本發明涉及醫藥及保健食品
技術領域：
，具體涉及一種去壁靈芝孢子粉顆粒及其制備方法。
背景技術：
：人類對健康觀念內涵的認識隨著科技水平的發展而進一步深化，世界衛生組織50多個國家醫學專家研究發現，對各種疾病最好的治療還是預防。目前各種醫院的檢查只能對已經產生的疾病進行診斷，一旦確認有病，也往往會因發現太晚而束手無策，即使通過現代醫療科技手段也難使病人恢復如初。《黃帝內經》有言：“上工治未病，不治已病，此之謂也”，治未病即采取相應的措施，防止疾病的發生發展，是我國傳統醫學的主要思想。任何疾病只要預防和保養在先，發病的機率就會很低，甚至可以完全化解和避免。預防疾病最重要的手段是增強機體免疫力。而現有的保健藥品基本上對于免疫力的調節都靠“補”，即補充各種各樣的維生素、氨基酸，服用后也有效果，但停用很短一段時間后，免疫力又會下降，沒有達到從根本上改善人體臟器內部環境，使人體自身具備免疫力的功效。靈芝孢子是靈芝在生長成熟期，從靈芝菌褶中彈射出來的極其微小的卵形生殖細胞即靈芝的種子。它凝聚了靈芝的精華，富含靈芝多糖、三萜類、蛋白質、多肽、氨基酸、核苷類化合物、有機鍺、微量元素和維生素等多種生物活性物質，具有增強免疫力、抗輻射、清除自由基等多種功能，且藥性溫和，無副作用，但其表面被堅硬的幾丁質纖維素所包圍，人體很難充分吸收。目前市面上破壁靈芝孢子粉多通過機械破碎方法獲得，人體吸收依舊存在一定困難；另外，破壁靈芝孢子粉中含有大量的幾丁質纖維素等，導致破壁靈芝孢子粉中真正的有效成分，如粗多糖、總三萜含量等含量低、吸收難。技術實現要素：本發明針對現有技術的不足，提供一種可有效增強免疫力、對輻射危害有輔助保護功能的去壁靈芝孢子粉、顆粒，有效成分如粗多糖、總三萜等含量高，易吸收，方便靈芝孢子粉、顆粒的攜帶及服用，使人體更有效地吸收營養成分。本發明提供了一種去壁靈芝孢子粉顆粒，以破壁靈芝孢子粉水提物為活性成分；去壁靈芝孢子粉顆粒中粗多糖含量為10～20g/100g，總三萜含量為4～10g/100g。優選的，去壁靈芝孢子粉的粒徑小于0.180mm。本發明提供了一種去壁靈芝孢子粉的制備方法，包括以下步驟：(1)將破壁靈芝孢子粉浸泡，水提，得到破壁靈芝孢子水提液；(2)將所述步驟(1)得到的水提液濃縮，得到濃縮藥液；(3)將所述濃縮藥液干燥，得到干浸膏；(4)將所述干浸膏進行粉碎后過篩，得到去壁靈芝孢子粉。優選的，所述浸泡優選為低溫水浸泡，更優選的在-5～20℃水中浸泡；優選的，浸泡1～4小時，更優選的，浸泡2小時。優選的，所述水提為將浸泡液10～60分鐘內升溫至100～120℃，更優選的為30分鐘內升溫至100～120℃。優選的，所述的濃縮為減壓濃縮，所述減壓濃縮的真空度為-0.07～-0.09mpa，所述減壓濃縮的溫度為60～70℃。優選的，所述的干燥為微波干燥，所述微波干燥的真空度為-0.07～-0.09mpa，所述微波干燥的溫度為60～70℃。本發明提供了一種去壁靈芝孢子顆粒的制備方法，包括以下步驟：將上述得到的去壁靈芝孢子粉制粒，得到去壁靈芝孢子顆粒。優選的，制粒為一步制粒；優選的，一步制粒步驟為：上述得到的去壁靈芝孢子粉與水混合，在壓力-2.5～-3.0kpa，進風溫度60～80℃，出風溫度不超過60℃條件下一步制粒。優選的，所述制粒后的靈芝孢子顆粒粒度在12～16目之間。本發明提供了一種破壁靈芝孢子水提液的制備方法，包括以下步驟：將破壁靈芝孢子粉與水混合進行煎煮，破壁靈芝孢子粉與水的質量比為4～6:8～15。優選的，進行2次水提，將4～6重量份的破壁靈芝孢子粉加入提取罐，先用12重量份的水提取1次，濾出藥液；將濾出殘渣用10重量份的水煎煮，濾出藥液。更優選的，進行3次水提，將將4～6重量份的破壁靈芝孢子粉加入提取罐，先用12重量份的水提取1次，濾出藥液；將濾出殘渣用10重量份的水煎煮2次，濾出藥液。優選的，水提溫度為80～120℃，每次水提時間為1～2小時。優選的，煎煮后還包括：將所述煎煮得到的物料過濾后離心，得到水提液。優選的，離心時藥液的溫度為0～4℃，離心轉速為2000～4000rpm。有益效果與現有技術相比，本發明以破壁靈芝孢子粉水提物為原料，制備得到去壁靈芝孢子粉、顆粒；在本發明中，所述水提物由破壁靈芝孢子粉、顆粒經水提、濃縮、干燥和粉碎得到。本發明提供的產品最大程度保留了靈芝孢子的有效成分，去除靈芝破壁后產生的幾丁質及纖維素外殼，使靈芝孢子粉的有效成分含量大幅度提高，且更易吸收；能夠綜合提高人體免疫能力，包括提高細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能及nk細胞活性等；對輻射危害有輔助保護功能；且對斑馬魚人胃癌移植瘤、人肺腺癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤均有抑制作用，其中對斑馬魚人胃癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤的抑制作用較強，達到了78％及83％。而且，本發明提供的產品為粉劑、顆粒劑，方便攜帶及服用，使人體可更有效地吸收靈芝孢子中的營養成分。附圖說明圖1為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用表型圖；圖2為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用圖；圖3為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用圖；圖4為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用表型圖；圖5為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用圖；圖6為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用圖；圖7為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用表型圖；圖8為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用；圖9為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用圖。具體實施方式本發明提供了一種去壁靈芝孢子粉、顆粒，以破壁靈芝孢子粉水提物為活性成分；去壁靈芝孢子粉顆粒中粗多糖含量為10～20g/100g，總三萜含量為4～10g/100g。本發明提供的去壁靈芝孢子粉、顆粒的粒徑優選小于0.180mm，更優選為0.100～0.160mm。本發明還提供了一種去壁靈芝孢子粉的制備方法，包括以下步驟：(1)將破壁靈芝孢子粉浸泡，水提，得到破壁靈芝孢子水提液；(2)將所述步驟(1)得到的水提液濃縮，得到濃縮藥液；(3)將所述濃縮藥液干燥，得到干浸膏；(4)將所述干浸膏進行粉碎后過篩，得到去壁靈芝孢子粉制粒。本發明中，所述浸泡優選為低溫水浸泡，更優選的在-5～20℃水中浸泡；優選的，浸泡1～4小時，更優選的，浸泡2小時。優選的，所述水提為將浸泡液10～60分鐘內升溫至100～120℃，更優選的，30分鐘內升溫至100～120℃。將破壁靈芝孢子粉進行水提，得到水提液。水提還具有熟化滅菌的作用。在本發明中，所述破壁靈芝孢子粉可以市售常規品種，也可自制，破壁采用的方式有機械破壁，機械破壁又劃分為振動磨破壁、超音速氣流粉碎破壁還有剪切式擠壓破壁；所述水提優選為：將破壁靈芝孢子粉與水混合進行煎煮，得到水提液。在本發明中，所述破壁靈芝孢子粉與水的質量比優選為4～6:8～15，更優選為5：12。在本發明中，所述水提的次數優選為三次，具體為將上次煎煮得到的藥渣再與水混合依次進行兩次煎煮，將三次煎煮得到的濾液合并，得到提取液。在本發明中，一次煎煮的時間優選為2小時；將濾出殘渣用10重量份的水煎煮2次，每次2小時，濾出藥液。在本發明中，所述水提的溫度優選為80～120℃，更優選為90～100℃；所述水提的時間優選為每次1～4小時，更優選的為每次2小時；在本發明中，所述煎煮后優選將所述煎煮得到的物料過濾后離心，得到水提液。在本發明中，所述過濾也可以是板框過濾；所述離心的轉速優選為2000～4000rpm，更優選為2500～3000rpm。得到水提液后，本發明將所述水提液濃縮，得到濃縮藥液。在本發明中，所述濃縮優選為減壓濃縮；所述減壓濃縮的真空度優選為-0.07～-0.09mpa，所述減壓濃縮的溫度優選為60～70℃。本發明中，減壓濃縮的時間以密度為控制，所述減壓濃縮后的密度優選為1.05～1.15更優選的為1.08～1.12，最優選為1.10。。得到濃縮藥液后，本發明將所述濃縮藥液干燥，得到干浸膏。在本發明中，所述干燥優選為微波干燥；所述微波干燥的真空度優選為-0.07～-0.09mpa，所述微波干燥的溫度優選為60～70℃；優選的，微波功率為30kw。在本發明中，微波干燥的時間以水分控制，最優選的水分控制在2％-7％，更優選的為3-6％，最優選為4％。得到干浸膏后，本發明將所述干浸膏粉碎后過篩，得到去壁靈芝孢子粉水提物。在本發明中所述的粉碎采用本領域常規的粉碎方法即可，具體的在本發明實施例中采用粉碎機進行，過篩收集篩下組分；所述粉碎的過程中過篩的目數優選的為60～100目，更優選的為80目。得到去壁靈芝孢子粉后，本發明將所述去壁靈芝孢子粉制粒，得到去壁靈芝孢子顆粒。在本發明中，所述制粒優選為一步制粒；所述制粒優選沸騰制粒機；所述制粒的過程優選為：將所述去壁靈芝孢子粉與水混合，在壓力-2.5～-3.0kpa，進風溫度60～80℃，出風溫度不超過60℃條件下一步制粒；更優選為：設定風機頻率26hz，進風溫度55-60℃，將原料加入流化床中，通過向上運動的熱空氣進行加熱，使物料保持良好的懸浮狀態，混合10分鐘，將粘合劑(水)通過噴霧系統進行制粒，進風溫度設置60℃左右，控制物料溫度35-55℃，霧化壓力內層壓力1.5-2.5kg/cm2，外層壓力1.5-2.5kg/cm2，開始制粒時，設定蠕動泵的轉速200-250rpm，漸成顆粒后設定轉速150-200rpm；制粒結束后進行物料干燥，設定進風溫度80-85℃左右，風機頻率30-35hz，直至物料溫度達到55℃-60℃左右，停止加熱，物料溫度降至40℃左右停機，出料；制粒車間內，溫度控制在18℃-26℃，濕度控制在45％-65％。在本發明中，所述制粒制得顆粒粒度在12～16目之間，水分≤4％；更優選的，粒度為14目。下面將結合本發明中的實施例，對本發明中的技術方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。實施例1將4重量份破壁靈芝孢子粉與48重量份的水混合浸泡，在80℃下水提2h，得到第一提取液和第一濾渣；將得到的第一濾渣與40重量份的水混合在99℃下煎煮2h，得到第二提取液和第二濾渣；將得到的第二濾渣與44重量份的水混合在98℃下煎煮2h，得到第三提取液；將第一提取液、第二提取液和第三提取液合并后在真空度為-0.09mpa和溫度為65℃的條件下減壓濃縮到密度為1.15，得到濃縮藥液；將濃縮藥液在真空度為-0.08mpa、溫度為65℃的條件下進行微波干燥，到含水量為6％，得到干浸膏；將干浸膏粉碎后過80目篩，得到去壁靈芝孢子粉；本發明在獲得破壁靈芝孢子粉后，將破壁靈芝孢子粉與水混合，在壓力-2.5kpa，進風溫度60℃，出風溫度50℃條件下，進行14目制粒，得到去壁靈芝孢子顆粒。本發明所獲得的去壁靈芝孢子粉及顆粒的總多糖含量為15.2g/100g，總三萜含量為5.87g/100g，去壁靈芝孢子粉的提取率高于市面上常見破壁靈芝孢子粉。實施例2將5重量份破壁靈芝孢子粉與55重量份的水混合浸泡，在80℃下水提2h，得到第一提取液和第一濾渣；將得到的第一濾渣與50重量份的水混合在99℃下煎煮2h，得到第二提取液和第二濾渣；將得到的第二濾渣與60重量份的水混合在98℃下煎煮2h，得到第三提取液；將第一提取液、第二提取液和第三提取液合并后在真空度為-0.09mpa和溫度為65℃的條件下減壓濃縮到密度為1.10，得到濃縮藥液；將濃縮藥液在真空度為-0.08mpa、溫度為65℃的條件下進行微波干燥到含水量為4％，得到干浸膏；將干浸膏粉碎后過80目篩，得到去壁靈芝孢子粉；本發明在獲得破壁靈芝孢子粉后，將破壁靈芝孢子粉與水混合，在壓力-2.8kpa，進風溫度65℃，出風溫度55℃條件下，進行15目制粒，得到去壁靈芝孢子顆粒。本發明所獲得的去壁靈芝孢子粉、顆粒的總多糖含量為15.8g/100g，總三萜含量為6.19g/100g，去壁靈芝孢子粉的提取率高于市面上常見破壁靈芝孢子粉。實施例3將6重量份破壁靈芝孢子粉與72重量份的水混合浸泡，在80℃下水提2h，得到第一提取液和第一濾渣；將得到的第一濾渣與60重量份的水混合在99℃下煎煮2h，得到第二提取液和第二濾渣；將得到的第二濾渣與60重量份的水混合在98℃下煎煮2h，得到第三提取液；將第一提取液、第二提取液和第三提取液合并后在真空度為-0.09mpa和溫度為65℃的條件下減壓濃縮到密度為1.12，得到濃縮藥液；將濃縮藥液在真空度為-0.08mpa、溫度為65℃的條件下進行微波干燥到含水量為3％，得到干浸膏；將干浸膏粉碎后過80目篩，得到去壁靈芝孢子粉；本發明在獲得破壁靈芝孢子粉后，將破壁靈芝孢子粉與水混合，在壓力-3.0kpa，進風溫度70℃，出風溫度60℃條件下，進行16目制粒，得到去壁靈芝孢子顆粒。本發明所獲得的去壁靈芝孢子粉、顆粒的總多糖含量為15.4g/100g，總三萜含量為6.94g/100g，去壁靈芝孢子粉的提取率高于市面上常見破壁靈芝孢子粉。實施例4骨髓有核細胞實驗設置去壁靈芝孢子粉、顆粒及陰性對照組，陰性對照組給予同等容積的去離子水。各組小鼠灌胃給樣品，每天一次，每次用量1.00g/kg·bw/d，連續20天，進行60co-γ射線照射，照射后第3天進行骨髓有核細胞實驗，結果見表1。表1骨髓有核細胞實驗結果組別動物數(只)溶血空斑數(個/106脾細胞)骨髓有核細胞數(107/ml)陰性對照組1095±281.47±0.31實施例110132±232.01±0.45由表1可以看出，實施例1中的去壁靈芝孢子粉、顆粒能夠顯著增加溶血空斑數和骨髓有核細胞數，提高細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能及nk細胞活性，對輻射危害有輔助保護功能。急性毒性試驗：按《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)進行急性毒性試驗，雌、雄性小鼠急性經口mtd大于20000mg/kg·bw，根據急性毒性劑量分級標準，該樣品屬無毒級。微核試驗：按《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)進行微核試驗，設受試物2.5、5.0、10.0g/kg·bw3個劑量組，對小鼠灌胃。受試物微核試驗結果為陰性。精子畸形試驗：按《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)進行精子畸形試驗，設受試物2.5、5.0、10.0g/kg·bw3個劑量組，對雄性小鼠灌胃。受試物精子畸形試驗結果為陰性。ames試驗：按《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)進行ames試驗，采用平板摻入法，測試劑量為5000、1000、200、40和8μg/皿。受試物ames試驗結果為陰性。大鼠30天喂養試驗：按《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)進行大鼠30天喂養試驗，雌性設4.06、2.63、1.18g/kg·bw/d(相當于人體推薦量的122倍、79倍、35倍)三個劑量組，雄性設3.79、2.45、1.13g/kg·bw/d(相當于人體推薦量的114倍、74倍、34倍)三個劑量組。受試動物一般情況良好，體重、食物利用率、臟器重量、臟器系數均無異常改變；血液學指標及生化指標顯示，各項指標均在正常范圍，各臟器病理組織學檢查未見與受試樣品有關的病理改變。實驗結果表明：去壁靈芝孢子粉劑、顆粒劑大鼠30天喂養試驗各劑量組各項指標均未觀察到有害作用。由以上實施例可知，本發明所述去壁靈芝孢子粉、顆粒中有效成分總多糖的含量為10～20g/100g，總三萜的含量為4～10g/100g，相比現有技術中的靈芝孢子粉中有效成分的含量有了極大的提高，使得有效成分易吸收，安全無毒，能夠有效增強機體免疫力；并且去壁靈芝孢子粉、顆粒劑的劑型使得其攜帶和服用非常方便。實驗動物1.野生型ab品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。共330尾，每實驗組為30尾，年齡為受精后2天(330尾用于樣品抗肺腺癌作用評價)。2.野生型ab品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。共480尾，每實驗組為30尾，年齡為受精后2天(330尾用于樣品抗肺腺癌作用評價，150尾用于抗肺腺癌作用評價重復實驗)。3.野生型ab品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。共660尾，每實驗組為30尾，年齡為受精后2天(330尾用于樣品抗淋巴癌作用評價，330尾用于樣品抗淋巴癌作用評價重復實驗)。飼養于28℃的養魚用水中(水質：每1l反滲透水中加入200mg速溶海鹽，電導率為480～510μs/cm；ph為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6mg/lcaco3)，實驗動物使用許可證號為：syxk(浙)2012-0171。飼養管理符合國際aaalac認證的要求。實驗藥物樣品去壁靈芝孢子粉，褐色粉末，批號為16042301，溶于超純水中，常溫干燥保存，由浙江壽仙谷醫藥股份有限公司，2016年05月10日接收。臨用前用超純水配制，現配現用。硫酸長春新堿，白色粉末，lot#k1306055，購于阿拉丁，陰涼柜保存。臨用時用二甲基亞砜(dmso)配制成5mm母液，最終工作液中dmso濃度為0.1％。順鉑，黃色粉末，lot#k1520124，購于阿拉丁，陰涼柜保存。臨用時用二甲基亞砜(dmso)配制成50mm母液，最終工作液中dmso濃度為0.1％。儀器與試劑電動聚焦連續變倍熒光顯微鏡(az100，nikon公司)；解剖顯微鏡(szx7，olympus，japan)；與顯微鏡相連的相機(tk-c1481ec)；精密電子天平(cp214，奧豪斯)；6孔板(nestbiotech)；甲基纖維素(aladdin,shanghai,china)。實施例5去壁靈芝孢子粉、顆粒抗胃癌作用評價1.濃度組別實驗1組模型對照組實驗2組陽性對照藥順鉑50μm實驗3組樣品28μg/ml實驗4組樣品83μg/ml實驗5組樣品250μg/ml2.濃度確定依據樣品在35℃的mtc均為250μg/ml；根據項目方案，樣品抗腫瘤評價濃度設置為：28μg/ml(1/9mtc)、83μg/ml(1/3mtc)和250μg/ml(mtc)。3.模型制作用紅色熒光染料(cm-dil)標記人胃癌(sgc-7901)細胞，以顯微注射的方式移植到斑馬魚卵黃囊內，每尾移植約200個細胞，建立斑馬魚人胃癌移植瘤模型。4.實驗方法4.1確定最大耐受濃度(mtc)隨機選取野生型ab品系斑馬魚于六孔板中，分別水溶給予樣品，濃度均分別為10、100、250、500、1000和2000μg/ml，同時設置正常對照組。供試品處理期間，每天對死亡的斑馬魚計數并移除死魚；供試品處理斑馬魚2天后，觀察記錄斑馬魚的運動狀態和死亡情況，確定供試品對斑馬魚的mtc。4.2樣品去壁靈芝孢子粉抗胃癌作用評價使用cm-dil標記人胃癌(sgc-7901)細胞，以顯微注射的方式移植到2dpf野生型ab品系斑馬魚卵黃囊內，每尾移植約200個細胞，建立斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植模型；將注射了sgc-7901細胞的斑馬魚放置于35℃培養至3dpf。在顯微鏡下挑選出移植腫瘤細胞一致性較好的斑馬魚，隨機分配至6孔板中，以水溶給藥方法分別給予樣品28、83和250μg/ml濃度，陽性對照藥順鉑50μm濃度，同時設置模型對照組，每孔(濃度組)30尾斑馬魚，每孔容量為5ml。將各實驗(濃度)組斑馬魚繼續置于35℃培養，2天后，每個實驗(濃度)組隨機選10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下進行觀察、拍照并保存圖片；利用尼康nis-elementsd3.10高級圖像處理軟件進行圖像分析，計算癌細胞熒光強度，以熒光強度分別評價樣品對斑馬魚胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用，并用以下公式計算腫瘤抑制作用。根據移植瘤的生長抑制作用繪制濃度效應曲線；統計學分析采用方差分析和dunnett’st-檢驗，p<0.05為顯著性差異；提供具有代表性的實驗圖譜。特別說明：野生型ab系斑馬魚本身并不產生紅色熒光，cm-dil標記的細胞注射到斑馬魚卵黃囊后，在一定波長下能激發產生紅色熒光，熒光強度總和與癌細胞的數量成正相關，熒光強度總和越大，癌細胞數量越多。5.實驗結果5.1mtc根據表2，樣品在500μg/ml到1000μg/ml濃度范圍內斑馬魚均出現死亡；因此確定樣品對斑馬魚的mtc為250μg/ml，評價實驗濃度均選取28μg/ml(1/9mtc)、83μg/ml(1/3mtc)和250μg/ml(mtc)。表2.供試品“濃度-死亡率”統計表5.2樣品去壁靈芝孢子粉抗胃癌作用評價陽性對照藥順鉑在50μm濃度下斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤細胞熒光強度值總和為237655像素，與模型對照組比較(368978像素)p<0.001，腫瘤抑制作用為36％，顯示順鉑對斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤的生長有明顯抑制作用。樣品在28、83和250μg/ml的濃度下斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤細胞熒光強度值總和分別為173669、126373和83004像素，與模型對照組比較p<0.001&p<0.001&p<0.001，腫瘤抑制作用分別為53％、66％和78％。詳見表3、圖1、圖2和圖3。表3.樣品對斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用(n＝10)注：與模型對照組比較，*p<0.05，***p<0.001實施例6去壁靈芝孢子粉、顆粒抗淋巴癌作用評價1.濃度組別實驗1組模型對照組實驗2組陽性對照藥長春新堿5μm實驗3組樣品28μg/ml實驗4組樣品83μg/ml實驗5組樣品250μg/ml2.濃度確定依據同實施例5。3.模型制作用紅色熒光染料(cm-dil)標記人淋巴癌(ramos)細胞，以顯微注射的方式移植到斑馬魚卵黃囊內，每尾移植約200個細胞，建立斑馬魚人淋巴癌移植瘤模型。4.實驗方法使用cm-dil標記人淋巴癌(ramos)細胞，以顯微注射的方式移植到野生型ab品系2dpf斑馬魚卵黃囊內，每尾移植約200個細胞，建立斑馬魚人淋巴癌移植模型；將注射了人淋巴癌細胞的斑馬魚放置于35℃培養至3dpf。在顯微鏡下挑選出移植腫瘤細胞一致性較好的斑馬魚，隨機分配至6孔板中，以水溶給藥方法分別給予樣品28、83和250μg/ml濃度，陽性對照藥長春新堿5μm濃度，同時設置模型對照組，每孔(濃度組)30尾斑馬魚，每孔容量為5ml。將各實驗組斑馬魚繼續置于35℃培養，2天后，每個實驗組隨機選10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下進行觀察、拍照并保存圖片；利用尼康nis-elementsd3.10高級圖像處理軟件進行圖像分析，計算癌細胞熒光強度，以熒光強度評價樣品對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用，并用以下公式計算腫瘤抑制作用。根據移植瘤的生長抑制作用繪制濃度效應曲線；統計學分析采用方差分析和dunnett’st-檢驗，p<0.05為顯著性差異；提供具有代表性的實驗圖譜。特別說明：野生型ab系斑馬魚本身并不產生紅色熒光，cm-dil標記的細胞注射到斑馬魚卵黃囊后，在一定波長下能激發產生紅色熒光，熒光強度總和與癌細胞的數量成正相關，熒光強度總和越大，癌細胞數量越多(lietal.2011)。5.實驗結果陽性對照品長春新堿在5μm濃度下對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤細胞熒光強度為153919像素，與模型對照組比較(228110像素)p<0.001，腫瘤抑制作用為33％，顯示長春新堿對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤的生長有明顯抑制作用。樣品在28、83和250μg/ml的濃度下對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤細胞熒光強度值總和分別為40284、40166和37884像素，與模型對照組比較，3個濃度組p均<0.001，腫瘤抑制作用為82％、82％和83％。詳見表4、圖4、圖5和圖6。表4.樣品去壁靈芝孢子粉對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用(n＝10)注：與模型對照組比較，***p<0.001實施例7去壁靈芝孢子粉、顆粒抗肺腺癌作用評價1.濃度組別實驗1組模型對照組實驗2組陽性對照藥順鉑50μm實驗3組樣品28μg/ml實驗4組樣品83μg/ml實驗5組樣品250μg/ml2.濃度確定依據同實施例5。3.模型制作用紅色熒光染料(cm-dil)標記人肺腺癌(a549)細胞，以顯微注射的方式移植到斑馬魚卵黃囊內，每尾移植約200個細胞，建立斑馬魚人肺腺癌移植瘤模型。4.實驗方法使用cm-dil標記人肺腺癌(a549)細胞，以顯微注射的方式移植到野生型ab品系2dpf斑馬魚卵黃囊內，每尾移植約200個細胞，建立斑馬魚人肺腺癌(a549)移植模型；將注射了a549細胞的斑馬魚放置于35℃培養至3dpf。在顯微鏡下挑選出移植腫瘤細胞一致性較好的斑馬魚，隨機分配至6孔板中，以水溶給藥方法分別給予樣品樣品28、83和250μg/ml濃度，陽性對照藥順鉑50μm濃度，同時設置模型對照組，每孔(濃度組)30尾斑馬魚，每孔容量為5ml。將各實驗(濃度)組斑馬魚繼續置于35℃培養，2天后，每個實驗(濃度)組隨機選10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下進行觀察、拍照并保存圖片；利用尼康nis-elementsd3.10高級圖像處理軟件進行圖像分析，計算癌細胞熒光強度，以熒光強度評價樣品對斑馬魚肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用，并用以下公式計算腫瘤抑制作用。根據移植瘤的生長抑制作用繪制濃度效應曲線；統計學分析采用方差分析和dunnett’st-檢驗，p<0.05為顯著性差異；提供具有代表性的實驗圖譜。特別說明：野生型ab系斑馬魚本身并不產生紅色熒光，cm-dil標記的細胞注射到斑馬魚卵黃囊后，在一定波長下能激發產生紅色熒光，熒光強度總和與癌細胞的數量成正相關，熒光強度總和越大，癌細胞數量越多(lietal.2011)。5.實驗結果陽性對照藥順鉑在50μm濃度下對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤細胞熒光強度值總和為137287像素，與模型對照組比較(203330像素)p<0.001，腫瘤抑制作用為32％，顯示順鉑對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤的生長有明顯抑制作用。樣品在28、83和250μg/ml的濃度下對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤細胞熒光強度值總和分別為161737、147640和140415像素，與模型對照組比較，28μg/ml組p<0.05，腫瘤抑制作用分別為20％；83μg/ml組p<0.01，腫瘤抑制作用為27％；250μg/ml組p<0.001，腫瘤抑制作用為31％。詳見表5、圖7、圖8和圖9。表5.樣品去壁靈芝孢子粉對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用(n＝10)注：與模型對照組比較，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001試驗結果表明：本實驗濃度條件下，本發明的去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人胃癌移植瘤、人肺腺癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤均有抑制作用，其中對斑馬魚人胃癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤的抑制作用較強。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁12