本發明涉及醫用納米生物材料
技術領域：
：，尤其是涉及一種用于腫瘤高效治療的凝膠材料及其制備方法。
背景技術：
：：近年來，我國惡性腫瘤的發病率呈逐年上升的趨勢，嚴重危害到人類的健康。當前腫瘤的主要治療方法即為創傷性外科手術和化療，目前的效果往往不僅未能有效抑制癌癥死亡率，其長期治療的毒副作用還會造成患者機體功能急劇下降，導致醫源性、藥源性疾病激增，治療本身造成患者新的身心創傷甚至殘疾。怎樣實現更加安全、有效的腫瘤治療已成為一項重大的社會問題，也是材料、化學、生物、臨床、工程等多學科科研工作者們所共同面對的亟待突破的難題。近年來，研究人員逐漸認識到，腫瘤與細胞外基質(ecm)、血管、結締組織以及其環境中的免疫細胞，即腫瘤微環境(tme)緊密相關，直接關系著腫瘤的生長、侵襲和轉移行為。基于與正常組織的差異對生物體微環境進行研究，如不同的血管異常、氧化狀態、ph值和代謝狀態等，已然成為提出相應最優治療策略的先決條件。這些特異性變化在生物機制研究、藥物篩選及許多疾病，尤其是腫瘤的診斷和治療發揮著關鍵作用。活性氧組分(ros)是所有生物系統微環境中氧代謝的活性衍生物，也是免疫系統應對感染、刺激或損傷的第一響應，與許多疾病，包括癌癥、炎癥反應、動脈粥樣硬化、哮喘和囊性纖維化等密切相關。一般主要包括過氧化氫(h2o2)、超氧自由基(·o2-)、羥基自由基(·oh)、單線態氧(1o2)以及過氧自由基(roo˙)和次氯酸/次氯酸根離子(hocl/-ocl)等。生物醫學和納米技術的研究開發出一系列納米探針和載體材料去響應性檢測異常高水平的ros，最終實現病變組織部位的響應性治療研究。首先，在成像檢測方面，由于h2o2組分較高的穩定性和含量(可達50-100μm)成為探針設計的最主要基礎成分。奧塔哥大學的winterbourn教授和加利福利亞大學的changcj教授(winterbourn,c.c.,reconcilingthechemistryandbiologyofreactiveoxygenspecies.natchembiol2008,4,278-286)、長春應化所謝志剛教授(chen,x.q.；wang,f.；hyun,j.y.；wei,t.w.；qiang,j.；ren,x.t.；shin,i.；yoon,j.,recentprogressinthedevelopmentoffluorescent,luminescentandcolorimetricprobesfordetectionofreactiveoxygenandnitrogenspecies.chemsocrev2016,45,2976-3016.)、韓國梨花女子大學juyoungyoon和injaeshin教授(miller,e.w.；tulyanthan,o.；isacoff,e.y.；chang,c.j.,molecularimagingofhydrogenperoxideproducedforcellsignaling.natchembiol2007,3,263-267.)等研究者課題組基于h2o2誘導硼化物價鍵氧化降解的機理(phenylboronate-to-phenoltransformation)，設計硼化物共軛的熒光素與h2o2反應斷開，導致熒光素發光行為或聚集狀態發生變化，最終成功實現生物體病變部位響應性熒光檢測；其次，在響應性治療方面，北卡羅萊納大學教堂山分校guzheng教授(hu,x.；yu,j.；qian,c.；lu,y.；kahkoska,a.r.；xie,z.；jing,x.；buse,j.b.；gu,z.,h2o2-responsivevesiclesintegratedwithtranscutaneouspatchesforglucose-mediatedinsulindelivery.acsnano2017,11,613-620.)、南京大學郭子健教授課題組(chen,h.c.；tian,j.w.；he,w.j.；guo,z.j.,h2o2-activatableando2-evolvingnanoparticlesforhighlyefficientandselectivephotodynamictherapyagainsthypoxictumorcells.jamchemsoc2015,137,1539-1547.)、清華大學許華平教授、喬治亞理工學院夏幼南教授(shim,m.s.；xia,y.n.,areactiveoxygenspecies(ros)-responsivepolymerforsafe,efficient,andtargetedgenedeliveryincancercells.angewchemintedit2013,52,6926-6929.)等課題組主要集中研究通過病變部位富集的高水平ros誘導載體材料中硼酸基、硫醚類及硒類等功能化分子發生氧化水解反應，實現材料直接解離或親疏水狀態變化導致的解組裝，實現治療性藥物、蛋白及基因的釋放而達到響應性治療效果，或利用h2o2增強氧含量而響應性增強光動力學(pdt)治療研究。由于ros本身特殊的病理信息指示特性，國內外研究者對其響應性體系的設計、制備及其性能研究進行了廣泛研究。此外，針對腫瘤的養分葡萄糖設計制備腫瘤治療的材料也是成為研究的熱點。最近，美國nih的陳小元教授課題組(wenpeifan,nanlu,penghuang,yiliu,zhenyang,shengwang,guocanyu,yijingliu,junkaihu,qianjunhe,junlequ,tianfuwang,xiaoyuanchen.glucose-responsivesequentialgenerationofhydrogenperoxideandnitricoxideforsynergisticcancerstarving-like/gastherapy.angewchemintedit2016,doi:10.1002/anie.201610682.)利用空心介孔二氧化硅材料裝載葡萄糖氧化酶，利用材料在腫瘤部位消耗葡萄糖轉化為葡萄糖酸和過氧化氫，切斷腫瘤賴以生長的能量供應，達到“餓死”腫瘤的目的。由于藥物載體本身限制和微環境成分的不穩定性，其體內循環過程中擔載藥物的泄漏及到達靶向區的響應性釋放不完全仍然是限制體內響應性治療的關鍵因素。因此，開發新的診療體系實現更加安全和高效的病變微環境響應性檢測治療是腫瘤診療研究的迫切需要。技術實現要素：本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種用于腫瘤高效治療的凝膠材料及其制備方法。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：一種用于腫瘤高效治療的凝膠材料，由微觀有機-無機雜化納米凝膠載體，以及擔載在所述微觀有機-無機雜化納米凝膠載體上的生物酶組分組成，所述的微觀有機-無機雜化納米凝膠載體包括無機納米顆粒內核，以及復合在所述無機納米顆粒內核表面的有機凝膠層，其中，所述的有機凝膠層由成膠因子在無機納米顆粒內核表面沉積自組裝而成，所述的成膠因子為n-(9-芴甲氧羰酰基)(fmoc-)或萘環基團(nap-)功能化的小分子多肽(由2～4個氨基酸分子構成，分子量一般在180～480道爾頓)。作為優選的實施方案，所述的生物酶組分為超氧岐化酶和/或葡萄糖氧化酶，與過氧化物酶的復合，其中，所述的過氧化物酶選自過氧化氫酶、氯過氧化物酶、礬過氧化物酶或髓過氧化物酶。作為優選的實施方案，所述的無機納米顆粒內核選自介孔氧化硅、超順磁四氧化三鐵、金納米棒或氧化鉬。分別通過溶膠-凝膠法、高溫熱解法、種子生長法和濕化學法等制備粒徑及表面特性可控的介孔氧化硅、超順磁四氧化三鐵、金納米棒及氧化鉬moox等無機納米顆粒。用于腫瘤高效治療的凝膠材料的制備方法，包括以下步驟：(1)取無機納米顆粒內核分散于溶劑中，加入改性劑，改性處理，使無機納米顆粒內核表面帶有乙烯基、氨基、羧基或巰基，得到改性納米顆粒內核；(2)取改性納米顆粒內核，加入酸性磷酸酶，在edc和nhs的催化反應下發生酰胺反應，最終表面接枝酸性磷酸酶，得到負載酸性磷酸酶的納米內核；(3)將步驟(2)制得的負載酸性磷酸酶的納米內核加入帶磷酸根功能化的fmoc-或nap-功能小分子多肽溶液中，超聲分散，即得到納米凝膠溶液；(4)再取步驟(3)制得的納米凝膠溶液分散于緩沖溶液中，加入生物酶組分，置于黑暗環境下攪拌，即得到目的產物。作為優選的實施方案，步驟(1)中所述的改性納米顆粒內核為羧基功能化的納米顆粒內核；所述的溶劑為乙醇和去離子水按體積比1:1配置的混合液，所述的改性劑為aptes，無機納米顆粒內核、溶劑和改性劑三者的添加量之比為100mg：140-180ml：4-8ml。作為上述優選的實施方案更優選，所述的改性劑為氨基硅烷、n-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺、丁二酸酐和/或巰基peg，其中，無機納米顆粒內核的氨基化改性處理具體為：取無機納米顆粒內核(優選為msn，即介孔二氧化硅)分散于溶劑中，加入氨基硅烷aptes，加熱攪拌反應，離心收集沉淀物，洗滌，即得到氨基功能化改性納米顆粒內核，分散于乙醇中備用；無機納米顆粒內核的羧基化改性處理具體為：取氨基功能化改性納米顆粒內核分散于dmf和琥珀酸酐的混合溶液中，再加入三乙胺，攪拌反應，分離產物，洗滌，即得到羧基功能化改性納米顆粒內核；無機納米顆粒內核的乙烯基化改性處理具體為：取氨基功能化改性納米顆粒內核與n-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺反應，即得到乙烯基功能化改性納米顆粒內核；無機納米顆粒內核的peg功能化改性處理具體為：取無機納米顆粒內核(優選為金納米棒)與巰基peg反應，即得到peg功能化改性無機納米顆粒內核。所述的改性處理為羧基化改性處理，其通過以下方法制成：以100mg無機納米顆粒內核計，加入aptes后，在n2保護下，于60-80℃加熱攪拌反應20-30h，清洗初步反應產物，得到表面氨基化的無機納米顆粒內核，再分散于100mldmf中，加入8-12wt％的丁二酸酐，攪拌反應16-20h，清洗，得到表面羧基功能化的納米顆粒內核，分散于20ml去離子水中，得到羧基化納米顆粒內核溶液備用；或通過以下方法制成：以100mg無機納米顆粒內核計，分散于150ml異丙醇中，再于70℃下攪拌回流0.5h，待溫度穩定后，加入150μl氨基硅烷aptes，混合物在70℃下適度攪拌8小時，離心收集沉淀物，用乙醇洗滌，得到氨基功能化的無機納米顆粒內核，分散于50ml的乙醇中備用；再將氨基功能化的無機納米顆粒內核溶液滴加到無水琥珀酸酐的dmf溶液中(50mg無水琥珀酸酐溶于20mldmf)，攪拌24h，分離得到沉淀物，用乙醇和水洗滌，即得到羧基化納米顆粒內核，分散于20ml去離子水中備用。作為上述更優選實施方案的進一步優選，步驟(2)中酸性磷酸酶的接枝為：先采用edc/nhs活化羧基化納米顆粒內核溶液，再加入酸性磷酸酶溶液，攪拌反應，即得到負載酸性磷酸酶的納米內核。此步驟的作用主要為通過edc/nhs活化表面帶有大量羧基的納米顆粒內核，使其變為活化酯，進而實現酸性磷酸酶的負載。酸性磷酸酶的接枝具體工藝可優選為：以2ml制得的羧基化納米顆粒內核溶液計，取2ml羧基化納米顆粒內核溶液超聲分散于30-50ml20mmph5.8的磷酸鹽緩沖液中，加入160-250mgedc和160-250mgnhs，攪拌反應1-3小時，磁分離，清洗，再分散于16-24ml0.8-1.2mg/l的酸性磷酸酶溶液中，攪拌反應1-3h，分離，清洗，得到負載酸性磷酸酶的納米內核，分散于10ml去離子水中并在4℃保存。作為上述進一步優選實施方案的更進一步優選，步驟(3)中優選的工藝為：取負載酸性磷酸酶的納米內核超聲分散于濃度0.3-0.7mg/ml的帶磷酸根功能化的fmoc-或nap-功能小分子多肽溶液中，攪拌，分離除去未反應物質，清洗，得到納米凝膠，分散于去離子水中備用。此步驟的作用是以負載酸性磷酸酶的納米內核為核，通過磷酸鎂的酶切作用除去帶磷酸根功能化的fmoc-或nap-功能小分子多肽中的磷酸根，使其由親水性變為疏水性，然后，除去磷酸根的fmoc-或nap-功能小分子多肽因疏水性聚集，然后因為芳香族苯環間的π-πstacking作用在納米內核上自組裝，形成一層具有優良生物特性的小分子凝膠。fmoc-或nap-功能小分子多肽可優選為fmoc-tyr-oh，其磷酸功能化后為fmoc-tyr(h2po3)-oh。其中，本發明的fmoc功能多肽小分子優選通過以下方法制成：向攪拌的fmoc-lys-oh(368.44mg，1mmol)在水溶液，nahco3和thf(8/2,10ml)的混合物中的溶液中加入滴加用四氫呋喃稀釋的丙烯酰氯(160μl，1.97mmol)。將混合物在室溫下攪拌4小時，用乙酸乙酯萃取，用hcl洗滌以除去殘余的fmoc-lys-oh，然后用hcl，h2o和飽和氯化鈉洗滌，用旋轉蒸發器除去溶劑，干燥真空，得到產物，為白色(或無色)固體(fmoc功能多肽小分子)。nap功能多肽小分子則優選以下方法制成：6-丙烯酰胺基-2(2-(2-(2-(萘-2-基)乙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)-3-苯基丙酰胺基)己酸(napffk-丙烯酸)和2-(萘-2-基)通過標準固相肽合成(spps)在2-氯三苯甲基氯樹脂上首先合成了乙酰-(l)-phe-(l)-phe-(l)-lys(napffk)，通過連續偶聯fmoc-保護的l-氨基酸(nap功能多肽小分子)。作為上述更進一步優選的更優選，一次膠結構的納米凝膠還可以酶誘導自由基聚合高分子二次交聯即為“一次膠發生二次聚合反應”：以100mg10mmn，n-二甲基丙烯酰胺為單體，加入到一次膠中并攪拌2h，在35℃加入20mgnhs和50u漆酶(溶于1mltris-hcl中)攪拌，向上述溶液中加入1mgn，n'-雙(丙烯酰)胱氨酸交聯劑，通過加入水將體積調節至20ml，然后再反應4小時，通過離心最終收集得到酶誘導自由基聚合高分子二次交聯的納米凝膠顆粒，分散于去離子水中備用。作為上述更進一步優選的更優選，步驟(4)中的工藝優選為：取制備的納米凝膠溶液(一次膠或二次膠)分散于18-25mmph7-8的tris·hcl緩沖液中，超聲分散，再加入生物酶組分，溶解后置于黑暗環境下攪拌18-30h，利用靜電吸引方法擔載生物酶組分，分離除去未負載的生物酶組分，清洗，即得到目的產物凝膠材料。或者，直接利用氨基改性或羧基改性的納米顆粒內核，與生物酶組分上官能團反應，在edc和nhs的催化反應下發生酰胺反應，最終擔載生物酶組分。本發明設計制備了微觀有機-無機雜化納米凝膠載體，其擔載生物酶組分包括多種/串聯反應酶，通過在腫瘤部位葡萄糖響應特性和腫瘤等病變部位活性氧組分響應性發生高效、串聯的酶催化反應，產生單線態氧，實現高效、安全的治療。與傳統的光動力學治療、聲動力學治療，該治療方法也可被認為是一種新型的酶動力學治療模式。本發明中的微觀有機-無機雜化納米凝膠載體可以為生物酶組分的裝載和固定化提供天然保護，實現高效的響應性酶催化反應。本發明在制備時，利用功能化納米顆粒內核，經過對成膠因子的酶切反應而造成成膠因子的親疏水性的轉變，再通過芳香族功能化多肽成膠分子之間的π-πstacking、靜電吸引以及氫鍵作用力，在無機組分表面實現成膠分子的親疏水沉積自組裝過程，形成具有優良生物特性的小分子多肽一次膠層結構。在此基礎上探索酶誘導自由基聚合高分子二次交聯成膠方法(此酶誘導自由基聚合高分子二次交聯即為“一次膠發生二次聚合反應”)得到更加穩定的功能性有機-無機雜化納米凝膠載體。此外，在凝膠載體上擔載超氧岐化酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、氯過氧化物酶、礬過氧化物酶和髓過氧化物酶等多種串聯酶組分，響應性地與腫瘤病變部位的葡萄糖和活性氧組分發生反應，催化葡萄糖生成葡萄酸和雙氧水，以及催化活性氧組分產生氧氣和雙氧水等，經過后續的過氧化物酶(氯過氧化物酶、礬過氧化物酶和髓過氧化物酶)反應雙氧水產生具有治療作用的單線態氧，同時產生具有超聲成像作用的氧氣等。本發明的功能納米顆粒內核包括介孔二氧化硅納米顆粒、超順磁四氧化三鐵、金納米棒、氧化鉬等，可以分別實現材料多功能的藥物擔載實現化療、磁共振成像實現多模式成像、光聲成像實現多模式成像、產生單線態氧實現增強治療。本發明的凝膠的制備過程中，無機內核表面誘導成膠方法包括對fmoc-或nap-功能小分子多肽的磷酸化修飾，利用磷酸酶響應性剪切作用，實現功能多肽分子從親水態轉變為疏水態，即從溶解狀態到聚集態，利用靜電作用在無機內核表面沉積成一次膠層結構。本發明可以通過調節實驗參數控制微觀凝膠的分散性(通過控制納米內核的大小、分散性，成膠因子的濃度，成膠反應溫度、ph值調節，保證納米凝膠在水溶液中的穩定性，避免表面電荷或納米凝膠之間交聯的影響，控制微觀凝膠的分散性)，通過靜脈注射后體內循環達到腫瘤等病變部位，響應性與活性氧組分酶催化產生氧氣氣泡和雙氧水組分，進一步通過過氧化物酶等與雙氧水反應產生具有治療作用的單線態氧，實現酶新型動力學治療的同時實現響應性腫瘤超聲成像。本發明通過工藝的條件，保證納米凝膠層的可控制備及其高穩定性，實現功能生物酶分子的高效擔載和高的酶催化反應，最終實現高效的治療。本發明的凝膠體系材料在體內循環中擔載的生物酶分子的泄露，不會對生物體產生任何毒性；在腫瘤等病變部位則會通過凝膠層的高效物質傳遞作用，擔載的生物酶分子與外界的ros組分響應性發生酶催化反應，產生具體治療作用的單線態氧組分，實現高效、安全的腫瘤治療效果。與現有技術相比，本發明的凝膠基質載體可以為生物酶組分的裝載和固定化提供天然保護，實現高效的響應性酶催化反應。本發明的響應性酶誘導治療，不僅包括響應性與葡萄糖反應和響應性與活性氧組分酶催化產生單線態氧實現酶誘導治療，還包括產生氧氣氣泡實現酶誘導超聲成像和功能無機納米內核產生的磁共振成像、光聲成像，以及擔載藥物分子產生的化療治療。附圖說明圖1為擔載超氧岐化酶(sod)-氯過氧化物酶(cpo)的功能性有機-無機雜化納米凝膠材料體系制備示意流程圖。圖2-1為功能性有機-無機雜化納米凝膠無機內核及凝膠的掃描照片。圖2-2為功能性有機-無機雜化納米凝膠無機內核及凝膠的透射電鏡照片。圖3-1為sod-cpo自由酶的epr圖譜。圖3-2為功能性有機-無機雜化納米凝膠的epr圖譜。圖4為功能性有機-無機雜化納米凝膠材料與熒光探針dpbf作用后的熒光光譜。圖5為功能性有機-無機雜化納米凝膠材料與hepg2人肝癌細胞共培養后細胞毒性cck8實驗。圖6-1為功能性有機-無機雜化納米凝膠與hepg2人肝癌細胞共培養加入dcfh-da單線態氧探針后的激光共聚焦clsm圖片。圖6-2為功能性有機-無機雜化納米凝膠與hepg2人肝癌細胞共培養加入dcfh-da單線態氧探針后的流式細胞結構分析。圖7-1為功能性有機-無機雜化納米凝膠注入vx2肝腫瘤負載的新西蘭大白兔模型后響應性增強超聲成像結果。圖7-2為功能性有機-無機雜化納米凝膠注入vx2肝腫瘤負載的新西蘭大白兔模型后響應性增強的的灰度值數據圖。具體實施方式下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。下述實施例中，介孔氧化硅、超順磁四氧化三鐵、金納米棒或氧化鉬的制備方法優選如下：分別以有機硅源正硅酸乙酯、表面活性劑十六烷基三甲基氯化銨及堿性催化劑三乙醇胺，采用溶膠-凝膠法制備粒徑可控的介孔氧化硅sio2(l.pan,q.he,j.liu,y.chen,m.ma,l.zhangandj.shi,j.am.chem.soc.,2012,134,5722–5725)；以高溫熱解法，以乙酰丙酮鐵為原料，通過控制反應介質如十二烷基二醇、油酸、油胺等的比例和回流溫度與時間等實驗參數合成6-20nm的疏水性超順磁四氧化三鐵fe3o4納米粒子(sun,s.h.；zeng,h.；robinson,d.b.；raoux,s.；rice,p.m.；wang,s.x.；li,g.x.monodispersemfe2o4(m＝fe,co,mn)nanoparticles.j.am.chem.soc.2004,126,273–279.)；采用經典的種子生長法以氯金酸為金源、硼氫化鈉為還原劑調節反應ph及溫度等參數合成粒徑20-50nm金納米棒aunrs(zhenjiangzhang,limingwang,jingwang,xiumeijiang,xiaohuili,zhijianhu,yingluji,xiaochunwu,andchunyingchenmesoporoussilica-coatedgoldnanorodsasalight-mediatedmultifunctionaltheranosticplatformforcancertreatmentadv.mater.2012,24,1418–1423)；以鉬酸銨為原料，通過控制后續酸溶解、水熱及煅燒過程的參數最后得到粒徑100-300nm的氧化鉬moox無機納米顆粒(lexinsong,mangwang,shuzhenpan,junyang,jiechenandjingyang.molybdenumoxidenanoparticles:preparation,characterization,andapplicationinheterogeneouscatalysis,j.mater.chem.,2011,21,7982-7989)。如圖1所示的制備示意流程，首先采用傳統的熱解法制備四氧化三鐵納米內核(mnps)，氨基化后與丁二酸酐反應得到羧基化的四氧化三鐵mnps-cooh，通過edc/nhs活化再將酸性磷酸酶(ap)接枝在其表面。以mnps@ap作為核，通過磷酸酶的酶切作用除去fmoc-tyr(h2po3)-oh的磷酸根，使小分子fmoc-tyr(h2po3)-oh變為fmoc-tyr-oh，由親水性變為疏水性，fmoc-tyr-oh由于疏水性在fe3o4顆粒表面自組裝，形成一層小分子凝膠。最后將得到的納米凝膠溶液分散于tris·hcl緩沖液中，擔載sod和cpo，得到擔載超氧岐化酶(sod)-氯過氧化物酶(cpo)的功能性有機-無機雜化納米凝膠材料體系。實施例1一種擔載超氧岐化酶(sod)-氯過氧化物酶(cpo)的功能性有機-無機雜化納米凝膠材料體系，具體按照以下步驟：(1)采用傳統的熱解法制備四氧化三鐵納米內核(mnps)100mg，分散在80ml乙醇和80ml去離子水的混合液中，超聲分散30min，加入6mlaptes，70℃加熱攪拌下反應24h，并通入n2。反應完成后，分別用乙醇和去離子水清洗幾次，得到的顆粒為表面氨基化的四氧化三鐵，即mnps-aptes。接著將所得到的mnps-aptes分散在100ml的dmf中，加入10％的丁二酸酐，攪拌反應18h，乙醇和水清洗之后得到表面羧基化的四氧化三鐵mnps-cooh，將mnps-cooh分散在20ml去離子水中備用，最終實現納米內核羧基功能化。(2)經過上述修飾，表面帶有大量的羧基，可先通過edc/nhs活化再將酸性磷酸酶(ap)接枝在其表面。取2ml上述的mnps-cooh超聲分散于40ml20mmph5.8的磷酸鹽緩沖液中，加入200mgedc和200mgnhs，攪拌反應2小時，將mnps-cooh表面羧基活化變為活化酯，磁分離，清洗三次之后得到的納米顆粒再分散于20ml的酸性磷酸酶溶液中(1mg/ml)，攪拌反應2h。磁分離得到mnps@ap納米粒子，去離子水清洗三次，除去表面吸附的ap，清洗后的mnps@ap分散于10ml去離子水中保存在4℃，得到負載酸性磷酸酶的納米內核。(3)以mnps@ap作為核，通過磷酸酶的酶切作用除去fmoc-tyr(h2po3)-oh的磷酸根，使小分子fmoc-tyr(h2po3)-oh變為fmoc-tyr-oh，由親水性變為疏水性，fmoc-tyr-oh由于疏水性在fe3o4顆粒表面自組裝，形成一層小分子凝膠。將上述離心得到的mnps@ap分散于100ml的fmoc-tyr(h2po3)-oh溶液中，濃度為0.5mg/ml，超聲分散后，攪拌一定時間，自組裝完成后磁分離除去未反應的物質，去離子水清洗三次得到納米凝膠，將納米凝膠分散在150ml去離子水中備用，得到表面誘導的一次膠結構。(4)取2ml所制備的納米凝膠溶液分散于8ml20mmph7.4的tris·hcl緩沖液中，超聲分散，再加入1mgsod和0.2mlcpo，溶解后置于黑暗環境下攪拌24h。磁分離除去未負載的sod和cpo，并用去離子水清洗納米凝膠表面吸附的sod和cpo，上清液和清洗液都收集起來，通過bradford和紫外分光光度法分別測定sod和cpo的未負載量，從而得到納米凝膠中的sod和cpo的量，實現生物酶組分的擔載過程。圖2-1和圖2-2分別為上述制得的功能性有機-無機雜化納米凝膠無機內核及凝膠的掃描照片及透射電鏡照片。從圖中可以看出，納米凝膠形貌呈球形，表面光滑，單分散性好，粒徑大約為180nm，而mnps形貌不是很規則，表面粗糙有顆粒感，粒徑大約40nm，很容易團聚，而在表面組裝小分子凝膠后表現出了很好的單分散性。tem圖也能清晰地的看到納米凝膠的核殼結構，中心是黑色的mnps顆粒，外面一層灰色的凝膠層，具有很明顯的核殼結構，凝膠層厚度在干燥狀態下大約是10nm，說明利用酶誘導表面自組裝的方式能有效的制備出小分子納米凝膠，使小分子凝膠由宏觀走向微觀，也為小分子凝膠的應用開辟了新的方向。取實施例1制得的功能性有機-無機雜化納米凝膠進行電子順磁共振測試，測定單線態氧1o2的產生，將200μlsod-cpo自由酶溶液和功能性有機-無機雜化納米凝膠材料溶液(其cpo濃度與自由cpo溶液濃度相同)與捕捉劑2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(temp)混合均勻，再加入50μlnacl(1m)，最后加入50μlh2o2(50mm)，調整溶液體積到500μl后迅速轉移到teol電子順磁共振儀(jesfa200)中測試。圖3-1和圖3-2分別顯示了sod-cpo自由酶和功能性有機-無機雜化納米凝膠(nanogel@sod/cpo)的epr圖譜，可以發現，圖譜中均產生了單線態氧的1:1:1三重特征峰信號，這說明功能性有機-無機雜化納米凝膠材料可以產生單線態氧實現后續的治療。以1,3-二苯基異苯并呋喃(dpbf)為熒光探針，dpbf是已知活性最高的單線態氧捕獲劑之一。單線態氧會進攻dpbf結構中的呋喃環，使之打開，導致其在447nm處的熒光強度降低，通過測定dpbf的熒光強度變化可以測定單線態氧。在比色皿中加入100μlnacl(1m)，100μlh2o2(50mm)，20μldpbf和含有等量cpo的nanogel@sod/cpo和自由sod/cpo，調整體積至1ml，置于熒光分光光度計中，在λex＝403nm，λem＝447nm的條件下測量體系的熒光強度變化。從圖4中可以看出，隨著時間的隨著時間的延長，熒光強度不斷減弱，也證實了nanogel@sod/cpo中的單線態氧的不斷產生。取實施例1制得的功能性有機-無機雜化納米凝膠與hepg2人肝癌細胞共培養后測定細胞毒性cck8實驗。實驗中，以hepg2為細胞模型，在96孔板中配置100μl的細胞懸液。將培養板在培養箱中預培養24h(37℃，5％co2)。向培養板中加入10μl不同的待測物質未擔載生物酶組分的納米凝膠(nanogel)和功能性有機-無機雜化納米凝膠(nanogel@sod/cpo)，再將培養板在培養箱孵育48h。然后向每孔中加入10μlcck8溶液，將培養板在培養箱內孵育1-4h。最后用酶標儀測定450nm處的吸光度值，計算細胞的存活率，其結果如圖5所示。從圖中可以看出，在凝膠材料體系濃度達到291μg/ml，材料對腫瘤細胞產生了極大的殺傷作用，而未負載生物酶組分的納米凝膠在共培養濃度達到1000μg/ml也未產生明顯的毒性作用(細胞存活率90％左右)。這也從體外驗證了材料的響應性酶誘導單線態氧的治療效果。取實施例1制得的功能性有機-無機雜化納米凝膠與hepg2人肝癌細胞共培養后，以dcfh-da作為探針檢測加入材料之后的ros的變化情況。按照1:1000用無血清培養液稀釋dcfh-da，使終濃度為10μm/l。設定細胞濃度為5×105/ml,分別接種在共聚焦皿或六孔板內，待細胞貼壁后，分別加入pbs和功能性有機-無機雜化納米凝膠。共聚焦下采用白光定位細胞，設定反應時間為30min，每間隔3min進行一次激光掃描。當加入dcfh-da探針時設定為0min，以后實時觀察熒光強度。圖6-1和圖6-2分別為其激光共聚焦clsm圖片和流式細胞結構分析。可以發現，隨著材料濃度的增大以及共培養時間的延長，細胞的綠色熒光不斷增強，這也顯示出材料經過響應性反應后，產生了單線態氧組分，同時增強了細胞內部的ros水平，而這又可以進一步增強治療作用單線態氧的生成，這也是該酶動力學治療模式高效性的一個重要原因。最終選定18min為反應平衡狀態進行流式細胞儀檢測，其結果也與熒光的照片相對應。圖7-1和圖7-2分別示出實施例1制成的功能性有機-無機雜化納米凝膠注入vx2肝腫瘤負載的新西蘭大白兔模型后響應性增強超聲成像結果及相應的灰度值數據圖。采用iu-22(探頭5-12mhz,philips,france)研究nanogel和nanogel@sod/cpo的體內超聲成像效果。定量研究所采集的圖像，通過人為限定一個相同大小的區域(roi)，通過計算得到roi中“平均灰度值”的大小來評價。從圖中也可以看出，nanogel@sod/cpo材料中的酶組分發生酶動力學治療的同時，響應性產生氧氣增強超聲成像效果，最終實現了響應性增強成像引導下的增效酶動力學治療。實施例2(1)采用傳統的熱解法制備四氧化三鐵納米內核(mnps)100mg，分散在70ml乙醇和70ml去離子水的混合液中，超聲分散20min，加入4mlaptes，60℃加熱攪拌下反應20h，并通入n2。反應完成后，分別用乙醇和去離子水清洗幾次，得到的顆粒為表面氨基化的四氧化三鐵，即mnps-aptes。接著將所得到的mnps-aptes分散在100ml的dmf中，加入8％的丁二酸酐，攪拌反應16h，乙醇和水清洗之后得到表面羧基化的四氧化三鐵mnps-cooh，將mnps-cooh分散在20ml去離子水中備用，最終實現納米內核羧基功能化。(2)經過上述修飾，表面帶有大量的羧基，可先通過edc/nhs活化再將酸性磷酸酶(ap)接枝在其表面。取2ml上述的mnps-cooh超聲分散于30ml20mmph5.8的磷酸鹽緩沖液中，加入160mgedc和160mgnhs，攪拌反應1小時，將mnps-cooh表面羧基活化變為活化酯，磁分離，清洗三次之后得到的納米顆粒再分散于16ml的酸性磷酸酶溶液中(0.8mg/ml)，攪拌反應1h。磁分離得到mnps@ap納米粒子，去離子水清洗三次，除去表面吸附的ap，清洗后的mnps@ap分散于10ml去離子水中保存在4℃，得到負載酸性磷酸酶的納米內核。(3)以mnps@ap作為核，通過磷酸酶的酶切作用除去fmoc-tyr(h2po3)-oh的磷酸根，使小分子fmoc-tyr(h2po3)-oh變為fmoc-tyr-oh，由親水性變為疏水性，fmoc-tyr-oh由于疏水性在fe3o4顆粒表面自組裝，形成一層小分子凝膠。取上述離心得到mnps@ap分散于100ml的fmoc-tyr(h2po3)-oh溶液中，濃度為0.3mg/ml，超聲分散后，攪拌一定時間，自組裝完成后磁分離除去未反應的物質，去離子水清洗三次得到納米凝膠，將納米凝膠分散在150ml去離子水中備用，得到表面誘導的一次膠結構。(4)取2ml所制備的納米凝膠溶液分散于8ml18mmph7.4的tris·hcl緩沖液中，超聲分散，再加入0.8mgsod和0.1mlcpo，溶解后置于黑暗環境下攪拌18h。磁分離除去未負載的sod和cpo，并用去離子水清洗納米凝膠表面吸附的sod和cpo，上清液和清洗液都收集起來，通過bradford和紫外分光光度法分別測定sod和cpo的未負載量，從而得到納米凝膠中的sod和cpo的量，實現生物酶組分的擔載過程。實施例3(1)采用傳統的熱解法制備四氧化三鐵納米內核(mnps)100mg，分散在90ml乙醇和90ml去離子水的混合液中，超聲分散30min，加入8mlaptes，80℃加熱攪拌下反應30h，并通入n2。反應完成后，分別用乙醇和去離子水清洗幾次，得到的顆粒為表面氨基化的四氧化三鐵，即mnps-aptes。接著將所得到的mnps-aptes分散在100ml的dmf中，加入12％的丁二酸酐，攪拌反應18h，乙醇和水清洗之后得到表面羧基化的四氧化三鐵mnps-cooh，將mnps-cooh分散在20ml去離子水中備用，最終實現納米內核羧基功能化。(2)經過上述修飾，表面帶有大量的羧基，可先通過edc/nhs活化再將酸性磷酸酶(ap)接枝在其表面。取2ml上述的mnps-cooh超聲分散于50ml20mmph5.8的磷酸鹽緩沖液中，加入250mgedc和250mgnhs，攪拌反應3小時，將mnps-cooh表面羧基活化變為活化酯，磁分離，清洗三次之后得到的納米顆粒再分散于24ml的酸性磷酸酶溶液中(1.2mg/ml)，攪拌反應3h。磁分離得到mnps@ap納米粒子，去離子水清洗三次，除去表面吸附的ap，清洗后的mnps@ap分散于10ml去離子水中保存在4℃，得到負載酸性磷酸酶的納米內核。(3)以mnps@ap作為核，通過磷酸酶的酶切作用除去fmoc-tyr(h2po3)-oh的磷酸根，使小分子fmoc-tyr(h2po3)-oh變為fmoc-tyr-oh，由親水性變為疏水性，fmoc-tyr-oh由于疏水性在fe3o4顆粒表面自組裝，形成一層小分子凝膠。取上述離心得到mnps@ap分散于100ml的fmoc-tyr(h2po3)-oh溶液中，濃度為0.7mg/ml，超聲分散后，攪拌一定時間，自組裝完成后磁分離除去未反應的物質，去離子水清洗三次得到納米凝膠，將納米凝膠分散在150ml去離子水中備用，得到表面誘導的一次膠結構。(4)取2ml所制備的納米凝膠溶液分散于8ml25mmph7.4的tris·hcl緩沖液中，超聲分散，再加入1.2mgsod和0.3mlcpo，溶解后置于黑暗環境下攪拌30h。磁分離除去未負載的sod和cpo，并用去離子水清洗納米凝膠表面吸附的sod和cpo，上清液和清洗液都收集起來，通過bradford和紫外分光光度法分別測定sod和cpo的未負載量，從而得到納米凝膠中的sod和cpo的量，實現生物酶組分的擔載過程。實施例4(1)采用傳統的熱解法制備四氧化三鐵納米內核(mnps)100mg，分散在75ml乙醇和75ml去離子水的混合液中，超聲分散30min，加入7mlaptes，75℃加熱攪拌下反應22h，并通入n2。反應完成后，分別用乙醇和去離子水清洗幾次，得到的顆粒為表面氨基化的四氧化三鐵，即mnps-aptes。接著將所得到的mnps-aptes分散在100ml的dmf中，加入11％的丁二酸酐，攪拌反應20h，乙醇和水清洗之后得到表面羧基化的四氧化三鐵mnps-cooh，將mnps-cooh分散在20ml去離子水中備用，最終實現納米內核羧基功能化。(2)經過上述修飾，表面帶有大量的羧基，可先通過edc/nhs活化再將酸性磷酸酶(ap)接枝在其表面。取2ml上述的mnps-cooh超聲分散于35ml20mmph5.8的磷酸鹽緩沖液中，加入180mgedc和180mgnhs，攪拌反應2.5小時，將mnps-cooh表面羧基活化變為活化酯，磁分離，清洗三次之后得到的納米顆粒再分散于20ml的酸性磷酸酶溶液中(1.2mg/ml)，攪拌反應2.5h。磁分離得到mnps@ap納米粒子，去離子水清洗三次，除去表面吸附的ap，清洗后的mnps@ap分散于10ml去離子水中保存在4℃，得到負載酸性磷酸酶的納米內核。(3)以mnps@ap作為核，通過磷酸酶的酶切作用除去fmoc-tyr(h2po3)-oh的磷酸根，使小分子fmoc-tyr(h2po3)-oh變為fmoc-tyr-oh，由親水性變為疏水性，fmoc-tyr-oh由于疏水性在fe3o4顆粒表面自組裝，形成一層小分子凝膠。取上述離心得到的mnps@ap分散于100ml的fmoc-tyr(h2po3)-oh溶液中，濃度為0.6mg/ml，超聲分散后，攪拌一定時間，自組裝完成后磁分離除去未反應的物質，去離子水清洗三次得到納米凝膠，將納米凝膠分散在150ml去離子水中備用，得到表面誘導的一次膠結構。(4)取2ml所制備的納米凝膠溶液分散于8ml20mmph7.4的tris·hcl緩沖液中，超聲分散，再加入0.9mgsod和0.25mlcpo，溶解后置于黑暗環境下攪拌24h。磁分離除去未負載的sod和cpo，并用去離子水清洗納米凝膠表面吸附的sod和cpo，上清液和清洗液都收集起來，通過bradford和紫外分光光度法分別測定sod和cpo的未負載量，從而得到納米凝膠中的sod和cpo的量，實現生物酶組分的擔載過程。實施例5與實施例1相比，絕大部分都一樣，除了步驟(3)制得了表面誘導的一次膠結構后，再經過以下處理得到二次膠，然后，再以二次膠作為生物酶組分的載體：以100mgn，n-二甲基丙烯酰胺(dmaa)(≈10mm)為單體，加入到一次膠中并攪拌2h，在35℃加入20mgnhs和50u漆酶(溶于1mltris-hcl中)攪拌，向上述溶液中加入1mgn，n'-雙(丙烯酰)胱氨酸(bac)交聯劑，通過加入水將體積調節至20ml。然后再反應4小時。通過離心最終收集得到酶誘導自由基聚合高分子二次交聯的納米凝膠顆粒。實施例6與實施例1相比，絕大部分都一樣，除了步驟(3)中所采用的功能多肽小分子為nap功能多肽小分子，其由6-丙烯酰胺基-2(2-(2-(2-(萘-2-基)乙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)-3-苯基丙酰胺基)己酸(napffk-丙烯酸)和2-(萘-2-基)通過標準固相肽合成(spps)。在2-氯三苯甲基氯樹脂上首先合成了乙酰-(l)-phe-(l)-phe-(l)-lys(napffk)，通過連續偶聯fmoc-保護的l-氨基酸。實施例7與實施例1相比，絕大部分都一樣，除了步驟(1)中的羧基化通過以下方法制成：以100mgmsn(介孔二氧化硅)計，分散于150ml異丙醇中，再于70℃下攪拌回流0.5h，待溫度穩定后，加入150μl氨基硅烷aptes，混合物在70℃下適度攪拌8小時，離心收集沉淀物，用乙醇洗滌，得到氨基功能化的msn(介孔二氧化硅)，分散于50ml的乙醇中備用；再將氨基功能化的無機納米顆粒內核溶液滴加到無水琥珀酸酐的dmf溶液中(50mg無水琥珀酸酐溶于20mldmf)，攪拌24h，分離得到沉淀物，用乙醇和水洗滌，即得到羧基化納米顆粒內核，分散于20ml去離子水中備用。上述的對實施例的描述是為便于該
技術領域：
：的普通技術人員能理解和使用發明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創造性的勞動。因此，本發明不限于上述實施例，本領域技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明范疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保護范圍之內。當前第1頁12當前第1頁12