本發明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。

背景技術：

痛風(gouty)，又稱痛風性關節炎(gouty arthritis)，是體內嘌呤代謝紊亂所致的疾病，表現為血中尿酸過多，易于使尿酸鹽(MSU)在關節等組織析出結晶。痛風的急性發作是由于沉積在關節的MSU引起中性粒細胞局部浸潤和炎性反應。

西藥在痛風急性發作期選用三種藥：秋水仙堿、非甾體抗炎藥和腎上腺皮質激素。秋水仙堿的作用機制是與中性粒細胞的微管蛋白結合，從而妨礙粒細胞的活動，抑制粒細胞浸潤。非甾體抗炎藥如吲哚美辛，抑制環氧酶(COX)活性而發揮抗炎作用，以及選擇性COX2抑制藥。它們雖然消炎止痛作用快，但毒副作用也相當明顯，如秋水仙堿的有效劑量與產生腹瀉等胃腸道癥狀的劑量相近，非甾體抗炎藥在有活動性消化性潰瘍、胃腸道出血情況下絕對禁用，而保泰松用藥短至3周也可致嚴重的粒細胞減少癥或再生障礙性貧血。

從天然產物中尋找化合物或先導化合物并進行結構修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價值。

本發明涉及的化合物I是一個2009年發表(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的化合物，我們對化合物I進行了結構修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗抗急性痛風活性進行了評價，其具有抗急性痛風活性。

技術實現要素：

本發明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質量百分數分別為30％和70％。

本發明公開的組合物可以制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。

本發明用尿酸鈉(MSU)致人血管內皮細胞(HUVEC)損傷的急性痛風模型評價顯示，本發明組合物對MSU致HUVEC損傷具有保護作用，并抑制ICAM-1表達，可用于制備治療急性痛風炎癥藥物。本發明的目的在于提供本發明組合物在醫學中的新用途，具體地說是涉及本發明組合物在制備治療急性痛風藥物中的應用。

本發明的目的是通過以下的技術方案來實現的：

現代醫學病理研究說明，痛風性關節炎是MSU引起中性粒細胞局部浸潤和炎性反應，急性痛風產生的本質是中性粒細胞(PMN)-血管內皮細胞(HUVEC)黏連增強(Terkeltaub R，et al.The murine homolog of the interleukin-8receptorcxcr-2is essential for the occurrence of neutrophilic inflammation in air pouch model of acute urate crystal-induced gouty synovitis.Arthritis Rheum,1998,41(5):900-909.)，HUVEC損傷，其分子生物學基礎在于PMN與HUVEC表面黏附分子的相互作用(FujiwaraY,et al.Interleukin-8stimulates leukocyte migration across amonolayer of cultured rabbit NF-α,IL-1β,IL-8,and IL-1rain Monosodium Urate Crystal induced rabbit arthritis.Labinvest,19998,78(5):559-569.)，其中細胞間黏附分子-1(ICAM-1)與粘附功能關系最密切，是急性痛風炎癥的重要指標之一(張春，唐怡，劉軍，等.痛風靈方對尿酸鈉致大鼠模型關節軟組織ICAM-1表達的影響，重慶醫學，2002,31(12)：1211-1213.)。

因此，針對急性痛風MSU致HUVEC損傷，ICAM-1表達增多的病理特征，本發明用MSU致HUVEC損傷的體外急性痛風模型(楊妍華，尹蓮，王明艷，等.尿酸鈉誘導HUVEC損傷的急性痛風模型研究，中華中醫藥學刊，2010,28(3)：592-594.)，評價本發明組合物抗急性痛風炎癥活性。MSU致人血管內皮細胞(HUVEC)損傷的急性痛風模型評價顯示，本發明組合物對MSU致HUVEC損傷具有保護作用，并抑制ICAM-1表達。

有益效果

研究結果表明，用MSU致HUVEC損傷的急性痛風模型評價顯示，本發明組合物可保護MSU致HUVEC損傷，減少細胞凋亡，提高細胞活性，抑制ICAM-1表達，具有抗急性痛風炎癥的活性，本發明組合物可用于制備治療急性痛風炎癥藥物。

以下通過實施例對本發明作進一步詳細的說明，但本發明的保護范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權利要求加以限定。

具體實施方式

實施例1化合物Harrisotone A的制備

化合物Harrisotone A(I)的制備方法參照Sheng Yin等人發表的文獻(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的方法。

實施例2 Harrisotone A的O-溴乙基衍生物(II)的合成

將化合物I(472mg，1.00mmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌3h。3h之后將反應液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然后對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌2次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(602mg，76％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ5.18(s,2H),4.56(s,2H),3.93(d,J＝16.7Hz,4H),3.79(s,2H),3.62(d,J＝0.9Hz,4H),3.15(s,2H),2.48(s,2H),2.41(d,J＝9.4Hz,4H),2.27(s,1H),1.95(s,1H),1.88–1.80(m,8H),1.77(d,J＝15.5Hz,7H),1.68(s,1H),1.61(s,1H),1.51(s,1H),1.25(d,J＝58.1Hz,1H),1.15–0.75(m,6H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.46(s),198.24(s),195.44(s),190.27(s),135.27(s),120.09(s),115.02(s),84.45(s),76.58(s),74.12(s),63.67(s),62.76(s),60.36(s),50.96(s),45.22(s),39.69(s),36.61(s),34.40(s),32.63(s),30.81(d,J＝8.9Hz),28.77(s),25.30(s),24.09(d,J＝19.2Hz),22.77(s),18.20(s).

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₃₄H₅₀Br₃O₆:793.1137；found 793.1134.

實施例3 Harrisotone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物(III)的合成

1、Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的合成

將化合物II(396mg，0.5mmol)溶于22mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(690mg，5.0mmol)，碘化鉀(252mg，1.5mmol)和二乙醇胺(1051mg，10mmol)，混合物加熱回流3h。反應結束后將反應液倒入25mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，收集淡棕色集中洗脫帶即得到Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的棕色固體(324.4mg,75％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.17(s,2H),4.27(s,2H),3.56(d,J＝2.7Hz,4H),3.38(d,J＝83.1Hz,14H),3.08(s,2H),3.04(s,4H),2.76–2.66(m,5H),2.61(s,12H),2.57(s,2H),2.40(s,3H),2.05(s,1H),1.93(s,1H),1.91–1.81(m,8H),1.76(d,J＝15.5Hz,7H),1.68(s,1H),1.61(s,1H),1.51(s,1H),1.28(s,2H),1.18(d,J＝12.0Hz,7H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.46(s),198.23(s),195.44(s),190.26(s),135.27(s),120.08(s),115.02(s),84.44(s),76.58(s),66.89(s),62.74(s),60.37(s),60.13(s),59.31(s),56.85(s),53.89(s),53.08(s),50.95(s),45.22(s),39.68(s),36.61(s),30.80(d,J＝8.9Hz),28.77(s),25.29(s),24.09(d,J＝19.2Hz),22.76(s),18.20(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₄₆H₈₀N₃O₁₂:866.5742；found:866.5737。

Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物

2、Harrisotone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物(III)的合成

合成足夠多的Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物，將Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物(0.433g，0.5mmol)溶于4mL氯仿，逐滴加入氯化亞砜(2.38g，20mmol)，反應物加熱回流2h。將反應物冷卻至室溫，滴加甲醇分解過量的氯化亞砜，減壓濃縮除去溶劑。產物經硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:0.3，v/v)，得到化合物III的淡黃色固體(302.3mg，62％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.14(s,2H),4.22(s,2H),3.68(d,J＝5.8Hz,12H),3.54(d,J＝5.3Hz,4H),3.06(s,2H),3.05(s,2H),3.03–2.68(m,18H),2.54–2.29(m,4H),2.24–2.05(m,1H),1.94(s,1H),1.90(s,1H),1.81(d,J＝5.0Hz,7H),1.71(d,J＝15.5Hz,7H),1.65(s,1H),1.56(s,1H),1.48(s,1H),1.15(d,J＝12.5Hz,7H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.12(s),197.88(s),195.10(s),189.91(s),134.93(s),119.73(s),114.68(s),84.09(s),76.24(s),66.54(s),62.40(s),60.02(s),59.79(s),55.91(s),53.54(s),52.74(s),50.60(s),44.88(s),39.33(d,J＝0.9Hz),36.27(s),30.45(d,J＝8.9Hz),28.43(s),24.94(s),23.75(d,J＝19.2Hz),22.41(s),17.86(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₄₆H₇₄Cl₆N₃O₆:976.3679；found:976.3675。

實施例4 Harrisotone A的O-(二(2-甲硫基乙基))乙基衍生物的合成

制備足夠多的化合物III，將化合物III(0.488g，0.5mmol)溶于15mL乙醇，室溫下加入甲硫醇鈉(2.1g，30mmol)，反應物加熱回流1h。減壓濃縮除去溶劑，所得產物用硅膠柱層析進行純化(石油醚/丙酮100:0.4，v/v)，得到黃色固體物，即化合物IV(0.350g，67％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.15(s,2H),4.23(s,2H),3.54(d,J＝11.2Hz,4H),3.41(s,2H),3.06(s,2H),3.01–2.51(m,29H),2.37(s,3H),2.26–1.99(m,21H),1.90(s,1H),1.85–1.72(m,8H),1.70(s,6H),1.65(s,1H),1.55(d,J＝13.0Hz,2H),1.48(s,1H),1.41(s,1H),1.14(s,6H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.26(s),198.02(s),195.24(s),190.05(s),135.07(s),119.87(s),114.82(s),84.23(s),76.38(s),66.68(s),62.54(s),60.16(s),59.93(s),53.68(s),52.88(s),52.39(s),50.74(s),45.02(s),39.47(s),36.41(s),32.12(s),30.59(d,J＝8.9Hz),28.57(s),25.08(s),23.89(d,J＝19.2Hz),22.55(s),18.00(s),14.74(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₅₂H₉₂N₃O₆S₆:1046.5310；found:1046.5303。

實施例5組合物抗急性痛風炎癥實驗

1、溶液配制

5g尿酸加1000ml蒸餾水煮沸，加5％NaOH溶液調PH 7.4，攪拌，冷卻析晶制成尿酸鈉結晶(MSU)。將制好的MSU 10mg高壓滅菌，加不含血清的DMEM培養液10ml，研磨配成1mg/ml的DMEM溶液。實驗時，此溶液再加DMEM培養液配成不同濃度DMEM的MSU溶液。

組合物的制備：將研磨之后過200目網的30mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網的70mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。

組合物、化合物III或者化合物IV 2.5mg，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，DMSO終濃度<0.02％，再加無血清的DMEM培養液，配制成濃度25ug/ml。

2、血管內皮細胞的體外培養

人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC株由南京中醫藥大學基礎醫學院提供，細胞經支原體檢測，無支原體污染，細胞經0.25％胰蛋白酶消化，含10％小牛血清的DMEM培養液中和，離心(1000r/min×6min)，去上清液，加含10％小牛血清的DMEM培養液，移入細胞培養瓶中，放37℃、5％CO₂培養箱中傳代培養。

3、對MSU刺激HUVEC活力的影響

HUVEC在培養瓶中培養，待生長至70％～80％融合時，以0.25％胰蛋白酶消化、離心，10％小牛血清DMEM培養液洗滌3次，用10％小牛血清DMEM培養液調成4×10⁴/ml細胞懸液，植入96孔板(每孔200ul)，培養24小時后輕吸出原培養液，進行以下實驗，每組各8孔，具體分組及加液如下：對照組(200ul DMEM培養液)、模型組(100ug/ml MSU溶液)、干預組(100ug/ml MSU溶液+25ug/ml的組合物或者化合物)，加液后繼續放37℃、5％CO₂培養箱中培養24小時，收集上清液，剩余的HUVEC用于測定細胞活性，每孔再加5mg/ml MTT液20ul，繼續放37℃、5％CO₂培養箱中培養4小時后，棄MTT液，加入二甲基亞砜200ul溶解，震蕩，于酶標儀讀取吸光度值，波長490nm。

數據統計學處理，細胞活力(％)＝實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100％，結果見表1。

與對照組相比，模型組細胞活力顯著減小(P<0.05)，組合物干預后細胞活力顯著提高(P<0.05)，并強于對照組，而化合物III和化合物IV無此活性。

表1組合物對MSU刺激的血管內皮細胞活力的影響

注：與模型組相比，*P<0.05；與對照組相比，^△P<0.05

4對ICAM-1表達影響

將處于對數生長期的HUVEC用0.25％的胰蛋白酶消化，輕輕吹打，制成細胞懸液，調整細胞密度為5×10⁹/L，接種于細胞培養瓶中。待細胞長滿后(約24h)，棄去上清液，分為下列組：對照組、模型組(100ug/ml MSU溶液)、干預組(100ug/ml MSU溶液+25ug/ml組合物或者化合物)，繼續培養24小時，PBS收集細胞，離心去上清，加入CD54單克隆抗體，30min后，PBS洗滌，重懸細胞，應用流式細胞儀檢測其陽性細胞百分率(n＝10000)，重復3次，結果見表2。

表2組合物對MSU刺激的血管內皮細胞ICAM-1表達的影響

注：與模型組相比，*P<0.05；與對照組相比，^△P<0.05

結果顯示，空白組HUVEC幾乎無ICAM-1表達，模型組ICAM-1的表達最高，與模型組相比，組合物對ICAM-1的表達有顯著的抑制作用，而化合物III和化合物IV無顯著的抑制作用。

結論：用MSU致HUVEC損傷的急性痛風模型評價顯示，組合物可保護MSU致HUVEC損傷，減少細胞凋亡，提高細胞活性，抑制ICAM-1表達，具有抗急性痛風炎癥的活性，組合物可用于制備治療急性痛風炎癥藥物。而化合物III和化合物IV不能保護MSU致HUVEC損傷，不能減少細胞凋亡，不能提高細胞活性，不能抑制ICAM-1表達，不具有抗急性痛風炎癥的活性，不能用于制備治療急性痛風炎癥藥物。

實施例6本發明所涉及組合物片劑的制備

取2克組合物，加入制備片劑的常規輔料18克，混勻，常規壓片機制成100片。

實施例7本發明所涉及組合物膠囊的制備

取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。