本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種包含ips細(xì)胞提取物的抗衰老組合物。
背景技術(shù)：
衰老是機(jī)體各組織、器官功能隨年齡增長而發(fā)生的退行性變化，是機(jī)體各種生化反應(yīng)的綜合表現(xiàn)，是體內(nèi)外許多因素(環(huán)境污染、精神緊張、遺傳等)共同作用的結(jié)果。近半個(gè)多世紀(jì)以來，國際上已經(jīng)提出一系列衰老學(xué)說，為揭開衰老機(jī)制及開發(fā)抗衰老藥物奠定了基礎(chǔ)。除上述具有代表性的自由基學(xué)說、現(xiàn)代前沿研究中的線粒體dna損傷學(xué)說、衰老的端區(qū)學(xué)說外，還有交聯(lián)學(xué)說、生物膜損傷學(xué)說、遺傳程序?qū)W說、染色體突變學(xué)說、差錯(cuò)學(xué)說、免疫學(xué)說、內(nèi)分泌學(xué)說等。這些學(xué)說從研究者所從事的不同學(xué)科角度出發(fā)，對(duì)衰老機(jī)制進(jìn)行了較為深入的探索。目前正逐漸向更深層次的研究方向發(fā)展。與此同時(shí)我們也要清楚的認(rèn)識(shí)到機(jī)體的衰老是一個(gè)復(fù)雜的過程，是由多種因素引起的一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，與多種因素有關(guān)如組織再生性細(xì)胞減少、機(jī)體內(nèi)自由基增加、機(jī)體中毒等，由多種機(jī)制參與發(fā)生，各方機(jī)制/因素綜合作用，在直接造成機(jī)體神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫等各系統(tǒng)的功能損傷與退化的同時(shí)也使神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)功能逐漸衰退，機(jī)體因而逐漸趨于衰老。而衰老過程中引發(fā)的各種老年病又會(huì)加速衰老的進(jìn)程。
抗衰老藥物是一類以提高生命效率(生存時(shí)間與生命活力的總和)為最終目的的藥物，其從多系統(tǒng)、多層次和多階段來發(fā)揮其調(diào)整功能，它能在遺傳學(xué)上所界定的壽限內(nèi)延遲衰老或提高生命質(zhì)量。雖然目前有很多藥物研究都證明能夠延緩衰老，但抗衰老藥物不可亂用。如長期服用多種維生素雖能降低一些疾病的危險(xiǎn)性，但也可能對(duì)另一些疾病有負(fù)面影響；或者且長期大量服用抗衰老藥物會(huì)致中毒及使機(jī)體產(chǎn)生藥物依賴。
中國專利申請(qǐng)(cn105748518a)公開了一種包含脂肪干細(xì)胞提取物的抗衰老組合物，所述的抗衰老組合物由脂肪干細(xì)胞提取物和二甲雙胍組成。但脂肪干細(xì)胞增殖分化能力遠(yuǎn)不及胚胎干細(xì)胞，而胚胎干細(xì)胞由于涉及倫理問題不能廣泛應(yīng)用。
誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，ips)一是通過病毒介導(dǎo)或者其他的方式將多個(gè)多能性相關(guān)的基因?qū)塍w細(xì)胞后，將體細(xì)胞誘導(dǎo)而成的干細(xì)胞，它與胚胎干細(xì)胞類似具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的特性。ips細(xì)胞的出現(xiàn)，在干細(xì)胞研究領(lǐng)域、表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域以及生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域都引起了強(qiáng)烈的反響，這不僅是因?yàn)樗诨A(chǔ)研究方面的重要性，更是因?yàn)樗鼮槿藗儙淼墓饷鞯膽?yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種包含ips細(xì)胞提取物的抗衰老組合物。本發(fā)明抗衰老組合物效果明顯且安全無毒。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種包含ips細(xì)胞提取物的抗衰老組合物，包含ips細(xì)胞提取物，葡多酚和β-胡蘿卜素。
優(yōu)選地，所述ips細(xì)胞提取物，葡多酚和β-胡蘿卜素的質(zhì)量配比為5:1～3:2～4。
優(yōu)選地，所述ips細(xì)胞提取物的制備方法為：
s1.飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備：用2.5ml、0.5％明膠鋪t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶并覆蓋全部底部，37℃培養(yǎng)箱放置45min后，加入37℃預(yù)孵育過10min的細(xì)胞完全培養(yǎng)基13ml，加入細(xì)胞濃度為1.5×105cells/ml，體積為15ml的cf-1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)第二至三天，飼養(yǎng)層細(xì)胞生長密度達(dá)80-90％時(shí)可以接種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；
s2.誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)：將培養(yǎng)獲得的ips細(xì)胞懸液，按體積比1:15～1:25接種到預(yù)鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中于37℃的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
s3.細(xì)胞提取物提取：吸出t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，用pbs清洗2～3次，然后加2～3ml細(xì)胞裂解液溶解細(xì)胞，然后收集到離心管中，離心取上清；取上清液置于透析袋中，以4℃pbs溶液透析8小時(shí)；將透析袋內(nèi)溶液冷凍干燥，保存在-80℃冰箱。
優(yōu)選地，所述ips細(xì)胞提取物的制備方法步驟s1中所用細(xì)胞完全培養(yǎng)基成分為：以dmem/f12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還添加10％胎牛血清，4g/l大豆蛋白，3mm的l-谷氨酰胺，1mm丙酮酸鈉，7.5mg/l甘氨酰丙氨酸，0.5mg/l海藻糖和0.15mg/l葡多酚。
優(yōu)選地，所述葡多酚提取方法為：將葡萄皮和葡萄籽在氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下進(jìn)行破碎后，加入石油醚脫脂，真空抽干后，加入30ml65％乙醇在45℃恒溫水浴鍋中浸提2h，過濾，真空包裝即得。
本發(fā)明抗衰老組合由ips細(xì)胞提取物、葡多酚和β-胡蘿卜素組成。ips細(xì)胞提取中含有豐富的生物活性物質(zhì)，如膠原蛋白、活性肽、生長因子、維生素、礦物質(zhì)以及抗氧化活性酶等，這些物質(zhì)均具有優(yōu)異的抗衰老功能。ips細(xì)胞具有與胚胎干細(xì)胞幾乎完全相似的功能，因此ips細(xì)胞提取物不僅豐富而且對(duì)人體抗原性小，易被人體吸收利用；同時(shí)ips具有無限增殖的性能，并且本發(fā)明培養(yǎng)ips細(xì)胞所用培養(yǎng)基中含有海藻糖和葡多酚，其能夠保護(hù)細(xì)胞并能促進(jìn)細(xì)胞增殖及抗氧化活性物質(zhì)的分泌，這為ips細(xì)胞有效提取物的大量活動(dòng)提供了可能。
本發(fā)明技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)在ips細(xì)胞提取物中加入葡多酚和β-胡蘿卜素能夠有效保護(hù)細(xì)胞提取物成分，并且葡多酚具有抗氧化、抗自由基損傷、抗輻射及保護(hù)血管等生物活性，而β-胡蘿卜除具有抗氧化活性功能外，還與葡多酚具有協(xié)同作用。因此，本發(fā)明抗衰老組合物中各成分相互有機(jī)地結(jié)合在一起，能夠發(fā)揮優(yōu)異的抗衰老功能。
所述抗衰老組合物可經(jīng)配制用于口服給藥的形式。
對(duì)于口服給藥，所述抗衰老組合物可采取諸如片劑或膠囊的形式，所述片劑或膠囊通過常規(guī)方法用藥學(xué)上可接受的賦型劑來制備，所述藥學(xué)上可接受的賦型劑為例如粘合劑(例如，預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉)；或潤濕劑(例如，月桂基硫酸鈉)。可通過本領(lǐng)域公知的方法對(duì)所述片劑進(jìn)行包衣。
用于口服給藥的液體制劑可采取例如溶液劑、糖漿劑或懸浮劑的形式，或者它們可按無水產(chǎn)物形式提供用于在使用前用水或其他適當(dāng)?shù)拿浇槲镏厝堋＿@樣的液體制劑可通過常規(guī)方法用藥學(xué)上可接受的添加劑制備，所述藥學(xué)上可接受的添加劑為例如助懸劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食用脂質(zhì))；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油)；和防腐劑(例如，對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸)。
所述制劑也可根據(jù)需要含有緩沖鹽、矯味劑、著色劑和甜味劑。用于口服給藥的制劑可經(jīng)適當(dāng)?shù)呐渲疲蕴峁┗钚曰衔锏目刂漆尫拧?/p>
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明抗衰老組合物的抗衰老作用明顯，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該抗衰老組合物對(duì)果蠅的半數(shù)存活時(shí)間、平均壽命和最高壽命均有明顯的延長作用。本發(fā)明抗衰老組合物能夠顯著增強(qiáng)d-半乳糖致小鼠亞衰老模型sod的含量、降低lpo和脂褐素的含量，且安全無毒。
具體實(shí)施方式
下面將進(jìn)一步的詳細(xì)說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
本發(fā)明ips細(xì)胞購于上海斯丹塞(干細(xì)胞)生物技術(shù)有限公司，cas號(hào)0210-003；海藻糖購于上海號(hào)雨工貿(mào)有限公司；ⅳ型膠原酶，貨號(hào)m-001。
實(shí)施例1一種包含ips細(xì)胞提取物的抗衰老片劑
所述一種包含ips細(xì)胞提取物的抗衰老片劑，由ips細(xì)胞提取物，葡多酚和β-胡蘿卜素按質(zhì)量配比為5:2:3組成。
所述ips細(xì)胞提取物的制備方法，分為以下步驟：
s1.飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備：用2.5ml、0.5％明膠鋪t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶并覆蓋全部底部，37℃培養(yǎng)箱放置45min后，加入37℃預(yù)孵育過10min的細(xì)胞完全培養(yǎng)基13ml，加入細(xì)胞濃度為1.5×105cells/ml，體積為15ml的cf-1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)第二至三天，飼養(yǎng)層細(xì)胞生長密度達(dá)80-90％時(shí)可以接種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；
s2.誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)：將培養(yǎng)獲得的ips細(xì)胞懸液，體積比1:20接種到預(yù)鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的t74細(xì)胞培養(yǎng)瓶中于37℃的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
s3.細(xì)胞提取物提取：吸出s3培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，用pbs清洗2～3次，然后加2～3ml細(xì)胞裂解液溶解細(xì)胞，然后收集到離心管中，離心取上清；取上清液置于透析袋中，以4℃pbs溶液透析8小時(shí)；將透析袋內(nèi)溶液冷凍干燥，保存在-80℃冰箱。
所述ips細(xì)胞提取物的制備方法步驟s1中所用細(xì)胞完全培養(yǎng)基成分為：dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10％胎牛血清，4g/l大豆蛋白，3mm的l-谷氨酰胺，1mm丙酮酸鈉，7.5mg/l甘氨酰丙氨酸，0.5mg/l海藻糖和0.15mg/l葡多酚。
所述葡多酚提取方法為：將葡萄皮和葡萄籽在氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下進(jìn)行破碎后，加入石油醚脫脂，真空抽干后，加入30ml65％乙醇在45℃恒溫水浴鍋中浸提2h，過濾，真空包裝即得。
將所述ips細(xì)胞提取物、葡多酚和β-胡蘿卜素按質(zhì)量配比5:2:3混合均勻后，按常規(guī)方法配入適量醫(yī)用敷料后制成片劑。
實(shí)施例2一種包含ips細(xì)胞提取物的抗衰老口服液
所述一種包含ips細(xì)胞提取物的抗衰老口服液，由ips細(xì)胞提取物，葡多酚和β-胡蘿卜素按質(zhì)量配比為5:3:4組成。
所述ips細(xì)胞提取物制備方法、葡多酚提取方法與實(shí)施例1類似。
將所述ips細(xì)胞提取物，葡多酚和β-胡蘿卜素按質(zhì)量配比為5:3:4混合均勻后，按常規(guī)方法配入適量醫(yī)用輔料后制成口服液。
實(shí)施例3一種包含ips細(xì)胞提取物的抗衰老膠囊
所述一種包含ips細(xì)胞提取物的抗衰老口膠囊，由ips細(xì)胞提取物，葡多酚和β-胡蘿卜素按質(zhì)量配比為5:1:2組成。
所述ips細(xì)胞提取物制備方法、葡多酚提取方法與實(shí)施例1類似。
將所述ips細(xì)胞提取物，葡多酚和β-胡蘿卜素按質(zhì)量配比為5:1:2混合均勻，按常規(guī)方法配入適量醫(yī)用輔料后制成膠囊。
對(duì)比例1一種包含ips細(xì)胞提取物的抗衰老片劑
所述一種包含ips細(xì)胞提取物的抗衰老片劑，由ips細(xì)胞提取物，葡多酚和維生素e按質(zhì)量配比為5:2:3組成。
所述ips細(xì)胞提取物制備方法以及片劑制備方法與實(shí)施例1類似。
與實(shí)施例1的區(qū)別在于，將β-胡蘿卜素替換為維生素e。
對(duì)比例2一種包含ips細(xì)胞提取物的抗衰老片劑
所述一種包含ips細(xì)胞提取物的抗衰老片劑，由ips細(xì)胞提取物，葡多酚和β-胡蘿卜素按質(zhì)量配比為5:2:3組成。
所述ips細(xì)胞提取物的制備方法步驟s1中所用細(xì)胞完全培養(yǎng)基成分為：dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10％胎牛血清，4g/l大豆蛋白，3mm的l-谷氨酰胺，1mm丙酮酸鈉，7.5mg/l甘氨酰丙氨酸，0.5mg/l甘油和0.15mg/l葡多酚。
其它步驟均與實(shí)施例1類似。
與實(shí)施例1的區(qū)別在于，ips細(xì)胞提取物的制備方法步驟s1中所用細(xì)胞完全培養(yǎng)基將海藻糖替換為甘油。
試驗(yàn)例1本發(fā)明抗衰老組合物對(duì)果蠅壽命的影響
將果蠅放入含有0.15％劑量的本發(fā)明實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-2的抗衰老組合物五組培養(yǎng)管中飼養(yǎng)，并設(shè)置空白對(duì)照組，共分六組。每個(gè)劑量組果蠅200只，雌雄各半。每天早晚各觀察一次，統(tǒng)計(jì)果蠅的死亡數(shù)目和生存數(shù)，直到全部死亡。比較各組壽命的長短，記錄其半數(shù)死亡時(shí)間、最高壽命和平均壽命。
經(jīng)過觀察、記錄，完成果蠅壽命計(jì)數(shù)后，對(duì)所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如表1所示。由表1可知，與培養(yǎng)基中不加藥組相比，加實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-2組制備得到的抗衰老組合物后對(duì)果蠅的半數(shù)存活時(shí)間、平均壽命和最高壽命均有不同程度的延長作用，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有顯著性(p＜0.05～0.01)；實(shí)施例1-3組效果優(yōu)于對(duì)比例1-2組，且實(shí)施例1組效果最為顯著，由此可知本發(fā)明制備得到的組合物具備抗衰老活性。
表1不同抗衰老組合物對(duì)果蠅壽命的影響
注：與對(duì)照組相比，*p<0.05，**p<0.01。
試驗(yàn)例2對(duì)d-半乳糖致小鼠亞衰老模型的影響
選取體重18～22g昆明種小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為7組，每組10只，即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-2組。模型組和各給藥組小鼠每天頸部皮下注射5％d-半乳糖0.5ml/只，連續(xù)4周，空白對(duì)照組皮下注射等體積生理鹽水。在注射d-半乳糖當(dāng)日開始灌胃藥，其中空白對(duì)照組、模型對(duì)照組分別灌入0.5ml蒸餾水，實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-2組分別灌入對(duì)應(yīng)制備得到的抗衰老組合物水溶液0.5ml，每天1次，持續(xù)5周。通過跳臺(tái)法測(cè)定學(xué)習(xí)記憶情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。
表2各抗衰老組合物對(duì)d-半乳糖致小鼠記憶獲得障礙的影響
注：與空白對(duì)照組比較##p<0.01，與模型對(duì)照組比較*p<0.05，**p<0.01。
由表2可知，用d-半乳糖造模5周后，小鼠活動(dòng)減少，行為遲緩，皮毛蓬松，用跳臺(tái)法測(cè)定其獲得性記憶有明顯障礙，觸電潛伏期縮短，測(cè)試錯(cuò)誤次數(shù)增加，應(yīng)用本發(fā)明制備得到的抗衰老組合物口服治療后，發(fā)現(xiàn)衰老小鼠的獲得性記憶障礙有明顯改善，觸電潛伏期延長，測(cè)試錯(cuò)誤次數(shù)減少，其中實(shí)施例1-3制備得到的抗衰老組合物效果均高于對(duì)比例1-2組，且實(shí)施例1組效果最佳。
測(cè)定血液超氧化物歧化酶(sod)活性、血清脂質(zhì)過氧化物(lpo)含量及脂褐素的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。
表3各抗衰老組合物對(duì)d-半乳糖致小鼠亞衰老模型sod、lpo、脂褐素的影響
注：與空白對(duì)照組比較##p<0.01，與模型對(duì)照組比較*p<0.05，**p<0.01。
由表3可知，用d-半乳糖造模5周后，小鼠血液sod活性減弱，血清lpo含量增加，腦組織內(nèi)老化代謝產(chǎn)物脂褐素的生成明顯增加，表明用d-半乳糖成功制成動(dòng)物衰老模型。應(yīng)用本發(fā)明制備得到的抗衰老組合物口服治療后，發(fā)現(xiàn)衰老小鼠的血液sod活性增強(qiáng)，血清lpo含量下降，腦組織內(nèi)老化代謝產(chǎn)物脂褐素的生成顯著減少，其中實(shí)施例1-3制備得到的抗衰老組合物效果均高于對(duì)比例1-2組，且實(shí)施例1組效果最佳。
試驗(yàn)例3本發(fā)明抗衰老組合物毒理研究
取spf級(jí)昆明小鼠30只，雌雄各半，體重18-22g，隨機(jī)分成7組，分別為：對(duì)照組、實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-2組。各組動(dòng)物均空腹12小時(shí)，分別以允許的最大給藥量灌胃給藥。對(duì)照組給予蒸餾水0.4ml/10g體重，實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-2采用各組制備得到的抗衰老組合物，給予1g生藥/ml濃度的原藥液(為最大濃度)0.4ml/10g體重，連續(xù)3次，每次間隔4小時(shí)。給藥后對(duì)動(dòng)物體重、精神狀態(tài)、毛發(fā)、自主活動(dòng)、攝食量、糞便、口鼻分泌物等一般狀況進(jìn)行觀察，并記錄動(dòng)物的不良反應(yīng)和死亡情況，連續(xù)觀察7天。
結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-2組小鼠灌胃給藥后，大部分動(dòng)物均出現(xiàn)活動(dòng)減少，精神倦怠，除此以外，未見其他明顯異常反應(yīng)；2小時(shí)后，小鼠基本恢復(fù)正常，與對(duì)照組比較無明顯異常。在2小時(shí)后的觀察期間，小鼠精神狀態(tài)良好、毛色光潔、活動(dòng)自如、呼吸均勻、攝食量、糞便未見明顯異常、口鼻內(nèi)無異常分泌物，無動(dòng)物死亡。在給藥前、給藥后第3天、給藥后第5天和給藥后第7天，分別對(duì)動(dòng)物進(jìn)行稱重，各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物體重均無明顯組件差異。試驗(yàn)結(jié)束后，解剖小鼠，肉眼觀察主要臟器顏色及形態(tài)學(xué)無改變，未見明顯毒性。
實(shí)驗(yàn)研究表明，本發(fā)明抗衰老組合物對(duì)果蠅的半數(shù)存活時(shí)間、平均壽命和最高壽命均有明顯的延長作用；本發(fā)明抗衰老組合物能夠顯著增強(qiáng)d-半乳糖致小鼠亞衰老模型sod的含量、降低lpo和脂褐素的含量，且安全無毒。由此可知，本發(fā)明抗衰老組合物抗衰老效果顯著。
上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。