本發明屬于納米藥物領域，具體涉及針對多金屬氧酸鹽作為抗癌藥物的局限性，利用生物相容材料對其進行包裹，從而制備出載多金屬氧酸鹽抗癌納米制劑。

背景技術：

根據世界衛生組織(who)在2016年發布的《globecancer2016》顯示出：癌癥已經成為除心腦血管疾病以外的全球人類死亡的第一因素，發展能夠更加有效地治療癌癥的手段，對促進人類健康具有重大意義。納米藥物的出現，為癌癥治療帶來了新的希望。納米載藥系統是一種新型納米級別的給藥系統，用合成或天然的高分子材料作為載體，利用納米技術對藥物進行包裹或者修飾制得粒徑在10～1000nm的藥物輸送系統。納米載藥系統的載體一般都具有體內長循環和靶向功能，因此，納米載藥系統在癌癥治療的發展中具有重大意義。

用于納米載藥系統的抗癌藥物有多種，如阿霉素、多西紫杉醇等，本發明所用具有抗癌作用的藥物是一種新型無機材料——多金屬氧酸鹽(poms)，它是由前過渡金屬離子通過氧連接而形成的一類多金屬氧簇化合物。它豐富的結構類型和巨大的抗癌潛力使其具有成為高效化療藥物的可能，但其水溶性差且在水相中不穩定，因而限制其在抗癌領域的應用。本發明利用具有生物相容性的材料對其進行包裹，再用靶向分子葉酸對納米載體表面進行修飾，制備出可用于癌癥治療的新型納米制劑，為新一代納米體系發展提供基礎，促進針對腫瘤治療的研究發展。

技術實現要素：

為了克服多金屬氧酸鹽的抗癌應用局限性，本發明提供了一種載多金屬氧酸鹽抗癌納米制劑及其制備方法。

載多金屬氧酸鹽抗癌納米制劑是利用生物材料對多金屬氧酸鹽進行包裹制得納米載體，再用靶向分子葉酸對納米載體表面進行修飾；所用的生物材料為具有生物相容性的pla-peg2000及tpgs-cooh。所用多金屬氧酸鹽(poms)為[eu(h2o)3(p2w17o61)]2。

所述采用的技術方案是利用具有生物相容性的材料，采用單乳超聲法對多金屬氧酸鹽進行包裹，再進行葉酸表面修飾，最終制備出具有體內長循環、療效高、毒副作用小、穩定性好等功能的新型納米制劑。

本發明的具體步驟為：

步驟1、生物材料tpgs-cooh的制備：

1)分別稱取維他命e聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)757mg、n，n-二環己基碳二亞胺(dcc)103mg、戊二酸66mg，備用；

2)將步驟1)稱取的藥品混合溶于10ml二甲基亞砜中，室溫下反應24小時；

3)步驟2)的反應過程會產生n，n-二環己基脲，通過過濾去除該副產物。將濾液轉移進入透析袋，以二甲基亞砜為透析液，透析24小時去除未反應的dcc。冷凍干燥，得到tpgs-cooh；

步驟2、載多金屬氧酸鹽納米載體的制備：

1)配制60ml含有0.5％聚乙烯醇水溶液，作為乳化劑，備用；

2)分別稱取多金屬氧酸鹽25mg、pla-peg200050mg及步驟1所得tpgs-cooh80mg混合溶于4ml的三氯甲烷中，備用；

3)輕柔攪拌下將步驟2)所得溶液緩慢倒入步驟1)的60ml含有0.5％聚乙烯醇水溶液中；

4)利用超聲波細胞粉碎機將步驟3)的混合溶液在25w條件下超聲120s得到乳液，將該乳液在室溫下攪拌過夜蒸發有機溶劑三氯甲烷，得到納米粒子懸浮液；

5)將步驟4)得到的納米粒子懸浮液在離心機上以10500rpm離心15min后得到納米粒子；

6)用蒸餾水洗滌步驟5)得到的納米粒子，并超聲再次打碎，如此反復三次后可得到產物，并將其分散于水中，凍干兩天得到納米粉體。

步驟3、用葉酸對載多金屬氧酸鹽納米載體表面進行修飾：

a、氨基化葉酸(fol-nh2)的制備：

1)分別稱取葉酸(fol)441.4mg、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)230mg、n，n-二環己基碳二亞胺(edc)103mg，備用；

2)將步驟1)稱取的藥品混合溶于30ml二甲基亞砜中，50℃下反應6小時；

3)步驟2)的反應過程中會產生副產物n，n-二環己基脲，通過過濾去除該副產物；

4)在步驟3)所得的濾液中加入過量的乙二胺，以吡啶為催化劑，過夜反應；

5)在步驟4)反應完全的混合溶液中加入大量的乙腈將氨基化葉酸(fol-nh2)沉淀出來，離心收集，真空過濾后，放入真空干燥箱中烘干。

b、用氨基化葉酸(fol-nh2)對載多金屬氧酸鹽納米載體表面進行修飾：

1)稱取步驟2所得的納米粒子10mg分散于5ml蒸餾水中，超聲30分鐘；

2)在步驟1)所得溶液中以摩爾比為tpgs-cooh/edc/nhs＝1∶20∶6.7加入nhs和edc，edc為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫下反應2小時，激活納米粒子表面的羧基端；

3)在步驟2)所得混合溶液中以摩爾比為tpgs-cooh/fol-nh2＝1∶10加入fol-nh2；

4)在步驟3)所得混合溶液中加三乙胺調節ph值至8，37℃下反應4個小時后進行離心；

5)用二甲基亞砜洗滌步驟4)離心得到的混合物，以去除未反應的fol-nh2，然后再用去離子水洗滌。冷凍干燥，得到表面經葉酸修飾的載多金屬氧酸鹽納米制劑。

本發明利用具有生物相容性的材料對多金屬氧酸鹽進行包裹，再進行葉酸表面修飾，制得具有體內長循環、主動靶向、療效高、毒副作用小等功能的新型納米制劑，有效克服多金屬氧酸鹽水溶性差且在水相中不穩定的缺陷，進一步發揮多金屬氧酸鹽的抗癌作用，開闊其在生物領域的應用，為癌癥治療的納米體系發展提供新的思路，促進針對癌癥治療的研究發展。

附圖說明

圖1為制備載多金屬氧酸鹽抗癌納米制劑的過程圖；

圖2為載多金屬氧酸鹽納米粒的sem檢測圖；

如圖所示，多金屬氧酸鹽被生物材料包裹，制備的納米粒子呈橢球狀；

圖3為載多金屬氧酸鹽納米粒的粒徑分布圖；

如圖所示，載多金屬氧酸鹽納米粒粒徑的平均尺寸在174.2nm；

圖4為無葉酸修飾的載多金屬氧酸鹽納米粒細胞毒性數據；

如圖所示，制備出的無葉酸修飾的載多金屬氧酸鹽納米制劑，通過細胞毒性實驗，比較不同劑量不同時長下，癌細胞的存活率雖然呈現出降低趨勢，但總體效果不明顯；

圖5為葉酸修飾的載多金屬氧酸鹽納米粒細胞毒性數據；

如圖所示，制備出經葉酸修飾的載多金屬氧酸鹽納米制劑，通過細胞毒性實驗，比較不同劑量不同時長下，癌細胞的存活率呈現出明顯降低趨勢，且在200μg/ml、24h時達到最低，不足1％；

由圖4、圖5，首先說明本發明所制備的納米制劑具有抗癌作用，二者對比看出經葉酸修飾的納米制劑具有良好的靶向作用，能夠更好地靶向作用于癌細胞。

具體實施方式

下面結合實例對本發明作進一步說明。

實施例1

生物材料tpgs-cooh的制備：

1)分別稱取維他命e聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)757mg、n，n-二環己基碳二亞胺(dcc)103mg、戊二酸66mg，備用；

2)將步驟1)稱取的藥品混合溶于10ml二甲基亞砜中，室溫下反應24小時；

3)步驟2)的反應過程會產生n，n-二環己基脲，通過過濾去除該副產物。將濾液轉移進入透析袋，以二甲基亞砜為透析液，透析24小時去除未反應的dcc。冷凍干燥，得到tpgs-cooh；；

實施例2

載多金屬氧酸鹽納米載體的制備：

1)配制60ml含有0.5％聚乙烯醇水溶液，作為乳化劑，備用；

2)分別稱取多金屬氧酸鹽25mg、pla-peg200050mg及步驟1所得tpgs-cooh80mg混合溶于4ml的三氯甲烷中，備用；

3)輕柔攪拌下將步驟2)所得溶液緩慢倒入步驟1)的60ml含有0.5％聚乙烯醇水溶液中；

4)利用超聲波細胞粉碎機將步驟3)的混合溶液在25w條件下超聲120s得到乳液，將該乳液在室溫下攪拌過夜蒸發有機溶劑三氯甲烷，得到納米粒子懸浮液；

5)將步驟4)得到的納米粒子懸浮液在離心機上以10500rpm離心15min后得到納米粒子；

6)用蒸餾水洗滌步驟5)得到的納米粒子，并超聲再次打碎，如此反復三次后可得到產物，并將其分散于水中，凍干兩天得到納米粉體。

實施例3

用葉酸對載多金屬氧酸鹽納米載體表面進行修飾：

a、氨基化葉酸(fol-nh2)的制備：

1)分別稱取葉酸(fol)441.4mg、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)230mg、n，n-二環己基碳二亞胺(dcc)103mg，備用；

2)將步驟1)稱取的藥品混合溶于30ml二甲基亞砜中，50℃下反應6小時；

3)步驟2)的反應過程中會產生副產物n，n-二環己基脲，通過過濾去除該副產物；

4)在步驟3)所得的濾液中加入過量的乙二胺，以吡啶為催化劑，過夜反應；

5)在步驟4)反應完全的混合溶液中加入大量的乙腈將氨基化葉酸(fol-nh2)沉淀出來，離心收集，真空過濾后，放入真空干燥箱中烘干。

b、用氨基化葉酸(fol-nh2)對載多金屬氧酸鹽納米載體表面進行修飾：

1)稱取步驟2所得的納米粒子10mg分散于5ml蒸餾水中，超聲30分鐘；

2)在步驟1)所得溶液中以摩爾比為tpgs-cooh/edc/nhs＝1∶20∶6.7加入nhs和edc，室溫下反應2小時，激活納米粒子表面的羧基端；

3)在步驟2)所得混合溶液中以摩爾比為tpgs-cooh/fol-nh2＝1∶10加入fol-nh2；

4)在步驟3)所得混合溶液中加三乙胺調節ph值至8，37℃下反應4個小時后進行離心；

5)用二甲基亞砜洗滌步驟4)離心得到的混合物，以去除未反應的fol-nh2，然后再用去離子水洗滌。冷凍干燥，得到表面經葉酸修飾的載多金屬氧酸鹽納米制劑。