本發明屬于醫藥領域，涉及一種制備斑馬魚血栓模型的方法。
背景技術：
：心血管疾病(cardiovasculardisease,CVD)是一類心臟或者血管相關的疾病。主要包括冠狀動脈疾病如心絞痛、心肌梗塞，以及其他心血管疾病如中風、高血壓心臟病、外周動脈疾病、靜脈血栓等，是世界范圍內致死和致殘的主要疾病之一。《中國心血管病報告2015》顯示：2014年，中國心血管病死亡率仍居疾病死亡構成的首位，高于腫瘤及其他疾病。其中，農村心血管病死亡率從2009年起超過并持續高于城市水平。心血管病占居民疾病死亡構成在農村為44.60％，在城市為42.51％。血栓形成或栓塞是導致心臟和外周血管事件的最后關鍵環節,是心血管疾病致死和致殘的直接原因。臨床常用的抗血栓藥物如華法林，阿司匹林，氯吡格雷等，長期使用容易導致出血風險。溶栓藥物如鏈激酶(Streptokinase,SK),尿激酶(Urokinase,UK),蚓激酶(Lumbrukinase),尿激酶原(Pro-urokinase),葡激酶(Staphylokinase),重組組織型纖溶酶原激活劑等，均有較好的溶栓效應，但是由于血栓形成后的治療窗口期在0-6小時左右，超過時限，即便是溶栓治療，產生的臨床意義也有限，所以開發新型的安全，高效的抗血栓生成藥物仍然意義重大。通過手術結扎、激光損傷、化學物質誘導等多種方法可以成功地誘導小鼠、大鼠，家兔等高等動物的血栓模型，但由于使用大鼠、小鼠等動物造模時，所需動物數量巨大、實驗操作復雜，周期長、試驗費用高、模型可重復性較差等原因，這類血栓動物模型僅適用于少數藥物的抗血栓效應評價，尚不適用于抗血栓藥物的大規模篩選。和傳統的哺乳類動物模型如嚙齒類大鼠、小鼠相比較，斑馬魚動物模型具有飼養成本低，觀察方便，易于實現高通量篩選，可有效模擬人類疾病病理特征等優點，已經成為公認的理想藥物篩選模型。斑馬魚的血栓形成和凝血機制與人類相似，是很好的研究血栓形成的動物模型。現在已經通過不同的方法建立了多種斑馬魚血栓模型，如JagadeeswaranP研究團隊用氯化鐵、苯肼、或者激光損傷產生了相應的血栓模型。張勇研究小組發表了用苯肼誘導斑馬魚血栓研究的論文，劉可春課題組利用ADP成功的誘導了斑馬魚血栓模型。這些斑馬魚血栓模型或者由于操作繁瑣，需要昂貴的設備，或者模型穩定性較差。技術實現要素：：針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供了一種制備斑馬魚血栓動物模型的新方法。本發明提供了一種制備斑馬魚血栓動物模型的方法，它利用腎上腺素作為血栓誘導劑。具體的，它包括以下步驟：1)挑選發育正常的斑馬魚30條左右移入微孔板，微孔板中事先加入用胚胎培養水配制的一定濃度腎上腺素溶液，藥液加好后加蓋封閉,置于培養箱內培養4-30小時后，吸棄培養水，用移液槍吸取等體積鄰聯茴香胺染色液于微孔板中避光染色15min；或挑選發育正常的斑馬魚30條左右，在其卵黃部位注射一定濃度腎上腺素溶液，注射完成后移入事先加入胚胎培養水的微孔板中，然后加蓋封閉,置于培養箱內培養4-30小時后，吸棄培養水，用移液槍吸取等體積鄰聯茴香胺染色液于微孔板中避光染色15min；2)移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；3)將斑馬魚轉入新的微孔板中，加入DMSO；4)取斑馬魚置載玻片上，于顯微鏡下對斑馬魚進行拍照并保存；5)利用圖像處理軟件(如Image-ProPlus6)計算斑馬魚軀干部及尾部血管染色面積，記錄斑馬魚尾部血管紅細胞的染色面積作為血栓發生程度的指標。其中，所述的斑馬魚幼魚指的是受精后發育3-14天的幼魚。其中，所述的腎上腺素的濃度在2mmol/L～30mmol/L之間。其中，所述的置于培養箱內培養時間為4-30小時。其中，所述的斑馬魚指各種實驗用品系的斑馬魚。其中，斑馬魚胚胎培養用水配方：5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4。其中，鄰聯茴香胺染色液配方：含0.6mg/mL鄰聯茴香胺,0.01moL/L醋酸鈉,0.65％H202,、40％酒精，溶劑為水。0.65％H202是指：體積濃度為0.65％的H202。40％酒精是指：體積濃度為40％酒精。其中，斑馬魚幼魚的選取：按照常規技術飼養斑馬魚，收集斑馬魚受精卵，受精卵進行消毒和清洗后,移入斑馬魚胚胎培養用水中(斑馬魚胚胎培養用水配方：5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4),28℃下控光培養。在斑馬魚發育至5dpf,在倒置顯微鏡下挑選發育正常的斑馬魚幼魚。優選的，本發明動物模型的制備方法，包括以下步驟：挑選健康性成熟的斑馬魚,按雌雄1∶2的比例放入交配缸內,次日清晨獲得胚胎，用胚胎培養水進行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培養箱，每日更換胚胎培養水兩次，在斑馬魚發育至5dpf時，在體視顯微鏡下挑選發育正常的斑馬魚幼魚進行實驗，挑選發育正常的斑馬魚30條左右移入6孔板，6孔板中事先加入用胚胎培養水配制的濃度為4mmol/mL腎上腺素溶液，藥液加好后置于培養箱(28℃)內培養8小時后，吸棄培養水，用移液槍吸取等體積鄰聯茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯茴香胺,0.01moL/L醋酸鈉,0.65％,H202,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑馬魚置載玻片上，于顯微鏡下對斑馬魚進行拍照并保存；利用圖像處理軟件計算斑馬魚軀干部及尾部血管染色面積。進一步優選的，本發明動物模型的制備方法，包括以下步驟：挑選健康性成熟的斑馬魚,按雌雄1∶2的比例放入交配缸內,次日清晨獲得胚胎，用胚胎培養水進行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培養箱，每日更換胚胎培養水兩次，在斑馬魚發育至5dpf時，在體視顯微鏡下挑選發育正常的斑馬魚幼魚進行實驗，空白對照組、模型對照組、陽性藥組各挑選發育正常的斑馬魚幼魚30條移入6孔板，6孔板中除空白對照組外均加入用胚胎培養水配制的濃度為4mmol/mL腎上腺素溶液，空白對照組僅加入胚胎培養用水，陽性藥組加入Warfarin至終濃度為300μmol/L，藥液加好后置于28℃培養箱內培養8小時后，吸棄培養水，用移液槍吸取等體積鄰聯茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯茴香胺,0.01moL/L醋酸鈉,0.65％,H202,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑馬魚置載玻片上，于顯微鏡下對斑馬魚進行拍照并保存；利用圖像處理軟件計算斑馬魚軀干部及尾部血管染色面積，血栓增加率和血栓抑制率的計算方法為：血栓增加率％＝模型對照組斑塊染色面積*100/空白對照組斑塊染色面積；血栓抑制率％＝(模型對照組斑塊染色面積-陽性藥組斑塊染色面積)*100/模型對照組斑塊染色面積，其中，空白對照組溶液的配制：使用去離子水配制含5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4，其中，陽性藥組溶液的配制：使用去離子水配制含5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4,4mmol/mL腎上腺素，300μmol/LWarfarin。本發明的另一個目的在于提供斑馬魚血栓動物模型的使用方法：斑馬魚軀干部及尾部血管染色面積代表了血栓發生的程度，待評價藥物可以在造模前加入，或者與腎上腺素同時加入，或者在腎上腺素加入后2-4小時內加入均可，通過比較空白對照組，模型對照組以及給藥組的染色面積，可以定量的比較藥物的抗血栓生成效應。本發明采用腎上腺素誘導斑馬魚形成血栓動物模型，模型成功率高，穩定，腎上腺素功能眾多，可以較好地模擬臨床病理狀態下血栓的發生，同時操作簡便，可以在微孔板中操作，易于實現高通量篩選。該方法制作過程簡單，成本低廉，可廣泛推廣，模型成功率高，結果穩定，斑馬魚的血栓形成與人類的血栓形成分子機制高度相似，可以用于抗血栓藥物的篩選和藥效評價。顯然，根據本發明的上述內容，在不脫離本發明上述基本技術思想的前提下，還可以做出其他多種形式的修改、替換及變更。對說明書中出現的以下名詞進行解釋、說明：Dpf：Dayspastfertilization斑馬魚胚胎受精后發育的天數DMSO：DimethylSulphoxide二甲基亞砜具體實施方式以下通過實施例形式的具體實施方式，對本
發明內容再做進一步說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。實施例1：本發明動物模型的制備實驗方法：斑馬魚飼養條件為：水溫27.5-28.5℃，電導率450-850μS/cm，pH值6.8-7.2，明/暗周期為14h/10h。挑選健康性成熟的斑馬魚,按雌雄1∶2的比例放入交配缸內,次日清晨獲得胚胎，用胚胎培養水進行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培養箱，每日更換胚胎培養水兩次。在斑馬魚發育至5dpf時，在體視顯微鏡下挑選發育正常的斑馬魚幼魚進行實驗。空白對照組、模型對照組、陽性藥組(Warfarin華法林，>98％，湖北興銀河化工有限公司)各挑選發育正常的斑馬魚幼魚30條移入6孔板，6孔板中除空白對照組外均加入用胚胎培養水配制的濃度為4mmol/mL腎上腺素溶液，空白對照組僅加入胚胎培養用水，陽性藥組加入Warfarin至終濃度為300μmol/L。藥液加好后置于培養箱(28℃)內培養8小時后，吸棄培養水，用移液槍吸取等體積鄰聯茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯茴香胺,0.01moL/L醋酸鈉,0.65％,H202,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑馬魚置載玻片上，于顯微鏡下對斑馬魚進行拍照并保存；利用圖像處理軟件(如Image-ProPlus6)計算斑馬魚軀干部及尾部血管染色面積。血栓增加率和血栓抑制率的計算方法為：血栓增加率％＝模型對照組斑塊染色面積*100/空白對照組斑塊染色面積；血栓抑制率％＝(模型對照組斑塊染色面積-陽性藥組斑塊染色面積)*100/模型對照組斑塊染色面積。其中，空白對照組溶液的配制：使用去離子水配制含5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4，其中，陽性藥組溶液的配制：使用去離子水配制含5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4,4mmol/mL腎上腺素，300μmol/LWarfarin。其中，4mmol/mL腎上腺素溶液:將腎上腺素溶解于胚胎培養水中使其含5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4，4mmol/mL腎上腺素。實驗結果：表1顯示了華法林對AH誘導的斑馬魚尾部血栓面積影響，從數據可以看出，腎上腺素誘導后，血栓面積是原來面積的685％，華法林處理后，血栓面積大大降低，僅為原來的147％，華法林對腎上腺素誘導的血栓生成抑制率達到78.5％。說明本模型可以有效的誘導血栓發生，陽性藥華法林可以有效地抑制腎上腺素誘導的血栓生成。表1華法林對AH誘導的斑馬魚尾部血栓面積影響(n＝30)尾部血栓面積(像素)血栓增加率％血栓抑制率％CK141.65±182.76100-----AH970.35±459.326850Warfarin207.85±236.2214778.5實施例2：本發明動物模型的制備實驗方法：斑馬魚飼養條件為：水溫27.5-28.5℃，電導率450-850μS/cm，pH值6.8-7.2，明/暗周期為14h/10h。挑選健康性成熟的斑馬魚,按雌雄1∶2的比例放入交配缸內,次日清晨獲得胚胎，用胚胎培養水進行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培養箱，每日更換胚胎培養水兩次。在斑馬魚發育至3dpf時，在體視顯微鏡下挑選發育正常的斑馬魚幼魚進行實驗。空白對照組、模型對照組、陽性藥組(Warfarin，>98％，湖北興銀河化工有限公司)各挑選發育正常的斑馬魚30條左右移入12孔板，12孔板中除空白組外均加入用胚胎培養水配制的濃度為2mmol/mL腎上腺素溶液，空白對照組僅加入胚胎培養用水，陽性藥組加入Warfarin至終濃度為300μmol/L。藥液加好后置于培養箱(28℃)內培養30小時后，吸棄培養水，用移液槍吸取等體積鄰聯茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯茴香胺,0.01moL/L醋酸鈉,0.65％,H202,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑馬魚置載玻片上，于顯微鏡下對斑馬魚進行拍照并保存；利用圖像處理軟件(如Image-ProPlus6)計算斑馬魚軀干部及尾部血管染色面積。實施例3：本發明動物模型的制備實驗方法：斑馬魚飼養條件為：水溫27.5-28.5℃，電導率450-850μS/cm，pH值6.8-7.2，明/暗周期為14h/10h。挑選健康性成熟的斑馬魚,按雌雄1∶2的比例放入交配缸內,次日清晨獲得胚胎，用胚胎培養水進行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培養箱，每日更換胚胎培養水兩次。在斑馬魚發育至14dpf時，在體視顯微鏡下挑選發育正常的斑馬魚幼魚進行實驗。空白對照組、模型對照組、陽性藥組(Warfarin，>98％，湖北興銀河化工有限公司)各挑選發育正常的斑馬魚30條左右移入24孔板，24孔板中除空白組外均加入用胚胎培養水配制的濃度為30mmol/mL腎上腺素溶液，空白對照組僅加入胚胎培養用水，陽性藥組加入Warfarin至終濃度為300μmol/L，。藥液加好后置于培養箱(28℃)內培養4小時后，吸棄培養水，用移液槍吸取等體積鄰聯茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯茴香胺,0.01moL/L醋酸鈉,0.65％,H202,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑馬魚置載玻片上，于顯微鏡下對斑馬魚進行拍照并保存；利用圖像處理軟件(如Image-ProPlus6)計算斑馬魚軀干部及尾部血管染色面積。實施例4、傳統動物模型的制備1.大鼠血栓模型1.1.實驗動物150只SD大鼠,SPF級,年齡8～12w，體重300±209,雌雄不限。飼養條件為室溫20～25℃,光線、通風良好,自由飲水、進食。適應性喂養2周。1.2.實驗試劑3％碘酒消毒，75％的酒精脫碘，0.9％生理鹽水；1.3.試驗設備手術顯微鏡(鎮江中天光學儀器有限責任公司；XTS-6A型)；顯微手術器械(上海醫療器械有限公司；Q/CYAEin-2000)；彩色病理圖像分析儀(日本OLYMpUS；BX50)；顯微鏡攝像頭(日本JVC；TK-C1381)；直柄式電動石膏鋸(浙江醫療器械有限公司)；無水石膏繃帶(浙江義烏捷康醫療用品有限公司；生產許可證2000308號)。1.4.實驗操作實驗大鼠不麻醉，3％碘酒消毒，75％酒精脫碘，消毒范圍為劍突以下至足趾末端，鋪無菌洞巾，行腹股溝處內側切口，長約1cm，分離皮下組織，暴露股動、靜脈和股神經，顯露出長約1.5cm的股靜脈，用同一廠家，同一批號新制12.5mm全齒蚊式血管鉗分三段各鉗夾1次，力量為血管鉗緊1扣，每次持續3s，鉗夾完畢，用1號絲線全層間斷縫合皮膚切口，不放置引流，按同法處理另一側后，行骸人字石膏固定，石膏厚度6層，固定石膏時開窗暴露切口位置，便于觀察局部組織反應情況，切口用酒精紗布包扎。造模后大鼠正常飲水，顆粒飼料喂養，不使用抗菌素。2.苯肼誘導的斑馬魚血栓模型1.1.實驗動物AB系野生型斑馬魚。每次交配準備4～5對成年斑馬魚，平均每對能產200～300個胚胎。在受精后6h(即6hpf，hourspostfertilization)和24hpf對胚胎進行清理(移除已死亡胚胎)，并根據胚胎的發育階段挑選合適的胚胎。1.2.實驗試劑苯肼(阿拉丁)、無水乙醇、鄰聯茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯茴香胺、0.01mol/L醋酸鈉、0.65％H2O2、40％乙醇)；1.3.試驗設備解剖顯微鏡(SMZ645，Nikon公司，日本)，電動聚焦連續變倍熒光顯微鏡(AZlOO，Nikon公司，日本)，12孔板(NestBiotech)。1.4.實驗操作在斑馬魚胚胎發育至2d時，在解剖顯微鏡挑選發育正常的斑馬魚胚胎，將其分到12孔板中，每孔30尾，分別設置血栓誘導劑處理組(0.5μmol/L～8μmol/L)、溶劑對照組(0.1％的酒精)、1個空白對照組(胚胎養殖用水)。之后28℃恒溫培養箱培養1d。用鄰聯茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯茴香胺、0.01mol/L醋酸鈉、0.65％H202、40％乙醇)對血栓誘導劑處理組、溶劑對照組、空白對照組進行染色，整個染色過程需避光操作。移除微孔板中的液體，加入等體積濃度為0.64mmol/L的甲磺酸麻醉斑馬魚，用3％甲基纖維素膠固定于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下觀察各實驗組斑馬魚尾靜脈血栓形成情況。本發明與傳統的模型制備方法相比較，具有以下特點：1.與其他實驗動物模型相比，斑馬魚血栓模型具有檢測快捷，成本低廉，便于抗血栓藥物的高通量篩選的優點。通過研究發現，關于血栓動物模型的研究很多，目前已經利用小鼠，大鼠、小型豬等多種實驗動物，利用不同方法構建了相應的血栓實驗動物模型。血栓模型的造模方法分為以下幾類，第一類是對動物進行物理損傷形成血栓模型，比如光化學反應可導致血管內皮細胞損傷、血小板聚集和血栓形成。Herrmann等采用異硫氰酸熒光素作光敏劑引發光化學反應，使倉鼠面頰部血管的血小板發生聚集等。第二類是通過外界環境刺激或者藥物(如腎上腺素)刺激造成動物情緒變化劇烈，從而導致血栓發生，如長期冷刺激，注射醋酸氫化可的松或者腎上腺素等方法造成血栓模型，其中注射腎上腺素加冰浴刺激是比較廣泛的造模方法，目前使用最多。第三類方法是基于血液流變學特征的改變，通過注射高分子右旋糖苷誘導動物微循環減慢，形成類似血瘀進而形成血栓的動物模型，此模型在日本、韓國也受到關注。在以上模型中，判斷血栓模型是否成功的基本指標包括血液流變學、血小板聚集性、血小板功能、血栓的形成及血栓面積、微循環等以及與此相關的生化因子如血小板活化相關因子，內皮素、細胞黏附分子、炎癥因子等的變化。以上基于小鼠、大鼠等哺乳動物的血栓模型可以很好的模擬人類血栓發生時的病理變化，對于驗證藥物的有效性，了解藥物的作用機制有巨大的促進作用。以上模型的缺點在于使用較多的實驗動物，造模周期較長，實驗開銷相對較多，在探討具體的藥物作用機制方面更具優勢，但對于以藥物活性評測、藥物篩選為目的的實驗則不適用，所以建立快速檢測，成本低廉的血栓實驗動物模型有重要的意義。和傳統的哺乳類動物模型如嚙齒類大鼠、小鼠相比較，斑馬魚動物模型具有許多天然的優勢。首先，斑馬魚體積小，成魚體長僅3-4cm，幼龜體長只有1-2mm，可以使用96孔或者384孔微孔板進行大模規模實驗操作，所以斑馬魚動物模型適合高通量、高內涵自動化分析；斑馬魚飼養成本低，占地空間小，200m2的空間可養殖50000條以上成魚，而且藥物用量少(微克級，為小鼠實驗用藥量的1/100到1/1000)；另外斑馬魚產卵量大，胚胎發育周期短，一對成魚每周可產卵200-400枚，從受精卵到完整的胚胎僅需要24h，受精后60h左右，斑馬魚的心、腦、肝、腎、脾、胰腺、血液和血管等器官均已建成，斑馬魚發育7d之內，胚胎透明，結合熒光標記技術可以在顯微鏡下清晰的觀察到器官的形態變化及功能變化，如心跳、心率、血流、肝臟、腎臟、心包形態上的異常等；斑馬魚基因組與人類相似度達85％，疾病相關的基因和人類的相似度高達99％，可以模擬人類的發病過程，用于藥物篩選可以極大地降低藥物篩選周期及成本，是非常理想的藥物篩選模型。對于成分復雜的中藥來說，分離純化成本極高，而微克級的樣品即可滿足斑馬魚藥物效應的觀察，這對于其它模型來說是很難實現的。同時，斑馬魚作為整體動物模型，能夠反映藥物對于整體動物的作用效果，符合中藥整體性作用的理論特點，比離體的細胞、分子藥物篩選模型更能真實的反映中藥多成分、多靶點的作用模式，能夠有效的防止體外篩選中的漏篩現象，所以斑馬魚藥物篩選模型尤其適用于成分復雜的中藥活性物質的篩選。2.與其他斑馬魚血栓模型相比，基于腎上腺素誘導的模型具有穩定，可重復性強，與人類血栓的形成機制相似度高等優點。目前利用斑馬魚制作血栓動物模型的研究已開展了近十年，也取得了一些進展。已有的研究顯示，斑馬魚的血栓形成和凝血機制與人類相似，在人類中存在的與血栓形成相關的基因在斑馬魚中均存在，功能也完全相似，所以斑馬魚是很好的研究血栓形成的動物模型。JagadeeswaranP研究團隊嘗試用多種方法建立斑馬魚血栓模型，如氯化鐵誘導的血栓模型，苯肼誘導的血栓模型及激光損傷誘導的血栓模型。其中苯肼誘導的血栓模型經進一步的研究證實，苯肼誘導的血栓并不是由于血小板聚集引起的血栓，不能模擬疾病發生時血栓的形成過程，用傳統的抗血栓藥物阿司匹林作用也不能抑制苯肼的誘導作用，國內張勇研究小組發表了用苯肼誘導斑馬魚血栓研究的論文，但該論文未對血栓的組成進一步的檢測，僅僅限于血栓形態學的觀測，所以該血栓模型的有效性仍然值得探討；氯化鐵誘導的血栓模型可以有效模擬人類疾病時血栓的發生，華法林等抗凝藥物也可以對抗氯化鐵誘導的血栓形成，但是該模型中，氯化鐵是用濾紙貼在麻醉后的斑馬魚身體上，依靠藥物的自然擴散作用擴散至血管導致形成血栓，操作十分繁瑣，而且血栓通常在幾十秒內形成，主要是由于氯化鐵引發自由基爆發導致血栓形成，誘發血栓效應太過劇烈，藥物的抗血栓效應難以觀察，無法進行高通量的篩選，所以并不適合藥物的篩選。Jagadeeswaran等用激光誘導的斑馬魚血栓模型同樣是在幾十秒內形成血栓，難以觀察到藥物的作用效果，同時由于該模型需要昂貴的激光器、顯微操作裝置等精密儀器，亦不適用于高通量篩選的需要。劉可春課題組利用ADP成功的誘導了斑馬魚血栓模型，但僅報道了ADP可以誘導血栓形成，血栓的形成證據是通過觀察血小板熒光轉基因斑馬魚(CD41:GFP)背部的熒光亮斑證實的，缺乏血栓形成率等造模關鍵指標，同時也缺乏陽性藥物的驗證實驗，所以該斑馬魚血栓模型的穩定性仍需要進一步的驗證。我們前期利用ADP誘導斑馬魚血栓模型的實驗發現，該模型的血栓成功率很低，ADP濃度較低時，很難誘發血栓形成，而ADP濃度較高時，極易導致斑馬魚的死亡，說明該模型存在不穩定性，我們推測可能的原因是ADP是生物體內能量代謝十分重要的分子，生物體內有豐富的磷酸酯酶可以使ADP分解為AMP或者轉化為ATP,該過程可以極為迅速的進行，所以進入斑馬魚體內的ADP會被快速分解，在血液中難以達到誘發血栓形成的有效濃度，所以導致該模型不太穩定。在以上研究的基礎上，我們嘗試了利用腎上腺素溶液作為誘導劑誘導斑馬魚產生以微循環障礙為特征的血栓動物模型。腎上腺素是非常重要的血小板活化劑，我們的前期實驗證實，腎上腺素溶液可以有效的誘導降低斑馬魚微循環速度，促進斑馬魚血栓的形成，模型穩定，重復性高，利用血小板熒光轉基因斑馬魚Tg(CD41:GFP)可以在顯微鏡下觀察到明顯的血小板聚集，誘導的血栓主要位于斑馬魚尾部靜脈血管，血栓誘導率可高達90％以上。當前第1頁1 2 3