本發明涉及淋巴毒素衍生物lt008的新用途，屬于醫藥新用途技術領域。

背景技術：

本發明所說的核輻射指原子核從一種結構或一種能量狀態轉變為另一種結構或另一種能量狀態過程中所釋放出來的微觀粒子流。由于目前環境污染、能源緊缺，核能作為一種高效清潔的能源，在全球被廣泛運用。但是，核泄露導致的安全隱患卻對人類的生存產生巨大的影響。核輻射可導致急性、慢性的組織損傷甚至嚴重的器官功能障礙，尤其對增殖更新迅速的細胞構成的組織造成的損傷更為嚴重。輻射后病人死亡的主要原因是由于骨髓抑制導致的造血功能障礙以及外周血白細胞下降，繼而使免疫功能損傷，導致繼發性感染。因此，保護和恢復骨髓功能是關系到輻射損傷患者預后的關鍵因素之一，但目前對核輻射導致的骨髓損傷尚缺乏有效的防護手段和治療方法。

美國genentech公司早在1996年就發現野生型淋巴毒素α（lymphotoxinα，ltα）對核輻射造成的小鼠骨髓損傷具有保護作用，但由于在隨后的臨床前動物試驗中發現野生型ltα可以引起明顯的不良反應，如嚴重的毛細血管滲漏、低血壓和寒戰發熱等，從而使ltα的應用研究未能深入進行。

技術實現要素：

本發明提供了淋巴毒素衍生物lt008（別名lta-55）的新用途，特別是在制備治療輻射所致的急性、慢性組織損傷甚至嚴重的器官功能障礙的藥物中的應用。

本發明在野生型ltα的基礎上，最初從降低野生型ltα的毒副作用的角度出發，開發n端缺失27個氨基酸殘基的ltα衍生物（ltα-27）用于聯合化療。臨床前動物試驗表明，ltα-27聯合化療藥物能夠發揮明顯的協同殺傷上皮來源腫瘤的作用，而不會誘導骨髓來源細胞凋亡的發生，反而會保護骨髓來源細胞對抗化療藥物的細胞毒作用。但ltα-27在臨床i期階段仍有70%的受試者出現比較嚴重的寒戰發熱，限制了它的進一步開發，然而令人意外的發現是臨床i期聯合使用ltα-27的化療病人，其血小板、淋巴細胞和中性粒細胞下降幅度明顯低于單獨使用化療藥物的患者，即ltα-27顯現出明顯的骨髓/造血細胞保護作用。進一步的機制研究發現ltα通過與腫瘤壞死因子受體1(tumornecrosisfactorreceptor1,tnfr1)和tnfr2結合，啟動下游信號通路發揮其生物學作用，其中毒副作用主要與tnfr2結合有關。因此在此研究基礎上，通過計算機輔助設計和實驗篩選，得到與tnfr1特異性結合，但親和力適中的淋巴毒素衍生物lt008。初步的藥效學結果顯示：lt008在獼猴上能夠使血小板和淋巴細胞上升，對抗化療藥物的骨髓損傷作用，在小鼠上能夠對抗核輻射骨髓損傷使生存率顯著增加。為開拓淋巴毒素衍生物的新用途提供了依據。具體生物學實驗研究結論包括以下方面：

（1）lt008對核輻射導致的小鼠損傷有保護作用：lt008能使小鼠的生存率顯著增加；能夠促進血象的回升；促進骨髓造血功能的恢復；增加脾臟的髓外造血；

（2）lt008能保護核輻射導致的thp-1細胞的損傷：lt008能減少核輻射誘導的細胞凋亡和細胞焦亡；減少核輻射導致的ros的產生；逆轉核輻射導致的細胞周期的阻滯，促進細胞增殖；

（3）lt008在thp-1細胞和小鼠體內均能激活nlrp3炎癥小體，lt008在小鼠骨髓還能促進p52核轉位，激活nf-κb；

（4）lt008對三種基因的敲除小鼠（nlrp3-/-、asc-/-和caspase-1-/-）核輻射后導致的損傷保護作用下降,表明lt008對核輻射導致的小鼠損傷的保護作用與nlrp3炎癥小體有關；

（5）lt008能在小鼠脾臟中促進凋亡抑制因子bcl-xl的表達，該作用可能與血小板的再生，進而機體重新啟動免疫有關；

因此，lt008在防治核輻射性疾病，特別是治療輻射所致的急性、慢性組織損傷甚至嚴重的器官功能障礙疾病方面具有良好的效果，可制備成應用于此方面的新藥。

附圖說明

圖1為野生型小鼠輻照后生存率曲線圖：a:雌性小鼠的生存率曲線圖；b:雄性小鼠的生存率曲線圖；c:雌、雄小鼠合并統計后的生存率曲線圖；

圖2為野生型小鼠輻照后體重變化圖：a:雌性小鼠體重變化圖；b:雄性小鼠體重變化圖；c:雌、雄小鼠合并統計后體重變化圖；

圖3為lt008對wt小鼠rbc影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠rbc的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠rbc的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統計后rbc的影響曲線圖；

圖4為lt008對wt輻照小鼠hgb影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠hgb的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠hgb的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統計后hgb的影響曲線圖；

圖5為lt008對wt輻照小鼠retic%影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠retic%的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠retic%的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統計后retic%的影響曲線圖；

圖6為lt008對輻照小鼠plt影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統計后的影響曲線圖；

圖7為lt008對小鼠wbc影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統計后的影響曲線圖；

圖8為lt008對小鼠lymph%影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統計后的影響曲線圖；

圖9為lt008對小鼠neut%影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統計后的影響曲線圖；

圖10.lt008對輻照后wt小鼠骨髓損傷的保護作用（骨髓涂片）w3：野生型c57bl/6小鼠pbs對照組；w4：野生型c57bl/6小鼠lt008組；d0~d28：輻照當天為d0，輻照后24小時為d1，以此類推；

圖11.lt008對wt小鼠輻照后骨髓病理組織學的影響：w3：野生型c57bl/6小鼠pbs對照組；w4：野生型c57bl/6小鼠lt008組；d0~d28：輻照當天為d0，輻照后24小時為d1，以此類推；

圖12.lt008對wt小鼠輻射后脾臟髓外造血的影響：w3：野生型c57bl/6小鼠pbs對照組；w4：野生型c57bl/6小鼠lt008組；d0~d28：輻照當天為d0，輻照后24小時為d1，以此類推；

圖13.lt008對thp-1細胞增殖的影響（a）及對輻照致細胞損傷后保護作用觀察（b）；

圖14.lt008對輻射后thp-1細胞的細胞周期的影響；

圖15.在輻射情況下lt008對thp-1細胞內ros產生的影響；

圖16.lt008對輻射導致thp-1細胞焦亡的影響；

圖17.lt008對nlrp3炎癥小體相關基因mrna表達的影響；

圖18.lt008對thp-1細胞上清分泌il-1β的影響；

圖19.電鏡下觀察lt008和/或核輻射對thp-1細胞炎癥小體的影響a：對照組；b：10μg/mllt008處理細胞8小時；c：10gy輻射后即刻；d：lt00810μg/ml處理細胞8小時+10gy輻射后即刻；

圖20.野生小鼠脾臟免疫熒光染色效果圖(il-1β)；

圖21.lt008促進輻照后小鼠脾臟il-1β和il-18的表達，a:lt008在輻射后d3~d5天促進野生型小鼠脾臟il-1β和il-18的蛋白表達；b:lt008在輻射后d3~d5天對nlrp3^-/-小鼠脾臟il-1β和il-18的蛋白表達無明顯作用；

圖22.lt008對三種基因敲除小鼠輻照后生存率影響曲線圖a:lt008對雌性nlrp3^-/-小鼠輻照后生存率影響曲線圖；b:lt008對雄性asc^-/-小鼠輻照后生存率影響曲線圖；c:lt008對caspase-1^-/-小鼠輻照后生存率影響曲線圖；d:lt008對野生型和三種基因敲除小鼠輻照后生存率影響曲線圖；

圖23.lt008對對三種基因敲除小鼠輻照后體重影響曲線圖a:lt008對雌性nlrp3^-/-小鼠輻照后體重影響曲線圖；b:lt008對雄性asc^-/-小鼠輻照后體重影響曲線圖；c:lt008對雌性雌、雄小鼠合并統計后caspase-1^-/-小鼠輻照后體重影響曲線圖；

圖24.野生型小鼠胸骨免疫熒光染色（nf-κb和nlrp3）；

圖25.lt008促進小鼠脾臟bcl-xl的表達a:lt008在輻射后d7~d18天促進野生型小鼠脾臟bcl-xl的蛋白表達；b:lt008在輻射后d7~d18天促進nlrp3^-/-小鼠脾臟bcl-xl的蛋白表達，但是幅度低于野生型。

具體實施方式

以下所列實施例，僅為幫助本領域技術人員更全面理解本發明，但不以任何方式限制本發明。

實施例1lt008的制備

根據公開號為cn101084238b專利文獻實施例1的工藝來制備，其氨基酸序列（seqidno：1）為：

mhstlkpaahligdpskqnsllwrantdraflqdgfslsnnsllvptsgiyfvysqvvfsgkayspkatssplylahevqlfsseypfhvpllssqkmvypglqepwlhsmyhgaafqltqgdqlsthtdgiphlvlspstvffgafal。

實施例2lt008在體內能促進野生型c57bl/6小鼠核輻射導致的損傷的恢復

2.1研究方法

野生c57bl/6小鼠購入后在spf動物房檢疫飼養3周，在分組前用bs124天平稱量體重后，采用耳標法進行編號標記，并根據體重隨機分組。分為pbs對照組（w1）和lt008組（w2），每組20只，雌雄各半，用于生存率的測定。另外用pbs對照組（w3）和lt008組（w4），每組60只，雌雄各半，用于血象、骨髓細胞學、骨髓病理學以及相關機制的研究。

所有lt組小鼠在輻照前兩天和輻照當天，75%酒精消毒后，連續三天尾靜脈注射給予250μg/kglt008。給藥濃度25μg/ml，給藥體積10ml/kg。對照組給予10ml/kg的pbs。所有組別的小鼠在第二軍醫大學海醫系輻射中心進行輻照，動物整體暴露于60co-γ輻射下，按照1.63gy/min的輻射率進行輻照，整體輻射量達到9.5gy，進行生存率研究和體重監測，1.63gy/min的輻射率進行輻照，整體輻射量達到9.0gy，用于血象、骨髓細胞學、骨髓病理學以及相關機制的研究。

2.2研究結果

一般情況：對照組小鼠（w1）輻照當天就出現活動明顯減少，攝食及飲水也減少，但給予lt008的小鼠（w2組）輻照當天活動如常，攝食及飲水均無明顯減少，輻照后第二天（d1）w1組所有小鼠均靜臥，活動進一步減少，w2組小鼠活動開始略減少，輻照后第三天（d3），w1組小鼠毛發開始蓬松，到第五天（d5），w1組小鼠幾乎全部出現毛發蓬松，軀體松軟無力，而w2組小鼠一直沒有明顯的毛發蓬松以及肌肉無張力現象。w1組小鼠第八天（d8）開始出現死亡，死亡集中發生在d8~d9天，至d12天，w1組小鼠全部死亡。w2組小鼠，雌性小鼠在d14死亡兩只，雄性小鼠d18死亡一只，其余小鼠均存活至觀察期結束（d28天）。

生存率曲線顯示：lt008組小鼠的生存率顯著高于pbs對照組，在雌性小鼠、雄性小鼠分別統計以及雌雄小鼠一起統計時的結果是一致的（圖1）。

（3）體重監測結果顯示：lt008對輻射后小鼠的體重恢復是有促進作用的（圖2）。

（4）lt008對野生型c57bl/6小鼠核輻射后血象恢復有促進作用：9.0gy輻照后，野生型pbs組（w3）的紅細胞（rbc）、血紅蛋白（hgb）的數目和紅細胞比容（hct）在輻射后均迅速降低，且無好轉趨勢，野生型lt008250μg/kg組（w4）小鼠在輻射初期上述指標均有降低，在d10到達最低點，之后開始回升，在d21左右基本恢復正常。該結果表明lt008對野生小鼠核輻射后造血功能的損傷有保護作用（圖3至圖5）。

網織紅細胞（retic）是尚未完全成熟的紅細胞，在周圍血液中的數值可反映骨髓紅細胞的生成功能，從原始紅細胞階段增殖到晚幼紅細胞階段共分裂3~4次，約需72小時，紅細胞數由一個變為8~16個。晚幼紅細胞階段以后的細胞不再分裂，發育過程中核被排出而成為網織紅細胞。從晚幼紅細胞發育到成熟紅細胞約需48小時。在正常情況下骨髓中有核紅細胞并不釋放至血循環，只有網織紅細胞和成熟紅細胞才釋入血中，檢查末梢血中網織紅細胞數，可以推知骨髓產生紅細胞的能力。因此，網織紅細胞是反映骨髓紅系造血功能以及判斷貧血和相關疾病療效的重要指標。因此我們進一步檢測了retic的改變，結果如圖5所示，輻射后d1，w3和w4組小鼠的網織紅細胞均開始降低，最低時均幾乎降低至0，但是w4組小鼠的網織紅細胞降到谷底后，于d10開始逐漸代償性升高，比例大幅度上升至18%-30%，至d28左右基本恢復正常。該結果顯示lt008對紅細胞的生長有很強的促進作用。

血小板壽命約7~14天，每天約更新總量的1/10，衰老的血小板大多在脾臟中被清除。電離輻射、烷化劑、抗代謝劑、細胞毒性制劑等理化因素可抑制骨髓，這些物質常被用來治療惡性腫瘤，或者直接損害骨髓細胞，或者引發免疫反應，甚至使骨髓出現彌漫性損傷，導致全血細胞減少。有少數患者的巨核細胞對輻射較敏感，可只表現為血小板和巨核細胞減少。因此我們也檢測了血小板的改變，結果如圖6所示，與w3組相比，w4組（lt008組）小鼠輻射前plt略低于w3組（pbs對照組），在輻射后d1，w3組較輻射前有顯著升高以外，w4組plt迅速下降，兩組均在d5降至最低值，隨后w4組小鼠的plt有所恢復，在d21左右基本恢復正常，而pbs組的小鼠無恢復，直至最后死亡。

對野生小鼠血象白細胞系監測的結果顯示：對野生型小鼠，lt008組（w4組）和pbs對照組（w3組）白細胞總數（wbc）在輻射后d1均開始急速下降，d3降至最低，w4組小鼠在d14開始有恢復的趨勢，存活小鼠在d21~d28基本恢復正常，而w3組小鼠的wbc持續至觀察終點（動物死亡）未有明顯恢復趨勢（圖7）。小鼠lymph%和neut%的檢測發現lt008組和pbs輻射對照組之間未見明顯的趨勢性差異，這有可能和輻射后小鼠白細胞總數下降至極低值以及個體之間的差異而導致（圖8和9）。

（5）lt008對野生型c57bl/6小鼠核輻射后的骨髓恢復有促進作用

用同樣的9.0gy60co-γ的輻照劑量作用于野生型小鼠，lt008組（w4組）輻射前連續三天給予250μg/kg劑量尾靜脈注射，pbs對照組（w3組）給予10ml/kg的容積靜脈注射pbs。在不同的時間點脫頸椎處死小鼠后，取下肢股骨做骨髓涂片，進行骨髓細胞學檢查，取胸骨做病理切片，行病理組織學檢查。結果顯示輻射前（d0），w3組和w4的骨髓情況接近，輻射后d1（24h），w3組損傷情況較w4組輕，但是d3天開始，骨髓損傷程度兩者接近，d7開始，w4組骨髓損傷開始有明顯的好轉，骨髓有核細胞增生較活躍，但是w3組骨髓有核細胞增生仍舊低下，直至d14開始，w3組存活小鼠的骨髓有核細胞才顯示出增生較活躍，而此時w4組的骨髓各系的細胞形態、比例以及染色均呈現出恢復趨勢。至d18，w4組各系細胞形態結構基本正常，而w3組則仍顯示出骨髓有核細胞增生欠活躍，僅可見少量有核紅細胞。d21，w4組骨髓完全恢復正常，而w3組動物均死亡，未采集到d21天的骨髓。從骨髓涂片結果顯示，w4組較w3有明顯的保護作用（圖10）。

野生型小鼠骨髓切片的病理結果顯示：在輻射的作用下，w3組小鼠的骨髓切片顯示從d1開始，骨髓的增生開始降低，至d3極度降低，該情況一直持續至d18，并且骨髓的淤血、出血和水腫程度加深。在lt008作用下，w4組野生型小鼠的骨髓切片顯示在d1仍然增生活躍，d3開始，骨髓增生極度降低，d10骨髓增生降低程度緩解，d14骨髓增生開始恢復，局灶性造血細胞恢復，而至d18，骨髓相恢復正常，骨髓增生增強。由于w3組動物在d18后全部死亡，故未采集到d21的骨髓結果。以上結果顯示，在lt008的作用下，輻照后的野生型小鼠的骨髓造血功能恢復較pbs對照組有明顯的增強（圖11）。

（6）、lt008對野生型c57bl/6小鼠核輻射后脾臟的髓外造血有促進作用

用同樣的9.0gy60co-γ的輻照劑量作用于野生型小鼠，lt008組（w4組）輻射前連續三天給予250μg/kg劑量尾靜脈注射，pbs對照組（w3組）給予10ml/kg的容積靜脈注射pbs。在不同的時間點脫頸椎處死小鼠后，取脾臟做病理切片，行病理組織學檢查。脾臟的病理組織學結果表明：野生型小鼠lt008組（w4）和pbs組（w3）均在輻照后d1就出現白髓淋巴細胞減少，從d7開始，w4組開始出現淋巴樣增生，d10開始出現髓外造血，說明在lt008的作用下，由于骨髓功能的抑制，脾臟開始代償性出現髓外造血，以彌補機體造血能力的不足，而pbs組僅出現淋巴樣增生，未出現明顯的髓外造血現象（圖12）。以上結果說明，lt008對輻射后小鼠的脾臟髓外造血功能有促進作用。

以上研究結果表明，lt008能通過促進輻照后的野生型小鼠的一般狀況和體重的恢復，增加輻照后小鼠的生存率，促進輻照小鼠外周血象、骨髓造血功能的恢復以及增加其脾外造血功能進而彌補機體因輻照造成的骨髓造血功能的不足來發揮輻射保護作用。

實施例3lt008體外對核輻射導致人單核細胞thp-1損傷的保護作用

3.1lt008能促進thp-1細胞的增殖并促進輻照下thp-1細胞的存活

（1）方法：不同濃度的lt008（0、0.1、1、10和50μg/ml）處理thp-1細胞不同的時間（0、1、4、8、24、48和72小時）后進行細胞計數來做細胞的增殖曲線；用上述不同濃度的lt008作用于細胞后即刻進行總量6gy60co-γ的輻照（1.63gy/min），0、1、4、8、24、48、72h進行細胞計數，做細胞增殖曲線。結果見圖13。

（2）試驗結果：結果如圖13a所示，與對照組相比，0~10μg/mllt008處理細胞不同時間細胞數沒有明顯改變，但50μg/mllt008處理細胞4h后thp-1細胞數目明顯開始增多，約為對照的1.26倍（p<0.05），72小時約為對照的1.55倍（p<0.05），以上結果表明在50μg/mllt008對thp-1細胞的增殖有促進作用。進行總量6gy60co-γ的輻照（1.63gy/min）后，0、1、4、8、24、48、72h進行細胞計數，結果如圖13b所示，1μg/ml和10μg/mllt008處理組在72h檢測點細胞數明顯多于對照組（p<0.05）。而50μg/mllt008處理組4小時開始細胞數就明顯多于對照組，一直到觀察的72小時均高于對照組。以上結果表明在體外，lt008對輻射導致的thp-1細胞損傷有一定的保護作用。

3.2lt008能夠逆轉輻照導致的thp-1細胞g2期的阻滯

（1）方法：不同濃度的lt008（0、1、10和50μg/ml）處理thp-1細胞8小時，除對照組細胞外，所有細胞用6gy60co-γ的輻射，分別在0min、5min、1h、4h、8h、24h、48h、72h，1000rpm離心5分鐘收集細胞，流式細胞儀進行細胞周期檢測。

（2）試驗結果：結果如圖14所示，輻射后8小時，與對照組相比，不同濃度的lt008處理的細胞g0/g1期細胞開始降低，g2期開始增加，24小時時g0/g1期降低十分顯著（從對照的60%降低到20%，p<0.05），g2期顯著增加（從對照的16%增加至48%左右，p<0.05），但在48小時時，50μg/mllt008處理組細胞與0μg/mllt008處理組相比g0/g1期比例顯著增加，基本恢復到無輻照時候的比例（p<0.05），g2期顯著減少至無輻照時候的比例（p<0.05）。

以上研究結果表明：輻照后細胞發生g2期阻滯，50μg/mllt008可以幫助細胞在48小時可完全逆轉g2期阻滯，恢復正常細胞周期。

3.3lt008對輻照后細胞內ros的影響

（1）方法：用50μg/ml的lt008作用于thp-1細胞，在總量10gy60co-γ

（1.63gy/min）的輻照后5min、24h、48h、72h用流式細胞儀檢測細胞內的ros。

（2）試驗結果：結果如圖15所示，在單純輻照的情況下，隨著核輻射時間的增加，ros逐漸增加，72h時為對照的5.6倍（p<0.01），50μg/ml的lt008處理細胞可以降低10gy60co-γ的輻照后細胞內72hros的含量（p<0.05）。

3.4lt008對核輻射導致的細胞焦亡的影響

（1）方法：分別用pbs（0μg/ml）或10μg/mllt008處理thp-1細胞8小時后，10gy60co-γ的輻照（ir組）或不輻照（con組），分別在即刻、24h、48h和72h1000rpm離心5分鐘收集細胞，流式細胞儀檢測細胞焦亡。

（2）試驗結果：結果如圖16所示，細胞輻照24小時后，細胞焦亡明顯增加（p<0.01），10μg/mllt008組細胞在輻射后24h、48h以及72h和單純輻射組相比，細胞焦率均顯著降低（p<0.05，p<0.01），該結果顯示：lt008能顯著降低輻射后thp-1細胞的焦亡比率，lt008對輻射后的thp-1細胞有明顯的保護作用。

實施例4lt008對核輻射損傷保護的機制研究

核輻射對機體致死性損傷的主要原因是骨髓抑制、免疫系統抑制、胃腸道損傷等，這些損傷都會導致機體的炎癥反應，因此炎癥損傷是核輻射的重要環節。機體在感受到急性損傷信號或者狀態失穩時會啟動炎癥反應機制^[4-6]，炎癥小體是一蛋白質復合物，它們能夠識別各種不同的炎癥刺激信號，其中包括damp信號，并通過多個信號通路誘導免疫和炎癥相關基因表達，從而使機體能抵御應激造成的損傷^[7-8]。而nlrp3炎癥小體活化后產生的il-1β和il-18在機體的適應性免疫中起著重要作用，前面的細胞學實驗表明lt008對輻射導致的細胞內ros的產生、細胞焦亡等均有影響，而細胞內ros和細胞焦亡都和nlrp3炎癥小體相關，因此接下來我們研究lt008對nlrp3炎癥小體有何影響。

4.1ltα-5能在體外和體內激活nlrp3炎癥小體，并且對輻射后的細胞有保護作用。

4.1.1lt008能促進nlrp3炎癥小體相關基因的表達的影響

方法：不同濃度的lt008（0、0.1、1、10、50和100μg/ml）處理thp-1細胞，分別在不同的時間點（1、3、8和24小時），1000rpm離心5分鐘收集細胞，rt-pcr檢測nlrp3、asc、caspase-1、il-1β和il-18mrna的表達

研究結果：lt008能快速增加il-1βmrna的表達，0.1μg/ml的lt008處理細胞1小時，il-1βmrna的表達增加至對照細胞的27.1倍（p<0.01），并隨著lt008濃度的增加而逐漸增加，50μg/ml濃度時達峰值，為對照的50.6倍（p<0.01）隨著作用時間的延長，il-1βmrna的表達逐漸下降，不同濃度的lt008處理細胞3小時時，il-1βmrna為對照的3倍左右，并維持至24小時仍沒有明顯降低。lt008也能增加nlrp3和caspase-1的mrna表達，給藥后8小時開始升高，24小時時仍沒有降至正常水平。而il-18在給藥后24小時，并且lt008大于（包含）10μg/ml的濃度水平才檢測到升高，而asc在所有濃度下的不同時間點均未檢測到mrna表達的升高（圖17）。

4.1.2lt008能夠促進thp-1細胞分泌il-1β

方法：不同濃度的lt008（0、1μg/ml、100μg/ml和1mg/ml）處理thp-1細胞，24小時后1000rpm離心細胞5分鐘取上清，elisa法檢測上清中il-1β的含量。

試驗結果：結果如圖18所示，與對照組相比，1μg/ml的lt008處理細胞24小時就能增加il-1β的分泌，為對照的3.26倍（p<0.05），100μg/ml和1mg/ml的lt008處理細胞24小時能明顯增加thp-1細胞分泌il-1β，分別為對照的25.6倍（p<0.01）和29.8倍（p<0.01）。以上結果表明lt008不但能夠上調il-1β的表達，還能夠增加thp-1細胞il-1β的分泌。說明lt008激活了nlrp3炎癥小體。

4.1.3電鏡結果顯示lt008能夠激活nlrp3炎癥小體，并對核輻射作用下thp-1細胞有保護作用

方法：將細胞分為四組，lt組（圖19b）lt00810μg/mllt008處理細胞8小時，對照組（圖19a）用等量pbs處理細胞8小時，核輻射組（圖19c）10gy60co-γ輻射即刻，lt和核輻射聯合組（圖19d）10μg/mllt008處理細胞8小時后行10gy60co-γ輻射即刻。1000rpm離心5分鐘收集細胞，pbs洗細胞兩次，4℃戊二醛固定細胞3天后電鏡下觀察。

試驗結果：如圖19所示，與對照組相比，lt008能夠迅速激活細胞內的nlrp3炎癥小體，電鏡下可見黑色致密圓點（圖19b）細胞基質基本正常，核輻射也可以激活炎癥小體，但輻射后即刻收集的細胞，就可見細胞內有較多碎片，并且有大小不等的空泡（圖19c）。lt008作用后的細胞再經歷核輻射，可見細胞內空泡明顯減少（圖19d），細胞的狀態好于單純輻射細胞組。

以上結果表明，lt008能激活thp-1細胞中nlrp3炎癥小體，且對核輻射導致的該細胞損傷有明顯的保護作用。

4.1.4lt008能夠激活促進野生小鼠脾臟il-1β表達升高，而且該升高和nlrp3炎癥小體相關

lt008能促進野生小鼠脾臟il-1β免疫熒光的增強。

方法：由于在細胞學水平lt008能夠激活nlrp3炎癥小體，因此我們進一步研究lt008能否在體內激活nlrp3炎癥小體。由于前期的病理檢查發現脾臟有明顯的髓外造血，因此我們進一步研究lt008對脾臟的作用。我們取野生型的c57bl/6小鼠，尾靜脈分別注射lt008（25μg/ml，10ml/kg）和等量pbs，三天后處死小鼠并解剖取脾臟，經固定、脫水、石蠟包埋、切片后進行免疫熒光染色測定脾臟組織中的il-1β。

結果：如圖20所示，lt008能顯著增強小鼠脾臟il-1β的免疫熒光的增強。

lt008能夠促進輻射后小鼠脾臟il-1β和il-18的蛋白表達，且該表達和nlrp3炎癥小體相關。

方法：用9.0gy60co-γ的輻照劑量作用于野生型小鼠，lt008組（w4組）輻射前連續三天給予250μg/kg劑量尾靜脈注射，pbs對照組（w3組）給予10ml/kg的容積靜脈注射pbs。在不同的時間點脫頸椎處死小鼠后，取脾臟組織，提取蛋白，用western-blot檢測il-1β和il-18的蛋白表達。nlrp3-/-組小鼠經過同樣的處理后檢測。

結果：如圖21所示，在野生型小鼠中，lt008能增加輻射小鼠脾臟中il-1β和il-18的蛋白表達，lt008組小鼠在輻射1天和3天后il-1β和il-18分別開始升高，3~5天為高峰，7天仍然明顯高于對照，而在nlrp3-/-小鼠脾臟中il-1β和il-18表達水平均很低。

以上結果進一步證實lt008在體內和體外都能激活nlrp3炎癥小體，并且lt008對輻射后的細胞有顯著的保護作用，該保護作用有可能和lt008激活nlrp3炎癥小體有關。

4.1.5進一步利用nlrp3炎癥小體（nlrp3、asc、caspase-1）相關的三種基因敲除小鼠來驗證lt008對核輻射的保護作用和nlrp3炎癥小體相關

方法：具體見實例1的方法。我們進一步選用了nlrp3炎癥小體復合體中三種成分nlrp3、asc和caspase-1基因敲除的小鼠（nlrp3-/-、asc-/-、caspase-1-/-）研究lt008對核輻射導致的小鼠骨髓損傷的保護作用是否通過炎癥小體。三種基因敲除小鼠均根據體重隨機分組，每種基因敲除小鼠分為四組，9.5gy致死劑量下，進行小鼠生存率和體重的監測研究，分為9.5gy模型組（組1）和9.5gylt008250μg/kg組（組2）；在9.0gy輻射劑量下，監測小鼠的血象、骨髓涂片和主要臟器的組織病理學檢查，分別為：9.0gy模型組（組3）、9.0gylt008250μg/kg組（組4）。在輻射前兩天和輻射當天，組1和組3小鼠尾靜脈注射給予10ml/kg的pbs，組2和組4給予250μg/kg的lt008。

結果：生存率測定：nlrp3-/-、asc-/-、caspase-1-/-三種基因敲除小鼠的生存率研究結果顯示：lt008對三種基因敲除小鼠的生存率無顯著影響，和野生小鼠相比，未見明顯的保護作用。因此我們可以得到這樣的結論，lt008對輻射的保護作用和nlrp3炎癥小體復合體相關（圖22）。

體重結果顯示：lt008對三種基因敲除小鼠的體重恢復和對照組之間無顯著性差異（圖23）。

骨髓細胞學和病理組織學結果顯示：

nlrp3-/-小鼠骨髓細胞學動態檢測結果表明：輻射后d1，n3組的骨髓損傷程度較n4組輕，d3時骨髓損傷程度兩組接近，d7開始，n4組骨髓損傷開始稍有好轉，骨髓有核細胞增生較活躍，但是n3組骨髓有核細胞增生仍舊低下，直至d14。而直至d21開始，存活n4組小鼠的骨髓有核細胞才顯示出增生活躍。而n3組因動物均死亡，未采集到d21天的骨髓，n4組小鼠未采集到d28天骨髓。以上結果提示，lt008對輻照所致nlrp3-/-小鼠骨髓損傷具有一定的保護作用。nlrp3-/-小鼠骨髓切片的病理結果顯示：在輻射的作用下，n4組和n3組小鼠的骨髓切片顯示從d1開始，骨髓的增生開始降低，至d3明顯降低，該情況持續至d5。在lt008作用下，nlrp3-/-小鼠的骨髓切片顯示在d7開始，骨髓增生開始恢復，d14天部分恢復正常的骨髓相，而至d21，骨髓相已經完全恢復正常。然而n3組小鼠骨髓增生顯著降低一直持續至d14。由于n3組動物在d14后全部死亡，故未采集到d21的骨髓結果，而n4組則在d21解剖后，動物完全死亡，故未曾采集到28天的骨髓結果。以上結果顯示，在lt008的作用下，nlrp3-/-小鼠的骨髓造血功能恢復較n3組有明顯的增強。

asc-/-小鼠骨髓細胞學動態檢測結果表明：a4組輻射后當天，a3組的骨髓損傷程度較lt008組輕，d5時骨髓損傷程度兩組接近，d7開始，a4組骨髓損傷較對照組稍有的好轉，從d10開始，a4組小鼠的骨髓有核細胞增生活躍，但是a3組骨髓有核細胞增生仍舊低下持續至d21，且后期由于a3組動物全部死亡，故未能進行后續a3組的骨髓檢查。直至d21開始，a4組的骨髓各系的細胞形態、比例以及染色呈現基本正常，以上結果提示，lt008對輻照所致asc-/-小鼠骨髓損傷具有一定的保護作用。asc-/-小鼠骨髓切片的病理結果顯示：在輻射的作用下，a4組和a3組小鼠的骨髓切片顯示從d1開始，骨髓的增生開始降低，至d5增生極度降低，該情況持續至d7。在lt008作用下，asc-/-小鼠的骨髓切片顯示在d7開始，骨髓增生降低程度開始恢復，d14部分恢復正常的骨髓相，而至d21，骨髓增生活躍，至d28天骨髓增生恢復正常。然而a3組的asc-/-小鼠骨髓增生極度降低一直持續至d14，至d21增生降低情況略有好轉，后續由于a3組的小鼠全部死亡，未有d28的骨髓結果。以上結果顯示，在lt008的作用下，a4組小鼠的骨髓造血功能恢復較a3組有明顯的增強。

caspase-1-/-小鼠骨髓細胞學動態檢測結果表明：c4組輻射后當天與c3組的骨髓損傷程度相似，直至d10天，c4組和c3組小鼠的骨髓細胞增生都仍舊欠活躍，至d14，c4組小鼠的骨髓有核細胞增生開始活躍，直至d28才完全恢復正常。但是c3組由于動物全部死亡，從d14起故未能進行后續對照組的骨髓檢查。以上結果提示，lt008對輻照所致caspase-1-/-小鼠骨髓損傷具有較明顯的保護作用。

caspaase-1-/-小鼠骨髓切片的病理結果顯示：在輻射的作用下，c4組和c3組小鼠的骨髓切片顯示從d1開始，骨髓的增生開始降低，至d5極度降低，該情況持續至d5。在lt008作用下，caspaase-1-/-小鼠的骨髓切片顯示在d7開始，骨髓增生降低程度開始恢復，d10天開始骨髓增生活躍，d14天1/3骨髓腔開始出現增生的造血細胞，d21開始恢復正常的骨髓相，而至d28天，骨髓相已經完全恢復正常。然而c3組的caspaase-1-/-小鼠骨髓增生極度降低一直持續至d14。由于c3組動物在d14后全部死亡，故未采集到d21的骨髓結果。以上結果顯示，在lt008的作用下，c4小鼠的骨髓造血功能恢復較c3組有明顯的增強。對于d10兩只瀕死動物的骨髓切片結果顯示骨髓增生極度降低，特別是c3組的動物骨髓顯示出明顯的出血征象，因此我們可以推測動物的死亡和骨髓的損傷密切相關。

以上三種基因敲除小鼠的骨髓結果顯示：lt008對輻射后的基因敲除小鼠的骨髓恢復有一定的促進作用，但是從小鼠骨髓相的恢復時間看，基本在輻射后d14天左右才開始有恢復的趨勢，低于野生型lt008組的輻射后d7天骨髓細胞學檢查就顯示出增生活躍。因此，nlrp3、asc、caspase-1炎癥小體相關因子被敲除以后，骨髓恢復的時間延遲。

4.1.6lt008能在體內能同時激活nf-κb和nlrp3炎癥小體

前期研究表明ltα與tnfr1和tnfr2結合后能誘導正常細胞線粒體產生錳超氧化物歧化酶對抗放化療引起的氧化應激，保護骨髓細胞免受放化療的損傷，同時增加腫瘤細胞對放化療的敏感性。ltα對腫瘤細胞和骨髓來源細胞的不同反應是由于上皮來源腫瘤和骨髓來源細胞中nf-κb表達水平的差異。ltα激活tnfr1信號后又可通過進一步激活nf-κb分子而起到抗凋亡的作用，從而增強了骨髓來源細胞對抗化療藥物毒性的能力。

方法：我們取野生型的c57bl/6小鼠，尾靜脈分別注射lt008（25μg/ml，10ml/kg）和等量pbs，三天后處死小鼠并解剖取胸骨，經固定、脫水、石蠟包埋、切片后進行免疫熒光染色nf-κb的p52亞基（紅色）和nlrp3（綠色）。

結果：nf-κb的p52亞基，未激活時在細胞漿表達，激活后轉位入核，結果如圖24所示。對照組nf-κb（p52）紅色熒光主要表達在胞漿，lt008處理組可見紅色熒光轉位入核，表明lt008在小鼠體內激活了nf-κb。同時與對照相比，lt008處理組的nlrp3炎癥小體的表達明顯增高（綠色熒光增強）。

3.1.7lt008在核輻射小鼠脾臟中通過上調bcl-xl抑制細胞凋亡，促進血小板的生成，從而促進機體對輻射導致的損傷的恢復

bcl-xl是bcl-2凋亡相關蛋白家族中的一種抗凋亡蛋白，多項研究表明，bcl-xl在血小板的生成和破壞中都發揮作用，bcl-xl在巨核細胞的分化、成熟及血小板產生過程都發揮作用。bcl-xl可能在造血干細胞向巨核細胞分化過程中，尤其在維持未成熟巨核細胞發育過程中具有重要作用；而在達到成熟的巨核細胞中表達明顯降低，則可能與巨核細胞成熟后發生特殊的凋亡以至血小板形成有關，我們進一步觀察了核輻射和/或lt008處理后野生型小鼠和nlrp3-/-小鼠脾臟中bcl-xl的表達。

方法：研究方法見效果實例1里的研究方法，在不同的時間點取小鼠的脾臟進行western-blot進行檢測。

研究結果：lt008能在第七天開始明顯增加核輻射小鼠脾臟中bcl-xl的表達，維持至18天，在nlrp3-/-小鼠中bcl-xl的表達也有升高，但是沒有野生型小鼠明顯，該結果也和血象監測中的血小板監測結果一致（見圖25）。

5結論

從實施例1～4的試驗結果可見：（1）lt008對核輻射導致的小鼠損傷有保護作用：lt008能使小鼠的生存率顯著增加；能夠促進血象的回升；促進骨髓造血功能的恢復；增加脾臟的髓外造血；

（2）lt008能保護核輻射導致的thp-1細胞的損傷：lt008能減少核輻射誘導的細胞凋亡和細胞焦亡；減少核輻射導致的ros的產生；逆轉核輻射導致的細胞周期的阻滯，促進細胞增殖；

（3）lt008在thp-1細胞和小鼠體內均能激活nlrp3炎癥小體，lt008在小鼠骨髓還能促進p52核轉位，激活nf-κb；

（4）lt008對三種基因的敲除小鼠（nlrp3-/-、asc-/-和caspase-1-/-）核輻射后導致的損傷保護作用下降,表明lt008對核輻射導致的小鼠損傷的保護作用與nlrp3炎癥小體有關；

（5）lt008能在小鼠脾臟中促進凋亡抑制因子bcl-xl的表達，該作用可能與血小板的再生，進而機體重新啟動免疫有關；

因此，lt008在防治核輻射性疾病，特別是輻射所致的急性、慢性組織損傷甚至嚴重的器官功能障礙疾病方面具有良好的效果，可制備成應用于此方面的新藥。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。

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