本發明屬于腦靶向載體技術領域，具體涉及一種親水小分子腦靶向二級遞送載藥體及其制備方法。

背景技術：

中樞神經系統疾病是造成健康生命損失最高的疾病，而治療其疾病最大的困難就是藥物難以通過血腦屏障。雖然多數藥物的分子量小于500Da，但實際上只有少于2％的小分子藥物可以通過血腦屏障。大多數親水小分子藥物很難通過血腦屏障，因為小分子親水藥物本身極性強，組織滲透性差，腎臟濾過率高，體內分布不理想；如與血漿蛋白結合，可進一步降低血腦屏障通透率和自身藥物活性。為了達到理想的藥效，往往需要提高藥物劑量，導致毒性反應增強。

以γ-羥丁酸鈉作為親水小分子中樞神經藥物代表，γ-羥丁酸鈉為白色微細結晶，易溶于水，水溶液穩定，系GABA的中間代謝產物，可模擬GABA產生似生理性睡眠，因而臨床上作為鎮靜類麻醉藥物。與其他麻醉藥不同，γ-羥丁酸鈉不影響腦血流量，不增加顱內壓，對缺血器官有保護作用；對循環無抑制作用，注射后脈搏有力，血壓不降低，心排量無變化或稍增加，可增加心肌對缺氧的耐受力，擴張外周血管，毛細血管充盈良好；對呼吸抑制作用小，不抑制呼吸中樞對CO₂變化的反應，臨床常規劑量使潮氣量稍有增加，呼吸頻率稍減慢，每分鐘通氣量不變或略增加；能抑制咽喉反射，使下頜松弛，輔助表面麻醉后可施行保留呼吸的氣管內插管、異物取出；在體內進行氨基轉換，進入三羧酸循環，降解成水和CO₂經腎和肺排出，并產生能量，對肝、腎無毒性作用，安全范圍大，即使黃疸患者也可選用。然而，γ-羥丁酸鈉由于脂溶性差，血腦屏障通透率低，為達到充分鎮靜，全麻誘導靜注量極大，為疏水鎮靜藥丙泊酚的30-40倍，依托咪酯的200-300倍，從而使蘇醒時間延長，導致該藥在臨床麻醉領域已經基本被淘汰。但作為睡眠輔助的口服長效藥物，該藥的鎮靜效果卻不足以維持一夜，需要夜間加服藥第二次藥物，如一次服用量過大，會導致中毒反應。

為此新型γ-羥丁酸鈉制劑的研究方興未艾，國外相關發明專利大多于近3年授權，主要用于治療發作性睡病患者的日間嗜睡和減少猝倒發作次數。其改良策略包括三種類型：1.基于配伍的基礎改造：(1)將γ-羥丁酸與羧酸轉運體抑制劑(如丙戊酸鈉、雙氯芬酸、布洛芬)復合使用，以減少γ-羥丁酸使用量(US9486426B2)。(2)制備γ-羥丁酸的鈉、鉀、鎂、鈣鹽的混合物減少單純鈉鹽對高血壓、心腎疾病、中風的風險(US9132107B2)。(3)通過添加藥用輔料以提高γ-羥丁酸及鹽的穩定性、抗菌性等(WO2014096984，US8952062B2)。2.基于交聯的結構改造：制備γ-羥丁酸氘化類似物，或與生物相容性分子(如碳水化合物、氨基酸、磷脂、脂肪酸、烷基等)發生酯化、酰化、成環、聚合等反應，制成γ-羥丁酸前藥，以延長藥物作用時間(US8778301B2、US9309182B2、CN103370289B)。3.基于載體的改造：(1)制備pH值觸發藥物，使藥物在十二指腸、結腸等不同部位特異性快速釋放，以延長藥物作用時間(US8598191B2)。(2)制備高劑量水溶性和吸濕性藥物的控釋劑，延長藥物作用時間(CN102917697B)。(3)制備高濃度γ-羥丁酸鈉片劑，可達到與口服水劑類似的生物等效性(US8771735B2)。以上改良策略主要著重于提高γ-羥丁酸的穩定性，增強藥效、延長其藥物作用時間，無法實現起效快、血腦屏障通透率高，藥物使用量少、毒副作用小、可控性好等性能，主要適應于患者夜間口服給藥改善睡眠，并不適于靜脈全麻誘導和維持及器官缺血保護，主要原因是藥物血腦屏障通透效率低且無腦靶向功能。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種親水小分子腦靶向二級遞送載藥體及其制備方法，該二級遞送載藥體利用血腦屏障高腦磷脂特異性，采用腦磷脂氫鍵觸發釋放磷脂酰藥物前體，磷脂酰藥物再利用其良好的疏水性和局部濃度梯度透過血腦屏障，實現了藥物從外周循環靶向到血腦屏障釋放的第一級遞送；隨后，磷脂酰藥物再利用其良好的疏水性能在疏水腦實質內滲透，在磷脂酶D的作用下水解釋放小分子藥物，實現了藥物從血腦屏障到腦實質的第二次遞送。

本發明是通過以下技術方案來實現：

本發明公開的一種親水小分子腦靶向二級遞送載藥體，由一級遞送載藥外殼和包覆于其內部的二級遞送載藥內芯構成；其中，一級遞送載藥外殼用于將親水小分子從外周血液循環靶向釋放至血腦屏障；二級遞送載藥內芯用于將親水小分子從血腦屏障釋放至腦實質。

所述二級遞送載藥內芯是利用磷脂酶D堿基轉移反應將親水性小分子與卵磷脂反應生成的磷脂酰藥物前體；或者采用其他反應方式使親水小分子與腦磷脂等磷脂形式交聯。

所述一級遞送載藥外殼是利用改性直鏈淀粉包裹磷脂酰藥物前體，生成螺旋復合物，該螺旋復合物內側疏水，外側親水。

所述親水小分子為能夠作用于中樞神經系統的親水小分子藥物。

所述親水小分子藥物包括鎮靜藥物、抗癲癇藥物、抗腫瘤藥物、抗菌藥物、腦血管藥物及解熱鎮痛藥物等中樞用藥。

所述親水小分子藥物包括鎮靜藥物γ-羥丁酸鈉、抗癲癇藥物丙戊酸鈉、抗腫瘤藥物環磷酰胺、抗菌藥物阿莫西林、腦血管藥物鹽酸法舒地爾、解熱鎮痛藥物雙氯芬酸鈉等中樞用藥。

本發明還公開了一種親水小分子腦靶向二級遞送載藥體的制備方法，包括以下步驟：

1)磷脂酰藥物前體的制備

將親水小分子溶解于水相，卵磷脂溶解于油相，將水油兩相混合后加入磷脂酶D催化反應合成磷脂酰藥物前體；

2)酯化直鏈淀粉螺旋載體的制備

將直鏈淀粉溶于DMSO溶液中，添加酸酐和催化劑，反應生成酯化直鏈淀粉，用無水乙醇析出酯化直鏈淀粉，抽濾洗滌并烘干，研磨成粉備用；

3)親水小分子腦靶向二級遞送載藥體的制備

將酯化直鏈淀粉溶于PBS溶液中，添加磷脂酰藥物前體，充分攪拌使酯化直鏈淀粉負載磷脂酰藥物前體，用硅膠柱柱層析法分離出未包裹的磷脂酰藥物前體，制得親水小分子腦靶向二級遞送載藥體。

所述催化劑為1-甲基咪唑。

所述親水小分子為鎮靜藥物、抗癲癇藥物、抗腫瘤藥物、抗菌藥物、腦血管藥物及解熱鎮痛藥物等中樞用藥。

所述親水小分子藥物包括鎮靜藥物γ-羥丁酸鈉、抗癲癇藥物丙戊酸鈉、抗腫瘤藥物環磷酰胺、抗菌藥物阿莫西林、腦血管藥物鹽酸法舒地爾、解熱鎮痛藥物雙氯芬酸鈉。

與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：

針對血腦屏障和腦實質不同的組織特征，本發明公開的親水小分子腦靶向二級遞送載藥體，由一級遞送載藥外殼和包覆于其內部的二級遞送載藥內芯構成。突破以往添加靶頭的受體介導內吞方式，以簡潔有效的二級遞送方式，將親水小分子藥物遞送到腦實質。首先，利用血腦屏障高腦磷脂特異性，采用腦磷脂氫鍵觸發釋放磷脂酰藥物前體，實現了親水小分子藥物從外周循環靶向到血腦屏障釋放的第一級遞送；隨后，磷脂酰藥物再利用其良好的疏水性能在疏水腦實質內滲透，在磷脂酶D的作用下水解釋放親水小分子藥物，實現了親水小分子藥物從血腦屏障到腦實質的第二次遞送。本發明二級遞送載藥體與其他親水小分子藥物制劑相比具有顯著功能優勢：

1、親水小分子藥物包裹在載體螺旋結構當中，避免了親水小分子藥物與血漿蛋白結合，減少了腎臟清除率，提高了有效血藥濃度，減少了藥物使用量和毒性反應。

2、利用血腦屏障觸發、局部高濃度疏水性磷脂酰前體血腦屏障和腦組織滲透、磷脂酶D高效水解三種關鍵技術，提高了腦靶向功能和血腦屏障通透率，減少了藥物使用量和毒性反應。

3、磷脂和淀粉均屬于天然材料，代謝產物安全無毒，具有良好的生物相容性和代謝性能。

附圖說明

圖1.親水小分子腦靶向二級遞送載藥體示意圖；

圖2.磷脂酰γ-羥基丁酸鈉的合成路線；

圖3.磷脂酰γ-羥基丁酸鈉、卵磷脂紅外光譜；

圖4.丙酸酯直鏈淀粉、PHSCP、HSBH2D的紅外光譜圖；

圖5.單次少量注射γ-羥基丁酸鈉、PHSCP、HSBH2D的鎮靜蘇醒實驗：a表示誘導時間、維持時間、蘇醒時間(與游離γ-羥基丁酸鈉和PHSCP比較，^*P<0.05)；b代表BIS值誘導期變化；

圖6.HSBH2D被腦磷脂雙分子層觸發釋放PHSCP圖(a)分子模擬，(b)釋放曲線；

圖7.采用Cy5NHS標記親水小分子腦靶向二級遞送載藥體的近紅外小動物成像結果；

圖8.磷脂酶D水解釋放化學式；

圖9.氣相色譜法檢測γ-羥基丁酸鈉的釋放曲線。

具體實施方式

下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。

親水小分子藥物載體的設計難點在于親水環境不漏藥，靜脈注射快速滲透到達腦實質。參見圖1，采用具有良好生物相容性和生物降解性的淀粉和卵磷脂作為原料。利用磷脂酶D堿基轉移特異性將親水小分子酯化成為磷脂酰藥物前體，并用酯化直鏈淀粉納米螺旋載體負載磷脂酰藥物前體，制備成親水小分子腦靶向二級遞送載藥體。由于酯化直鏈淀粉螺旋載體外部羥基具有親水性，親水小分子腦靶向二級遞送載藥體可以均勻分散于親水溶液及血液系統；相對于親水小分子，磷脂酰結構分子量大、疏水性強，使磷脂酰藥物前體疏水性好，可以穩定負載于螺旋載體內部疏水結構，從而使親水小分子腦靶向二級遞送載藥體在親水環境可以穩定負載親水小分子藥物不漏藥。

本發明中，PHSCP(Phosphatidyl Hydrophilic Small molecule Central nervous system Prodrug,PHSCP)表示磷脂酰親水小分子中樞神經系統藥物前體，簡稱磷脂酰藥物前體；HSBH2D(Hydrophilic Small molecule drug brain targeting helix two stages drug delivery system)表示親水小分子藥物腦靶向納米螺旋二級遞送載藥體系，簡稱親水小分子腦靶向二級遞送載藥體。

實施例1

本實驗設計：親水小分子γ-羥丁酸鈉腦靶向納米螺旋二級遞送載藥體系，利用磷脂酶D堿基轉移特異性將親水小分子酯化成磷脂酰γ-羥丁酸鈉，再用酯化直鏈淀粉納米螺旋載體負載磷脂酰藥物前體。

其體內釋放策略為：靜脈注射后，螺旋載體被血腦屏障腦磷脂觸發釋放磷脂酰γ-羥丁酸鈉，磷脂酰γ-羥丁酸鈉利用良好的疏水性和局部濃度梯度快速高效通過血腦屏障，實現載體第一級遞送；磷脂酰γ-羥丁酸鈉利用良好的疏水性可以在疏水腦組織內滲透移動，被廣泛存在于各功能腦區(在海馬、下丘腦、皮質、中腦、紋狀體等腦區內存在大量的磷脂酶D)的磷脂酶D水解釋放親水小分子活性藥物，實現載體第二級遞送。

通過載體的二級遞送最終提高γ-羥丁酸鈉血腦屏障和腦組織滲透率，使腦組織內快速達到有效血藥濃度，降低腎臟濾過率，減少藥物用量，減少劑量相關毒性反應。

1、具體實驗步驟包括：

1)磷脂酰γ-羥基丁酸鈉的制備

參見圖2，利用磷脂酶D的堿基轉移特性，將γ-羥基丁酸鈉羥基與卵磷脂的磷脂酰基團發生堿基轉移酯化反應，生成磷脂酰γ-羥基丁酸鈉。

將γ-羥基丁酸鈉溶解于水相，卵磷脂溶解于油相(γ-羥基丁酸與卵磷脂鈉質量比10-100：1)，將水油兩相在三角瓶中混合(油水體積比1-4：1)，加入磷脂酶D催化反應合成磷脂酰γ-羥基丁酸(磷脂酶D與卵磷脂比例為1U：0.1-1g)，PH4-7，溫度20-37℃，采用薄層層析法取樣動態檢測反應過程。

對合成得到的磷脂酰γ-羥基丁酸鈉進行結構分析，將0.25g磷脂酰γ-羥基丁酸鈉和0.25g卵磷脂分別與0.1g光譜分析級別KBr混合后研磨，并壓成KBr紅外光譜樣品片，采用傅里葉紅外光譜分析儀檢測化學鍵變化。

結果如圖3所示，磷脂酰γ-羥基丁酸鈉與卵磷脂有很多相似的特征峰，如1734cm^-1的C＝O特征峰，1242cm^-1與1072cm^-1的P-O特征峰。而磷脂酰γ-羥基丁酸鈉不含有卵磷脂1172cm^-1的N-C特征峰，含有1578cm^-1的來自γ-羥基丁酸鈉的-COOH特征峰，因此說明我課題組已經成功合成了純度較高的磷脂酰γ-羥基丁酸鈉。

2)酯化直鏈淀粉螺旋載體的制備

將1g直鏈淀粉溶于40-60mlDMSO溶液中，添加0.3-0.5酸酐(乙酸酐、丙酸肝、丁酸酐)和0.2ml催化劑1-甲基咪唑，反應生成酯化直鏈淀粉，用無水乙醇析出酯化直鏈淀粉，抽濾洗滌并烘干，研磨成粉備用；

3)親水小分子腦靶向二級遞送載藥體的制備

將50-100mg酯化直鏈淀粉溶于5-10mLPBS溶液中，添加10-30mg磷脂酰藥物前體，充分攪拌使酯化直鏈淀粉負載磷脂酰藥物前體，用硅膠柱柱層析法分離出未包裹的磷脂酰藥物前體，制得親水小分子腦靶向二級遞送載藥體。

2、對制得的親水小分子腦靶向二級遞送載藥體進行結構分析：

將0.25gγ-羥基丁酸鈉腦靶向二級遞送載藥體、磷脂酰γ-羥基丁酸鈉、酯化直鏈淀粉分別與0.1g光譜分析級別KBr混合后研磨，并壓成KBr紅外光譜樣品片，采用傅里葉紅外光譜分析儀檢測化學鍵變化。γ-羥基丁酸鈉腦靶向納米螺旋二級遞送載藥體系的紅外光譜圖參見圖4，HSBH2D含有PHSCP的特征峰，如1734cm^-1的C＝O特征峰、1242cm^-1和1072cm^-1的P-O特征峰、1578cm^-1來自γ-羥基丁酸鈉的-COOH特征峰；HSBH2D含有丙酸酯直鏈淀粉的特征峰，如2800cm^-1的-OH特征峰，說明本發明已經成功合成了純度較高的γ-羥基丁酸鈉腦靶向納米螺旋二級遞送載藥體系HSBH2D。

實施例2

γ-羥基丁酸鈉腦靶向二級遞送載藥體系藥學性質分析

1、HSBH2D可以實現家兔快速鎮靜蘇醒

將18只雄性家兔隨機分為3組，分別從家兔耳緣靜脈單次推注50mg/kgγ-羥基丁酸鈉當量(相當于誘導量的1/4)的游離γ-羥基丁酸鈉、PHSCP、HSBH2D三種劑型，用BIS監測家兔鎮靜情況，以BIS值≤85定義鎮靜，以BIS≥90定義清醒，比較誘導(BIS值從清醒值降到85所用時間)、維持(BIS值維持在85的時間)、蘇醒時間(BIS值從85到90所用時間)。參見圖5，a表示誘導時間、維持時間、蘇醒時間(與游離γ-羥基丁酸鈉和PHSCP比較，^*P<0.05)；b代表BIS值誘導期變化。可以看出，與游離γ-羥基丁酸鈉和PHSCP比較，HSBH2D可顯著縮短誘導、維持、蘇醒時間(^*P<0.05)，同時提供有效麻醉維持深度，使得麻醉可控性增強。

2、HSBH2D被腦磷脂雙分子層觸發釋放PHSCP

參見圖6，如圖6中a所示，采用在GROMOS 53A6力場下，HSBH2D放入10nm×10nm×12nm腦磷脂脂質雙分子層模型，平衡200ns后HSBH2D被腦磷脂觸發釋放。在被動血腦屏障模型中，十二烷配制的2％豬腦極性脂溶液(Avanti Polar Lipid,Inc.,USA)常作為簡易的血腦屏障，該豬腦極性脂包括33％腦磷脂和其他磷脂。將5μL 2％豬腦極性脂溶液平鋪在普通96孔板底部，再滴加150μL 25μg/mL的HSBH2D，同時制作多孔，分別在5、10、15、20、25、30min時間點取上清液，HPLC測PHSCP含量，繪制釋放曲線。如圖6中b所示，HSBH2DB可被血腦屏障快速觸發釋放PHSCP。

3、近紅外小動物成像實驗：

采用腦磷脂與水溶性菁染料琥珀酰亞胺酯Cy5NHS反應生成Cy5NHS標記的磷脂酰藥物前體，負載于丙酸酯直鏈淀粉，形成Cy5NHS標記的親水小分子腦靶向二級遞送載藥體，通過裸鼠尾靜脈注射0.1mL 50μg/mL Cy3NHS，以等量游離Cy5NHS為對照。

復合X-射線定位和近紅外熒光顯影技術(IVIS luminaⅢ,Caliper,USA)，動態觀察熒光標記在裸鼠體內的分布。如圖7所示，注射10min后，采用軟件扣除對照游離Cy5NHS小鼠的熒光，Cy5NHS標記的親水小分子腦靶向二級遞送載藥體小鼠可以明顯看到腦部的強熒光顯影，說明本發明的親水小分子腦靶向二級遞送載藥體可以實現腦靶向給藥。

4、氣相色譜法檢測γ-羥基丁酸鈉的釋放曲線：

參見圖8，親水小分子腦靶向二級遞送系統之磷脂酶D水解釋放化學式。說明：磷脂酶D可以有效水解磷脂酰γ-羥基丁酸鈉，將γ-羥基丁酸鈉游離出來。

以100mg磷脂酰γ-羥基丁酸鈉為底物，溶解在20ml正己烷與水(V/V＝15:5)的二相溶液，并用磁力攪拌器以200r/min持續攪拌，加入1U色褐鏈霉菌源磷脂酶D，調整反應溫度為37℃10，水相ph值為7.35。每10min取1ml渾濁反應液，離心后取水相樣品，用氣相色譜儀檢測γ-羥基丁酸鈉濃度，計算釋放比例。Sigma的磷脂酶D反應效率很高，20min即可將90％的底物水解，與說明書所述酶效率基本一致。參見圖9，說明磷脂酶D可以高效水解磷脂酰γ-羥基丁酸鈉。