳腺炎革蘭氏陰性菌顯色培養基、乳腺炎革蘭氏陽性菌顯色培養基和腸球菌金黃色葡萄球共顯色培養基分別倒在90mm的三分格培養皿中，并且標記。將制備好的檢測皿用封口膜封好，避光低溫保存(4-8℃)。5.奶牛乳房炎檢測步驟(1)用無菌采乳杯子采集乳液；(2)用無菌棉花棒將乳液均勻涂在培養皿中的培養基上；(3)倒扣培養皿，37℃培養24小時；(4)菌種判斷(參照表1)。(5)試驗結果見表6、7。表6本發明革蘭氏陰性菌顯色培養基檢測結果表7本發明革蘭氏陽性菌顯色培養基檢測結果試驗結果顯示，本實施例革蘭氏陰性菌顯色培養基上紅色大腸桿菌生長明顯，本實施例革蘭氏陽性菌顯色培養基上淡紫色金色葡萄球菌生長明顯。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3