冰花愈傷組織萃取物于推遲皮膚細胞老化、調理皮膚、預防及治療皮膚癌的用途的制作方法
本發明關于冰花(mesembryanthemumcrystallinuml.)愈傷組織萃取物及其應用，尤其是關于使用冰花愈傷組織萃取物以推遲皮膚細胞老化、調理皮膚、修補皮膚、治療皮膚癌、及/或預防皮膚癌的應用。
背景技術：
紫外線(uv)是造成皮膚老化及病變的主要因素之一，其依波長可分為長波紫外線(uva)、中波紫外線(uvb)、及短波紫外線(uvc)。已知，日光中的紫外線有超過90％是uva，其具有很強的穿透力，可穿透皮膚的真皮層而對皮膚造成傷害，經常暴露于uva輻射f下將引起皮膚光老化(photoaging)、活性氧分子(ros)生成、dna破壞、膠原蛋白流失、皮膚松弛等，甚至可能造成皮膚癌。
光老化是指皮膚長期暴露于紫外線輻射下，使得皮膚細胞加速老化，導致皮膚發生角質增厚、皮膚干燥脫屑、產生細紋及斑點、皮膚松弛等現象。ros的生成則會造成細胞中氧化壓力升高、加速細胞老化，甚至造成細胞中細胞基質降解酵素的過度活化，進而導致膠原蛋白流失及皮膚松弛。此外，uva也可能破壞細胞中的dna、造成dna受損，過多受損dna的累積不僅造成細胞老化，還可能使細胞癌化進而導致皮膚癌。
在皮膚癌中，以黑色素細胞瘤的致死率為最高。目前，臨床上主要是以手術切除的方式治療黑色素細胞瘤，至于無法承受手術治療的患者，則尚無有效的治療或預防方法。
有鑒于上述問題，業界仍亟需可有效推遲皮膚細胞老化、調理皮膚、修補皮膚、治療皮膚癌及/或預防皮膚癌的方法。本申請發明人研究發現，冰花愈傷組織萃取物可有效降低紫外線對細胞所造成的傷害，具有降低皮膚紋理、毛孔、及經皮水分散失度的效果，且可有效誘發黑色素細胞瘤細胞的細胞凋亡，從而可用于推遲皮膚細胞老化、調理皮膚、修補皮膚、治療皮膚癌及/或預防皮膚癌。
技術實現要素：
本發明的一個目的，在于提供一種使用冰花愈傷組織萃取物于制造護膚產品的用途，其中該護膚產品用于以下至少一種：推遲皮膚細胞老化、調理皮膚、及修補皮膚。較佳地，該護膚產品用于以下至少一種：抗光老化、抗氧化、及修復dna，或用于以下至少一種：減緩膠原蛋白分解、減緩膠原蛋白流失、及減少肌膚紋理。
其中，該護膚產品是以精華液或美容飲品的形式提供。
較佳的，該護膚產品為精華液且該精華液中的冰花愈傷組織萃取物的濃度為0.01至10重量％。
較佳的，該護膚產品為美容飲品且該美容飲品中的冰花愈傷組織萃取物的濃度為1至1000ppm。
本發明的另一個目的，在于提供一種使用冰花愈傷組織萃取物于制造藥劑的用途，其中該藥劑用于以下至少一種：治療皮膚癌、預防皮膚癌，該皮膚癌可以為黑色素細胞瘤。
其中，該藥劑通過經皮或口服的方式施用。
本發明的另外一個目的，在于提供一種用于推遲皮膚細胞老化、調理皮膚、修補皮膚、治療皮膚癌、及預防皮膚癌的至少一種方法，其包含對一個有需要的個體施用有效量的冰花愈傷組織萃取物。
附圖說明
下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。
圖1：以dcf-da染劑測試人類皮膚纖維母細胞中ros含量的結果；
圖2：以qrt-pcr(real-timequantitativepolymerasechainreaction)檢測人類皮膚纖維母細胞中cat-1及sod2-1基因表現量的結果；
圖3a至3c：以qrt-pcr檢測人類皮膚纖維母細胞中ber相關基因(包括ung-1、ogg1-1、mpg-1、及ape1-1)、ner相關基因(包括ercc1-1、ercc6-1、及xpa-1)、及dsb相關基因(包括xrcc1-1及xrcc5-1)的表現量的結果；
圖4a及4b：以單細胞電泳檢測細胞的dna受損情形的結果；
圖5：以qrt-pcr檢測人類皮膚纖維母細胞中timp1及col1a1基因表現量的結果；
圖6a及6b：以mtt檢定法檢測人類皮膚纖維母細胞的存活率的結果；
圖7：以skinanalyzertd膚質檢測儀檢測皮膚紋理的結果；以及
圖8：以mtt檢定法檢測黑色素瘤細胞的存活率的結果。
具體實施方式
以下將描述根據本發明的部分具體實施例；但是，在不背離本發明精神下，本發明可以多種不同形式的實施例來實踐，不應將本發明保護范圍限于說明書所陳述的內容。此外，除非文中有另外說明，于本說明書中(尤其是在權利要求書中)所使用的“一”、“該”及類似用語應理解為包含單數及復數形式；所謂“有效量”，是指投予至個體時，可有效至少部分改善懷疑個體的病情的化合物數量；所謂“個體”是指人類或非人的哺乳動物；所謂“治療”是包括預防特定疾病或癥狀、減輕特定的疾病或癥狀及/或防止或消除該病癥。
冰花(mesembryanthemumcrystallinuml.)在分類學上屬于番杏科、松葉菊屬的雙子葉一年生植物。本申請發明人研究發現，冰花植株在受傷后所產生的愈傷組織具有類似哺乳類全能干細胞的特性，該愈傷組織萃取物可有效抗光老化、抗氧化、修復dna、減緩膠原蛋白分解、減緩膠原蛋白流失、及減少肌膚紋理。
因此，本發明提供一種使用冰花愈傷組織萃取物于推遲皮膚細胞老化、調理皮膚、修補皮膚、預防皮膚癌、及/或治療皮膚癌的應用。前述應用包括：使用冰花愈傷組織萃取物制造一種推遲皮膚細胞老化、調理皮膚、及/或修補皮膚的護膚產品；使用冰花愈傷組織萃取物制造一種治療皮膚癌及/或預防皮膚癌的藥劑；以及使用冰花愈傷組織萃取物以對有需要的個體提供推遲皮膚細胞老化、調理皮膚、修補皮膚、治療皮膚癌、及預防皮膚癌的至少一種的方法。
本發明所采用的冰花愈傷組織萃取物，可通過以溶劑萃取冰花愈傷組織而提供。其中，所采用的溶劑可以為極性溶劑，例如醇、水、或其組合。較佳地，該溶劑選自c1-4醇、水、及其組合。舉例言之，可以乙醇進行該萃取操作。視需要地，可于超音波震蕩操作下進行萃取，以提升萃取效果。較佳地，可以在進行萃取之前，先進行干燥處理。
于本發明的部分實施例中，于進行萃取之前，先冷凍干燥冰花愈傷組織。舉例言之，可以100：1(水：經冷凍干燥的冰花愈傷組織)的重量比混合水與經冷凍干燥的冰花愈傷組織，并于70℃下對所得到的混合物進行超音波震蕩，歷時45分鐘以完成萃取?；蛘?，可以10：1的重量比混合70％的乙醇與經冷凍干燥冰花愈傷組織，并在70℃下對所得到的該混合物進行超音波震蕩，歷時30分鐘以完成萃取。
該冰花愈傷組織可通過包含如下步驟的操作提供：
i.以6％次氯酸鈉溶液沖洗冰花植株，其后以滅菌水沖洗冰花植株，視需要地，可重復前述沖洗操作；
ii.在冰花植株的表面上切出傷口，以誘導產生愈傷組織(歷時1至3個月)；
iii.在25℃、50％至60％的濕度下，以ms培養基(murashigeandskoogbasalmedium，購自sigma公司，產品編號：m5519)培養步驟ii所得的愈傷組織(歷時1至1.5個月)。
于本發明中，冰花愈傷組織萃取物可以萃取所得的萃取原液直接使用，或視需要對該萃取原液進行例如過濾、滅菌、濃縮、稀釋等一個或多個步驟，以提升萃取液的使用便利性。舉例言之，通過例如濃縮干固、噴霧干燥、或冷凍干燥等操作，可由萃取液得到方便攜帶或方便儲存的粉末產物。
根據本發明所提供的護膚產品可呈任何合適的形式，并無特殊的限制，視所需要的用途而呈對應的合適形態。舉例言之，但不以此為限，該護膚產品可呈供直接外用的乳液、乳霜、凝膠(例如水凝膠)、膏狀物(例如分散膏、軟膏)、噴霧劑、或溶液(例如洗液、懸浮液)等形式?；蛘?，可將本發明的護膚產品制備成可供吞食或飲用的食品形式，例如健康食品、美容飲品等。此外，也可將本發明護膚產品以皮下注射的針劑形式提供。
類似地，根據本發明所提供的藥劑可呈任何合適的形式，并無特殊限制，視所需要的用途而呈對應的合適形態。舉例言之，但不以此為限，該藥劑可以口服或不經口服(例如：經皮、皮下、靜脈內、肌肉、腹腔、或鼻腔)的方式施用至有需要的個體上。其中，視使用形式及用途而定，可選用合適的載劑以提供該醫藥組合物或藥物，其中，該載劑包括賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等。
以適于口服的藥劑形式為例，該藥劑中可含有任何不會不利影響冰花愈傷組織萃取物及/或其活性成分的所需效果的醫藥上可接受的載劑，例如：水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、纖維素、淀粉、糖膨潤土(sugarbentonite)、及前述的組合?？衫萌魏魏线m的方法，以適于口服的劑型提供該藥劑，例如：錠劑(例如糖衣錠)、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、酊劑等。
至于適于皮下靜脈內、肌肉、或腹腔注射的針劑或點滴劑型，則可于該藥劑中含有一種或多種例如等張溶液、鹽類緩沖液(如磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液)、增溶劑、乳化劑、5％糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、干粉注射劑、懸液注射劑、或干粉懸液注射劑等劑型提供該藥劑?；蛘?，將該藥劑制備成一種注射前固體，以可溶于其他溶液或懸浮液中的劑型、或可乳化的劑型提供該注射前固體，并于施用至有需要的個體之前，將該注射前固體溶于其他溶液或懸浮液中或將其乳化，提供所需要的注射劑。
視需要地，可于根據本發明所提供的護膚產品或藥劑中另外含有合適用量的添加劑，例如可提高該護膚產品或藥劑于服用時的口適感及視覺感受的調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該護膚產品或藥劑的穩定性及儲存性的緩沖劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。此外，該護膚產品或藥劑可根據需要另外含一種或多種其他活性成分(例如，玻尿酸、杏仁酸、熊果素、膠原蛋白、彈性蛋白等)，或者與含該一種或多種其他活性成分的護膚產品或藥物并用，以進一步加強該護膚產品或藥劑的功效或增加制劑配方的運用靈活性與調配度。原則上，只要所添加的其它成分或添加劑不會對本發明護膚產品或藥劑的需要功效產生不利的影響即可。
根據本發明的應用所提供的護膚產品或藥劑可以一日一次、一日多次、或多日一次等不同頻率施用，視服用個體的需求、年齡、體重、健康況狀、及施用目的而不同。
當施用根據本發明所提供的護膚產品于皮膚表面以推遲皮膚細胞老化、調理皮膚、及/或修補皮膚時，可根據產品形態而含有不同濃度的冰花愈傷組織萃取物。舉例言之，當以精華液的形式提供本發明冰花愈傷組織萃取物時，該精華液中的冰花愈傷組織萃取物的濃度可以為0.01-10重量％(如：1重量％)。而當以美容飲品的形式提供本發明冰花愈傷組織萃取物時，該飲品中的冰花愈傷組織萃取物的濃度則可以為1-1000ppm(如：100ppm)。
本發明也提供一種用于推遲皮膚細胞老化、調理皮膚、修補皮膚、治療皮膚癌、及預防皮膚癌的至少一種的方法，其包含對一個有需要的個體施用有效量的冰花愈傷組織萃取物。其中，有關該冰花愈傷組織萃取物的施用途徑、施用形式、適用劑量、以及相關治療或預防的應用，均如上述說明。
茲以下列實施例進一步說明本發明。其中這些實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明的保護范圍。本發明保護范圍如權利要求書所示。
實施例1：萃取物的制備
將購自中國臺灣蔬菜之家園藝資材行的冰花種子(商品代碼：00k20)培育成冰花植株，并將該植株分成a、b兩批。其中，對a批施以如下處理，以提供冰花愈傷組織：
i.以6％次氯酸鈉溶液沖洗冰花植株，其后以滅菌水沖洗冰花植株，視需要地，可重復前述沖洗操作；
ii.在冰花植株的表面上切出傷口，以誘導產生愈傷組織(歷時1至3個月)；
iii.在25℃、50％至60％濕度下，以ms培養基(murashigeandskoogbasalmedium，購自sigma公司，產品編號：m5519)培養步驟ii所得的愈傷組織(歷時1至1.5個月)。
分別以下列步驟處理上述b批的冰花植株以及由a批冰花植株所得的冰花愈傷組織，以制備冰花植株(ip)萃取物及冰花愈傷組織(ipc)萃取物：
(1)冰花植株(或冰花愈傷組織)置于-22℃下進行冷凍干燥，歷時12小時；以及
(2)粉碎步驟(1)的經干燥的冰花植株(或冰花愈傷組織)，以提供冰花植株粉末(或冰花愈傷組織粉末)。
(3)將70％的乙醇與步驟(2)的冰花植株粉末(或冰花愈傷組織粉末)以10：1(乙醇：粉末)的重量比混合；
(4)在70℃下，對步驟(3)所獲得的混合物進行超音波震蕩，歷時30分鐘；
(5)以濾膜過濾步驟(4)所得的混合物，以提供一種濾液；
(6)加熱由步驟(5)所獲得的濾液至95℃，并維持20分鐘，以進行滅菌；
(7)待步驟(6)的濾液冷卻后，將其冷藏保存以供后續實驗使用。
實施例2：冰花愈傷組織(ipc)萃取物的抗氧化功效
于mem培養基(購自gibco，產品編號：61100-061)中培養人類皮膚纖維母細胞(ccd-966sk；購自atcc)，歷時24小時，其后，將細胞分為四組，并進行以下處理：
(1)控制組：將細胞置于mem培養基中培養2小時(即，將細胞培養于不含ip萃取物及ipc萃取物的培養液中)。
(2)h2o2組：將細胞置于mem培養基中培養1小時(即，將細胞培養于不含ip萃取物及ipc萃取物的培養液中)，接著，加入h2o2(使其于培養基中的最終濃度達到1毫莫耳濃度)進行處理，歷時1小時。
(3)h2o2+ip組：將細胞置于含有2毫克/毫升得自實施例1的冰花植株(ip)萃取物的mem培養基中培養1小時，接著，加入h2o2(使其于培養基中的最終濃度達到1毫莫耳濃度)進行處理，歷時1小時。
(4)h2o2+ipc組：將細胞置于含有2毫克/毫升得自實施例1的冰花愈傷組織(ipc)萃取物的mem培養基中培養1小時，接著，加入h2o2(使其于培養基中的最終濃度達到1毫莫耳濃度)進行處理，歷時1小時。
接著，以dcf-da染劑(購自sigma公司，產品型號：d6883)處理上述各組細胞，歷時15分鐘，其后以流式細胞儀檢測各組的熒光強度，其中，由于ros可將dcf-da(不具熒光)轉變為dcf(具有熒光)，故所測得的熒光強度可代表細胞中的ros含量，熒光強度越高代表細胞中的ros含量越高。最后，以控制組的結果為基準，計算其他各組的相對熒光強度。結果示于圖1(*表示與h2o2組有顯著差異，p<0.05；**表示與h2o2組有顯著差異，p<0.01；#表示與h2o2+ip組有顯著差異，p<0.05)。
由圖1可知，相較于控制組，h2o2組的熒光強度顯著上升。然而，相較于h2o2組，h2o2+ip組與h2o2+ipc組的熒光強度皆明顯下降。此外，相較于h2o2+ip組，h2o2+ipc組的熒光強度明顯更低。前述結果顯示，冰花愈傷組織(ipc)萃取物可有效抵抗h2o2氧化壓力、降低細胞中的ros含量，可用于抗氧化，而且所提供的效果明顯優于冰花植株(ip)萃取物。
實施例3：冰花愈傷組織萃取物于推遲皮膚細胞老化、調理皮膚、及修補皮膚的效果
(3-1)人類皮膚纖維母細胞的處理
于mem培養基中培養人類皮膚纖維母細胞(ccd-966sk；購自atcc)，歷時24小時，其后，將細胞分為四組，并進行以下處理：
(1)控制組：將細胞置于mem培養基中培養48小時(即，將細胞培養于不含冰花愈傷組織萃取物的培養液中)。
(2)uva+6hr組、uva+24hr組、uva+48hr組：分別將細胞置于含有2毫克/毫升得自實施例1的冰花愈傷組織萃取物的mem培養基中培養6小時、24小時、及48小時。
(3)接著，以uva照射上述各組細胞，歷時1小時。
(3-2)抗光老化及抗氧化
為進一步了解本發明冰花愈傷組織萃取物于抗光老化及抗氧化的效果，于完成實施例3-1之后，進行qrt-pcr，以檢測各組細胞中cat-1及sod2-1等抗氧化基因的表現量，并以控制組的結果為基準，計算其他組的相對基因表現量。結果示于圖2。
由圖2可知，相較于控制組(未經冰花愈傷組織萃取物處理)，經冰花愈傷組織萃取物處理的組別(包括uva+6hr組uva+24hr組、及uva+48hr組)的抗氧化基因(即，cat-1及sod2-1)表現量皆明顯提升。此結果顯示，冰花愈傷組織萃取物可提供抗光老化及抗氧化的效果，故可用于推遲皮膚細胞老化。
(3-3)修復dna
生物體中具有堿基切除修復(baseexcisionrepair，ber)、核苷酸切除修復(nucleotideexcisionrepair，ner)、雙股斷裂末端接合(double-strandbreakendjoint，dsb)等dna修復機制，故可避免因為dna突變或斷裂所造成的傷害。
為了解本發明冰花愈傷組織萃取物是否可修復dna，于完成實施例3-1之后所進行的qrt-pcr中，除檢測各組細胞中cat-1及sod2-1等抗氧化基因的表現量以外，并檢測細胞中有關ber、ner、及dsb等機制的基因表現量，后者的結果示于圖3a至3c(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。
由圖3a至3c可知，相較于控制組，經冰花愈傷組織萃取物處理的組別(包括uva+6hr組uva+24hr組、及uva+48hr組)的ber相關基因(包括ung-1、ogg1-1、mpg-1、及ape1-1)、ner相關基因(包括ercc1-1、ercc6-1、及xpa-1)、及dsb相關基因(包括xrcc1-1及xrcc5-1)表現量皆明顯提升。前述結果顯示，冰花愈傷組織萃取物可有效修復dna，并借此達到推遲皮膚細胞老化的效果。
(3-4)保護dna
已知，在單細胞電泳檢測中，dna受損的細胞會出現拖尾的現象，因此，可通過計算有拖尾現象的細胞的比例來評估dna受損程度。
為進一步了解本發明冰花愈傷組織萃取物是否可保護細胞的dna，對實施例2的控制組、h2o2組、及h2o2+ipc組三組細胞進行單細胞電泳檢測。結果示于圖4a及4b(**p<0.01)。
由圖4a及4b可知，相較于控制組，h2o2組中有拖尾現象(即，dna受損)的細胞比例明顯較高。然而，相較于h2o2組，h2o2+ipc組中有拖尾現象的細胞比例則明顯較低。前述結果顯示，冰花愈傷組織萃取物可有效保護細胞dna，并借此達到推遲皮膚細胞老化的效果。
(3-5)減緩膠原蛋白分解及流失
膠原蛋白分解及流失會加速皮膚老化，其中，已知timp1的基因表現量上升代表膠原蛋白的分解被抑制，col1a1表現上升，代表膠原蛋白表現量增加。為了解本發明冰花愈傷組織萃取物是否可減緩皮膚的膠原蛋白分解及流失，于完成實施例3-1之后所進行的qrt-pcr中，也檢測控制組及uva+24hr組細胞中timp1及col1a1的表現量，并以控制組作為基準計算uva+24hr組的相對基因表現量。結果示于圖5(*p<0.05、**p<0.01)。
由圖5可知，相較于控制組，uva+24hr組的timp1及col1a1表現量皆明顯提升。此結果顯示，冰花愈傷組織萃取物可有效降低膠原蛋白分解及提升膠原蛋白合成，故可用于減緩膠原蛋白分解及/或流失，達到調理皮膚、及修補皮膚的效果。
(3-6)提高人類皮膚纖維母細胞存活率
于人類皮膚纖維母細胞穩定培養24小時后，將其分為六組，并進行以下處理：
(1)控制組：將細胞置于mem培養基中培養24小時(即，將細胞培養于不含冰花愈傷組織萃取物的培養液中)。
(2)uva組：將細胞置于mem培養基中培養24小時(即，將細胞培養于不含冰花愈傷組織萃取物的培養液中)，接著，以uva照射細胞，歷時1小時。
(3)uva+0.75組、uva+1組、uva+1.5組、及uva+2組：分別將細胞置于含有0.75、1、1.5、及2毫克/毫升由實施例1獲得的冰花愈傷組織萃取物的mem培養基中培養24小時，接著，以uva照射細胞，歷時1小時。
其后，以mtt檢定法檢測各組細胞的存活率。結果示于圖6a及6b(**p<0.01)。由圖6a可知，相較于控制組，uva組的細胞存活率明顯較低。然而，由圖6b可知，相較于uva組，經冰花愈傷組織萃取物處理的組別(包括uva+0.75組、uva+1組、uva+1.5組、及uva+2組)的細胞存活率皆顯著回升，且冰花愈傷組織萃取物的使用濃度與細胞存活率成正比。前述結果顯示，冰花愈傷組織萃取物可有效降低uva對細胞的傷害，且在試驗濃度范圍內對正常人類皮膚纖維母細胞不具毒性。
(3-7)減少肌膚紋理
本實驗采取自身對照方式進行，10位自愿受試者在第0周時，以skinanalyzertd膚質檢測儀及
表1
如表1所示，在使用含有本發明冰花愈傷組織萃取物的精華液6周后，受試者的皮膚紋理明顯減少、毛孔明顯縮小，且經皮水分散失度明顯降低。此外，如圖7顯示，相較于涂抹安慰劑，受試者在涂抹精華液(含有本發明的冰花愈傷組織萃取物)6周后，眼部周圍的細紋明顯改善。前述結果顯示，本發明的冰花愈傷組織萃取物確實具有調理皮膚及修補皮膚的效果。
實施例4：冰花愈傷組織萃取物于治療及預防黑色素細胞瘤的效果
于黑色素瘤細胞(購自atcc，產品編號：crl-6475)穩定培養24小時后，將其分為六組，其中一組繼續培養于不含冰花愈傷組織萃取物的dmem培養基(購自gibco，產品編號：12100-046)中，歷時48小時(此為“控制組”)，其余五組則分別培養于含有由實施例1獲得的冰花愈傷組織萃取物的dmem培養基中(冰花愈傷組織萃取物于培養基中的最終濃度分別為0.25、0.5、1、2及4毫克/毫升)，歷時48小時。接著，以mtt檢定法檢測各組的存活率，并以控制組的結果為基準，計算其他各組的相對細胞存活率。結果示于圖8(**p<0.01)。
如圖8所示，當冰花愈傷組織萃取物的濃度高于0.5毫克/毫升時，黑色素瘤細胞的存活率與冰花愈傷組織萃取物的使用濃度呈反比。此結果顯示，冰花愈傷組織萃取物可有效毒殺黑色素瘤細胞，故可用于治療及/或預防皮膚癌。
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