本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)影像技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類(lèi)受體靶向顯像劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

乳腺癌嚴(yán)重威脅著女性的健康與生命，據(jù)2015年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，乳腺癌發(fā)病率居于女性惡性腫瘤首位。早期診斷是治療乳腺癌的關(guān)鍵。1978年，Lippman等人通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出大約70％-80％的乳腺癌患者會(huì)過(guò)度表達(dá)雌激素受體的結(jié)論。而今，雌激素受體的分布和水平是乳腺癌預(yù)后因素關(guān)鍵的項(xiàng)目之一，臨床上根據(jù)雌激素受體的狀況來(lái)決定病人使用抗雌激素類(lèi)藥物的用量。

目前，臨床上主要應(yīng)用病理學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)和定量乳腺癌受體類(lèi)型。這種病理切片的方法需要有創(chuàng)操作來(lái)獲取組織，給病人帶來(lái)了極大的痛苦，并且很難獲取轉(zhuǎn)移灶和復(fù)發(fā)灶的組織，更不能動(dòng)態(tài)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)情況。

在過(guò)去的20多年里，隨著分子影像技術(shù)的不斷發(fā)展，PET顯像技術(shù)在檢測(cè)癌癥中的應(yīng)用日益增多。PET顯像技術(shù)具有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)，多元精準(zhǔn)，在體無(wú)創(chuàng)，快速便捷等優(yōu)勢(shì)，因此PET顯像技術(shù)是實(shí)現(xiàn)乳腺癌早期診斷的理想途徑。

分子影像探針作為PET顯像技術(shù)的核心，決定著PET顯像技術(shù)的發(fā)展。1984年，Kiesewetter等人合成并標(biāo)記了16α-¹⁸F-17β-雌二醇(¹⁸F-FES)，¹⁸F-FES是以對(duì)雌激素受體具有親和力的雌二醇分子為骨架，在其C-17位標(biāo)記¹⁸F得到的。1984年，Kiesewetter等人發(fā)表了¹⁸F-FES的制備方法，并證明了¹⁸F-FES對(duì)雌激素受體蛋白具有很好的相對(duì)結(jié)合能力(RBA)，之后又對(duì)未成熟的大鼠做了生物分布實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大鼠雌激素受體豐富的子宮的攝取明顯高于其他組織和器官。1988年，Mintun等人第一次嘗試對(duì)¹⁸F-FES進(jìn)行臨床研究，13位患者通過(guò)¹⁸F-FES-PET顯像的方式確診為乳腺癌，最重要的是，從顯像圖中可以清晰觀察到轉(zhuǎn)移灶的情況。到目前為止，¹⁸F-FES已經(jīng)成為最成功的雌激素受體顯像劑，并已進(jìn)入臨床II期實(shí)驗(yàn)。但是，¹⁸F-FES也有一些局限性，即由于¹⁸F-FES脂溶性高，主要經(jīng)肝代謝，經(jīng)腎臟排出體外，代謝速率很快，所以很難有效富集于靶組織和器官。

為了改善¹⁸F-FES在體內(nèi)的代謝情況，使其更好的作用于靶向部位，人們合成并標(biāo)記了許多種17β-雌二醇衍生物，作為雌激素受體顯像劑。1990年，Katzenellenbogen等人合成了一系列C-11位C-17被炔基取代的雌二醇類(lèi)似物，分別是17α-炔基-雌二醇，17β- 炔基-雌二醇，11β-甲氧基-雌二醇和11β-乙基-雌二醇。通過(guò)對(duì)各探針進(jìn)行大鼠生物分布實(shí)驗(yàn)，并與¹⁸F-FES的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比得出取代基的引入可以增強(qiáng)17β-雌二醇體內(nèi)攝取的選擇性。2013年，Michel等人提出4-氟-11β-甲氧基-16α-[¹⁸F]氟化雌二醇(4FMFES)在對(duì)雌激素受體陽(yáng)性鼠源乳腺癌(MC7-L1和MC4-L2)腫瘤PET顯像的腫瘤攝取要高于¹⁸F-FES。對(duì)¹⁸F-FES進(jìn)行構(gòu)型改造的例子有很多，但是這些改造都沒(méi)有真正的降低 ¹⁸F-FES的脂溶性，有的甚至使其脂溶性增加，這些性質(zhì)限制了該類(lèi)探針的發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于提供一類(lèi)具有優(yōu)良顯像性能的雌激素受體靶向顯像劑。

本發(fā)明的另有目的在于提供上述受體靶向顯像劑的合成和標(biāo)記方法。

本發(fā)明的再一目的是提供上述受體靶向顯像劑在腫瘤顯像中的應(yīng)用。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一類(lèi)受體靶向顯像劑，其特征在于：該探針具有一個(gè)聚乙二醇短鏈，通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)與靶向雌激素受體的17α-炔雌醇相連接，該顯像劑具體結(jié)構(gòu)通式如下：

一類(lèi)上述受體靶向顯像劑的制備方法，包括如下步驟：

1)將化合物1和對(duì)甲基苯磺酰氯以摩爾比(1-5)：(2.5-15)的比例混合，在三乙胺作用下，得到化合物2；

2)將化合物2與疊氮化鈉以摩爾比(1-5)：(5-1)的比例混合，得到化合物3；

3)將化合物3標(biāo)記¹⁸F，得到化合物4；

4)將化合物4與17α-炔雌醇發(fā)生“點(diǎn)擊”反應(yīng)，得到目標(biāo)標(biāo)記產(chǎn)物化合物5。

其合成與標(biāo)記路線為：

在本發(fā)明中，¹⁸F為放射性顯影作用，¹⁸F也可以替換為其它常規(guī)用于顯象劑的放射性元素，此應(yīng)視為本發(fā)明的等同替換。

本發(fā)明將PEG鏈一端標(biāo)記上¹⁸F，并通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)與對(duì)雌激素受體有高親和力的炔雌醇相連接，得到一個(gè)新型的雌激素受體靶向顯象劑化合物5。從理論上講，這種結(jié)構(gòu)修飾即對(duì)雌激素本身改變不大，又降低其脂溶性，從而降低了肝代謝速率，提高了腫瘤對(duì)放射性藥物的攝取。初步研究結(jié)果表明，雌激素受體靶向顯象劑化合物5具有優(yōu)良的生物性能，包括：對(duì)未成熟大鼠生物分布實(shí)驗(yàn)時(shí)，子宮和卵巢對(duì)化合物5的攝取要明顯高于其他組織和器官對(duì)化合物5的攝取；對(duì)雌激素受體陽(yáng)性的人源乳腺癌(MCF-7)腫瘤PET顯像時(shí)，腫瘤攝取明顯高于肌肉，并且這種攝取可以被抑制；雌激素受體陰性的人源乳腺癌(MDA-MB-231)腫瘤PET顯像時(shí)，發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231腫瘤攝取明顯低于MCF-7腫瘤，這些實(shí)驗(yàn)都充分說(shuō)明化合物5對(duì)雌激素受體具有很高的特異性。另外，化合物5的制備方法簡(jiǎn)單、成本低，有望在臨床上得以推廣應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明的雌激素受體靶向顯像劑，具有雌二醇骨架，同時(shí)具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物分布性質(zhì)，比活度高，靶向性強(qiáng)，制備方法簡(jiǎn)便易行，可用于進(jìn)行雌激素受體陽(yáng)性腫瘤PET顯像。

(2)本發(fā)明受體靶向顯像劑具有優(yōu)良的生物性能。在雌激素受體陽(yáng)性腫瘤中具有較高的攝取，且攝取具有特異性，滿足用作雌激素受體顯像劑的條件，靶與非靶比值高，明顯優(yōu)于已有的¹⁸F-FES。另外，較低的非靶臟器攝取能夠減少不必要的放射性損傷。

附圖說(shuō)明

圖1化合物5(下)及其標(biāo)準(zhǔn)品(上)的高效液相色譜(HPLC)分析圖；

圖2化合物5的細(xì)胞飽和結(jié)合曲線(A)；在5-90min內(nèi)，MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)化合物5的攝取實(shí)驗(yàn)以及在30-90min內(nèi)，被抑制劑抑制后的MCF-7細(xì)胞對(duì)化合物5的攝取(B)；MCF-7細(xì)胞被抑制前后對(duì)化合物5的攝取對(duì)比(C)；MCF-7細(xì)胞與MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)化合物5攝取的對(duì)比(D)。

圖3化合物5在正常未成熟的大鼠體內(nèi)1小時(shí)時(shí)的組織分布情況，不同組織器官攝取值以每克組織百分注射劑量率(％ID/g)的形式表示；

圖4 ¹⁸F-FES在正常未成熟的大鼠體內(nèi)1小時(shí)時(shí)的組織分布情況，不同組織器官攝取值以每克組織百分注射劑量率(％ID/g)的形式表示；

圖5化合物5在荷MCF-7瘤裸鼠體內(nèi)的PET顯像(A)以及腫瘤和肌肉對(duì)化合物5攝取的對(duì)比(B)；腫瘤和肌肉攝取的比值(C)。

圖6化合物5在被雌激素受體抑制劑處理后的MCF-7瘤裸鼠體內(nèi)的PET顯像(A)以及經(jīng)抑制劑處理和未經(jīng)處理實(shí)驗(yàn)中腫瘤攝取值的對(duì)比(B)；

圖7化合物5在荷MDA-MB-231瘤裸鼠體內(nèi)的PET顯像(A)以及該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與MCF-7腫瘤對(duì)化合物5攝取值的對(duì)比(B)。

圖8 ¹⁸F-FES在荷MCF-7瘤裸鼠體內(nèi)的PET顯像(A)以及該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與MCF-7腫瘤對(duì)化合物5攝取值的對(duì)比(B)。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)化合物5的具體實(shí)施方式結(jié)合附圖為本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明和描述。

1.化合物5的制備

1)化合物2的合成：

0℃時(shí)，將1.5g化合物1和1.7mL三乙胺溶解在10mL二氯甲烷中，加入4.77g對(duì)甲基苯磺酰氯，室溫反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用二氯甲烷萃取反應(yīng)液三次，收集有機(jī)相并旋蒸除去溶劑。將產(chǎn)物過(guò)硅膠柱，流動(dòng)相比例為石油醚：乙酸乙酯＝2：1。得到純白色晶體即為化合物2。

2)化合物3的合成：

將0.65g疊氮化鈉完全溶解于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入4.59g化合物2，室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)完成后，用50mL乙酸乙酯溶解，用40mL去離子水洗滌，收集有機(jī)相并旋蒸除去溶劑。產(chǎn)物用硅膠柱純化，流動(dòng)相比例為石油醚：乙酸乙酯＝2：1。得到淺黃色油狀物質(zhì)即為化合物3。

3)化合物4的標(biāo)記：

將¹⁸F^-富集到QMA柱上，再將4mg碳酸鉀和13mg 4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮雙環(huán)[8.8.8]二十六烷溶于1mL溶劑中(乙腈：水＝9；1)，用該溶液將淋洗QMA柱。在100℃時(shí)，用氮吹儀將溶劑吹干，并另加三次無(wú)水乙腈吹干，保證體系無(wú)水。將化合物3溶于0.5mL無(wú)水乙腈加到吹干的¹⁸F^-中，20℃反應(yīng)20min。反應(yīng)產(chǎn)物用C18柱進(jìn)行分離，用1mL四氫呋喃淋洗。得到淺黃色液體。

4)化合物5的標(biāo)記：

將2mg 17α-炔雌醇，2mg二異丙基乙基胺和1mg碘化亞銅分別加入到化合物4的四氫呋喃溶液中，60℃反應(yīng)20min。通過(guò)放射性-HPLC純化，放射化學(xué)純度大于99％。高效液相色譜儀條件為：C18柱(250×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相A相為水，B相35％乙腈，流速4mL/min。

以上述化合物5顯像劑為例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其基本性能如下：

1.化合物5的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

A.MCF-7細(xì)胞的飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)

1)將形成單層貼壁細(xì)胞的孔板(24孔板)取出，小心吸出所有培養(yǎng)基，然后向每個(gè)孔板中加入0.5mL培養(yǎng)基，再吸出以洗去表面死去或脫落的細(xì)胞。這時(shí)將孔板舉起，透過(guò)光線從底部觀察，可看見(jiàn)孔板底部有一層均勻的細(xì)胞膜，以均勻且沒(méi)有明顯脫落的區(qū)域?yàn)楹谩?/p>

2)取適量HPLC純化后的化合物5溶液，用培養(yǎng)基稀釋?zhuān)玫?-100nM的化合物5，將不同濃度的化合物加入到細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，加蓋室溫放置1h。

3)用1mL PBS(pH＝7.4)洗三次，在用1mL氫氧化鈉孵育5-10min。然后用移液器吸頭輕刮板孔底部，使細(xì)胞完全脫離，吸取孔板內(nèi)所有溶液和細(xì)胞于小試管中。用γ計(jì)數(shù)器檢測(cè)每管的放射性。

由圖2A并經(jīng)軟件計(jì)算可知，化合物5的解離常數(shù)Kd為26.54nM，最大結(jié)合量Bmax為1.12×10⁴/細(xì)胞。

B.細(xì)胞攝取及抑制實(shí)驗(yàn)

步驟1)同上訴MCF-7細(xì)胞的飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)步驟1)

2)取適量HPLC純化后的化合物5溶液，用培養(yǎng)基稀釋?zhuān)派湫粤肯♂尀?μCi/mL。

3)首先向抑制組孔板中加入10μL雌二醇溶液(1mg/mL)，然后向所有孔板中分別加入100μL稀釋好的化合物5，加蓋室溫放置5-90min。

步驟4)同上訴MCF-7細(xì)胞的飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)步驟3)。

如圖2B，2C和2D所示，雌激素受體陽(yáng)性的MCF-7的攝取要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雌激素受體陰性的MDA-MB-231細(xì)胞，并且MCF-7細(xì)胞的攝取可以被抑制劑抑制。說(shuō)明化合物5在體外層面對(duì)雌激素受體具有高特異性。

2.化合物5及¹⁸F-FES的正常大鼠生物分布實(shí)驗(yàn)

正常大鼠生物分布實(shí)驗(yàn)選用3-4周齡的雌性SD大鼠。大鼠尾靜脈注射1.85MBq化合物5或者¹⁸F-FES，于注射后1小時(shí)進(jìn)行生物分布實(shí)驗(yàn)。各個(gè)器官對(duì)化合物5的攝取情況如圖3A所示，其中富含雌激素受體的器官子宮和卵巢的攝取要明顯高于其他組織和器官，并且肝的攝取很低。說(shuō)明化合物5在體內(nèi)層面對(duì)雌激素受體具有很強(qiáng)的靶向性。對(duì)于抑制組，首先用氟維司群處理實(shí)驗(yàn)大鼠，然后尾靜脈注射化合物5，從圖3B可以看出，抑制組子宮的吸收明顯低于正常組，說(shuō)明化合物5對(duì)雌激素受體的特異性高。

各個(gè)器官對(duì)¹⁸F-FES的攝取情況如圖4所示，其中子宮和卵巢的攝取略高，肝臟有很高攝取，即非特異性攝取高。相比之下，¹⁸F-FES對(duì)富含雌激素受體的器官的親和性要低于化合物5。

3.化合物5在乳腺癌模型小鼠體內(nèi)PET顯像

選用8周大的Balb/c雌性裸鼠，于右肩種植雌激素受體陽(yáng)性的MCF-7腫瘤和雌激素受體陰性的MDA-MB-231腫瘤。待腫瘤長(zhǎng)至直徑為0.5-1cm時(shí)進(jìn)行PET顯像，每只裸鼠通過(guò)尾靜脈注射約5.92MBq化合物5，于注射后0.5h，1h和2h分別用異氟烷進(jìn)行吸入式麻醉，俯臥固定后進(jìn)行靜態(tài)掃描成像。MCF-7模型裸鼠的PET顯像結(jié)果如圖5所示。由顯像結(jié)果可知，雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌腫瘤對(duì)化合物有很高的攝取，這種攝取隨時(shí)間的 變化不明顯，并且還有很高的靶與非靶比，說(shuō)明化合物對(duì)雌激素受體陽(yáng)性的腫瘤具有靶向性。

如圖6所示為用氟維司群預(yù)處理的MCF-7模型裸鼠的PET顯像結(jié)果，從圖像可知，在氟維司群將腫瘤的雌激素受體充分破壞后，MCF-7模型裸鼠的腫瘤幾乎不攝取化合物5，由此證明了化合物5對(duì)雌激素受體具有特異性。

MDA-MB-231模型裸鼠的PET顯像結(jié)果如圖7所示，從圖中可以看出，MDA-MB-231模型裸鼠的腫瘤幾乎不攝取化合物5，化合物5只在雌激素受體陽(yáng)性的腫瘤中有高攝取，而在雌激素受體陰性腫瘤中的攝取量與非靶組織攝取量相近，證明了化合物5對(duì)雌激素受體的特異靶向性。

每只裸鼠通過(guò)尾靜脈注射約5.92MBq¹⁸F-FES，于注射后0.5h，1h和2h分別用異氟烷進(jìn)行吸入式麻醉，俯臥固定后進(jìn)行靜態(tài)掃描成像。MCF-7模型裸鼠的PET顯像結(jié)果如圖8所示。MCF-7腫瘤對(duì)¹⁸F-FES的攝取遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)化合物5的攝取，說(shuō)明化合物5對(duì)雌激素陽(yáng)性的腫瘤的靶向性要優(yōu)于¹⁸F-FES。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專(zhuān)利范圍及說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。