本發明屬于復合生物材料制備領域，具體涉及一種胎盤干細胞復合殼聚糖組織修復材料的制備方法。
背景技術：
近年來，具有增殖和分化潛能的干細胞己經成為皮膚組織工程中好的種子細胞。胚胎干細胞在皮膚組織工程中應用研究，為構建組織工程皮膚在皮膚損傷修復的應用提供了理論依據。但是胚胎干細胞在醫學應用上存在道德倫理問題和致瘤性等限制因素，而具有多向分化潛能的多能干細胞一一間充質干細胞(mesenchymalstemcells，mscs)作為良好的種子細胞，在皮膚組織工程研究中倍受關注。以往的研究主要是集中于骨髓來源的bmscs但bmscs需要通過骨髓穿刺而獲得，且數量隨年齡增長而下降，這都限制了bmscs的應用，且支架材料的選擇和應用一直影響該技術發展的重要難題。
技術實現要素：
根據現有技術中存在問題，本發明采用新生兒娩后“廢棄物”的胎盤組織獲取cmscs，并選用殼聚糖材料作為支架材料，制得胎盤干細胞復合殼聚糖組織修復材料。
本發明采用以下技術方案：
一種胎盤干細胞復合殼聚糖組織修復材料的制備方法，包括以下步驟：
步驟一：機械剝除胎盤羊膜組織，將剝離后剩下的絨毛組織，過質量濃度75％的酒精，再用pbs沖洗洗盡血漬，并將其剪成1mm2小塊后，浸沒于含有質量濃度0.1％的iv型膠原酶的低糖基礎培養基(l-dmem)中，37℃消化15-45分鐘,得細胞組織液；
步驟二：細胞組織液經200目篩網過篩后轉移至干凈的離心管，1200rpm離心lomin，棄上清液后接種于含有質量濃度10％的胎牛血清的低糖基礎培養基(l-dmem)中，于37℃、5％co2的培養箱中培養5天后進行第一次換液，隨后每隔兩天進行換液，待細胞融合至90％使用質量濃度0.25％的胰酶進行消化，得胎盤絨毛膜來源間充質干細胞(cmscs)；
步驟三：稱取0.2g殼聚糖，溶于40ml去離子水中，配制質量體積比為20％的殼聚糖溶液，另加入0.32g氯化鈉晶體及0.5ml冰醋酸，調節ph至5.0混合攪拌均勻得殼聚糖溶液；
步驟四：稱取8g明膠，溶于40m1去離子水中，充分振蕩后將溶液置于50℃水浴箱，待溶解后轉入培養皿中，放入4℃冰箱，凝固后得固體凝膠；
步驟五：將殼聚糖溶液加入固體凝膠表面，浸泡5-7分鐘，然后移出殼聚糖溶液，再加入清水浸泡1分鐘，每浸泡一次殼聚糖溶液為1層，共做15層；將固體凝膠取出，放入裝有37℃水的容器中，隨著明膠基底逐漸熔化，其表面有薄膜析出，即得殼聚糖納米膜；
步驟六：取生長狀況良好的胎盤絨毛膜來源間充質干細胞(cmscs)接種于殼聚糖納米膜上，接種時間為2-12h，即得胎盤干細胞復合殼聚糖組織修復材料。
優選的，所述的步驟一還包括：將剝離后剩下的絨毛組織制成面積為10cm2。
優選的，步驟一中所述的pbs中含有質量濃度0.1％的青-鏈霉素。
優選的，所述的步驟五還包括：將殼聚糖納米膜冷凍干燥，并置于24孔板中，于放射co60輻射消毒。
優選的，所述的步驟五中浸泡均在20℃室內環境下進行。
本發明的有益效果在于：
1)胎盤絨毛膜來源間充質干細胞(cmscs)具有較強的增殖、分化能力，且取材的便利，不涉及社會倫理等問題的優勢，其作為種子細胞在皮膚組織工程中具有極大的運用前景。
2)殼聚糖被視為細胞支架材料并廣泛運用在組織工程領域。殼聚糖是一種來源于海洋蟹類生物的天然多糖，生物相容性好，可降解，無毒性而且有其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等均具有一定的抗菌效果。對細胞的粘附、遷移有促進作用。
3)本發明制得的組織修復材料，可以加快皮膚修復，具有優良的組織修復的功效。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
一種胎盤干細胞復合殼聚糖組織修復材料的制備方法，包括以下步驟：
步驟一：機械剝除胎盤羊膜組織，將剝離后剩下的絨毛組織制成面積為10cm2，過質量濃度75％的酒精，再用含有質量濃度0.1％的青-鏈霉素的pbs沖洗洗盡血漬，并將其剪成1mm2小塊后，浸沒于含有質量濃度0.1％的iv型膠原酶的低糖基礎培養基(l-dmem)中，37℃消化15-45分鐘,得細胞組織液；
步驟二：細胞組織液經200目篩網過篩后轉移至干凈的離心管，1200rpm離心lomin，棄上清液后接種于含有質量濃度10％的胎牛血清的低糖基礎培養基(l-dmem)中，于37℃、5％co2的培養箱中培養5天后進行第一次換液，隨后每隔兩天進行換液，待細胞融合至90％使用質量濃度0.25％的胰酶進行消化，得胎盤絨毛膜來源間充質干細胞(cmscs)；
步驟三：稱取0.2g殼聚糖，溶于40ml去離子水中，配制質量體積比為20％的殼聚糖溶液，另加入0.32g氯化鈉晶體及0.5ml冰醋酸，調節ph至5.0混合攪拌均勻得殼聚糖溶液；
步驟四：稱取8g明膠，溶于40m1去離子水中，充分振蕩后將溶液置于50℃水浴箱，待溶解后轉入培養皿中，放入4℃冰箱，凝固后得固體凝膠；
步驟五：于20℃室內環境下，將殼聚糖溶液加入固體凝膠表面，浸泡5-7分鐘，然后移出殼聚糖溶液，再加入清水浸泡1分鐘，每浸泡一次殼聚糖溶液為1層，共做15層；將固體凝膠取出，放入裝有37℃水的容器中，隨著明膠基底逐漸熔化，其表面有薄膜析出，即得殼聚糖納米膜，將殼聚糖納米膜冷凍干燥，并置于24孔板中，于放射co60輻射消毒；
步驟六：取生長狀況良好的胎盤絨毛膜來源間充質干細胞(cmscs)接種于消毒后的殼聚糖納米膜上，接種時間為2-12h，即得胎盤干細胞復合殼聚糖組織修復材料。
取200g左右sd大鼠12只，將sd大鼠麻醉后造模處理，背部剃毛消毒滅菌后，剪開5cm直徑大小圓形皮膚缺損創面，將實施例制得的胎盤干細胞復合殼聚糖組織修復材料植入其中，得實驗組；空白對照組在相同創面處，覆蓋凡士林紗布。于術后每天觀察創面情況，并于30天后進行組織切片he染色，將實驗組、空白組進行比較。
實驗結果顯示，與未加入任何材料的空白對照組相比，本發明制得的胎盤干細胞復合殼聚糖組織修復材料能夠更好更快的修復大鼠皮膚損傷。手術5天后，實驗組大鼠背部創面傷口縫線處己經愈合，創面干燥，無分泌物。lod后，實驗組大鼠的創面基本愈合，創口伴有鮮紅色的肉芽組織生成，空白對照組創面可見大量膿性分泌物。30天后，實驗組的大鼠創面面積縮小，創面完全愈合，創面處己生長毛發，與周圍皮膚幾乎融為一體；空白對照組創面結癡，暗紅色血塊，皮膚未修復完成。