本發明涉及醫藥領域，特別是涉及amd3100或其藥學上可接受的鹽在制備治療和/或預防腫瘤惡液質的藥物中的應用，以及用于治療和/或預防腫瘤惡液質的藥物。

背景技術：

腫瘤惡液質是腫瘤患者常見的一種伴發癥狀，主要表現為非意愿性的體重下降和厭食。至少有30％癌癥患者死于惡液質，而且至少50％癌癥患者死亡時伴有惡液質。英國愛丁堡大學臨床科學和社區健康學院fearon教授等起草的腫瘤惡液質定義，目前基本達成共識：惡液質是一種多因素綜合征，表現為患者正在丟失骨骼肌質量(伴或不伴有脂肪質量丟失)，而傳統營養支持不能完全逆轉，繼而引起功能損傷持續惡化。腫瘤惡液質不僅僅使病人生活質量明顯降低，而且導致腫瘤治療耐受性，減弱腫瘤治療效果。因此，針對腫瘤惡液質的治療對于治療腫瘤和提高病人生活質量都有著十分重要的作用。

隨著大量研究的開展，關于腫瘤惡液質的發生機制也有了更深入的了解。腫瘤惡液質的病理生理特征為蛋白質和能量呈負性平衡，這一負性平衡由食物攝入減少和異常代謝綜合因素造成。盡管目前有許多臨床前研究在發生腫瘤惡液質的動物模型中取得不錯進展，臨床上卻仍沒有藥物被批準應用于腫瘤惡液質的預防和治療。臨床上主要還是通過營養支持和鍛煉的手段來延緩腫瘤惡液質的發生。

因此，急需要深入了解腫瘤惡液質的發生機理，在其發生的早期進行靶向干預，以達到更好的治療效果。

間充質干細胞(mesenchymalstemcells,msc)，是最早從骨髓中發現的一種非造血類的干細胞(friedenstein,a.j.,etal,1974)，參與構成骨髓造血微環境，對造血干細胞的增殖與分化具有明顯支持作用。msc廣泛分布于全身各個組織和器官，除骨髓外，還存在于牙齦，骨骼肌、脂肪等組織中，參與組織的損傷修復及穩態維持。msc缺乏特異性標志物，主要表達cd29、cd44、cd73、cd90、cd105和cd166等間質標志物，不表達cd11b、cd14、cd19、cd34、cd45等造血相關標志物。

巢蛋白nestin是一種中間絲蛋白。在胚胎發育時期，nestin最早表達在具有多向分化潛能的神經上皮干細胞中。而在成體組織內，中間絲蛋白nestin僅在未完全分化、保持一定增殖能力的成體干/祖細胞群體中表達。因此，這類nestin+細胞是成體干細胞池重要的組成部分，在維持機體干細胞的穩態中發揮重要作用。近期，mendez-ferrer等人利用nestin-gfp轉基因小鼠首次證實了骨髓中存在一群nestin+細胞，并可在體外成克隆生長，具備成骨、成脂、成軟骨方向分化特性，提示中間絲蛋白nestin是骨髓間質干細胞(msc)的重要標志。本申請發明人前期利用nestin-gfp轉基因小鼠研究顯示，從睪丸、腎臟、心臟等組織分選得到的gfp陽性細胞具有自我更新和多向分化潛能，并具備了修復病損組織的能力。這些結果表明nestin+msc對于組織穩態的維持具有十分重要的作用。

綜上可見，成體干細胞伴隨著不同器官的終生，具有自我更新以及替代或修復損傷組織的功能。msc作為成體干細胞的一員，是維持機體組織內部穩態的重要成分。在腫瘤的發生過程中，腫瘤具有招募nestin+msc進入腫瘤微環境的能力。nestin+msc被腫瘤招募走以后，組織穩態被破壞，引起器官組織功能紊亂，成為誘發腫瘤惡液質的重要因素。

msc表達多種趨化因子和粘附分子受體，在配體存在的條件下，可以介導msc向損傷或炎癥部位發生遷移。在腫瘤的發生過程當中，msc被招募進入腫瘤微環境多次被報道。2011年，michaelquante及其同事發現，在胃幽門螺旋桿菌誘導的慢性胃癌小鼠模型中，病變組織會從骨髓中招募nestin+細胞；2014年，dianaklein及其同事發現，小鼠b16f10和llc腫瘤可以招募骨髓以外組織的nestin+細胞參與血管的形成。這些結果提示，腫瘤具備有招募機體以nestin為標志物的msc的能力。但是，腫瘤招募msc的機制尚未完全研究清楚。

amd3100，又叫普樂沙福(plerixafor)，化學名為：1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環十四烷,其結構式如下所示:

amd3100在1994年首次合成，目前已知其治療潛能包括hiv感染、炎癥性疾病、干細胞動員、白血病和固體腫瘤。至今未發現有關于amd3100在惡液質預防和治療方面的報道。

技術實現要素：

經本申請發明人長期研究發現，化合物1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環十四烷或其藥學上可接受的鹽可以有效地治療和/或預防惡液質，尤其為腫瘤惡液質的治療提供了新的思路，有利于延緩或減輕腫瘤患者的惡液質癥狀，改善腫瘤治療效果，提高生活質量，延長生存預期。

本發明提供化合物1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環十四烷或其藥學上可接受的鹽在制備用于治療和/或預防惡液質的藥物中的應用。

本發明的藥物可用作哺乳動物(例如人、小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、馬、豬、猴等)中的惡液質的治療和/或預防。

本發明另一方面還提供一種治療和/或預防惡液質的方法，所述方法包括向需要治療和/或預防的受試者施予有效量化合物1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環十四烷或其藥學上可接受的鹽。

本發明所述的受試者可以指任何動物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、馬、豬、猴等哺乳動物。

本發明的藥物可經由任何生理上可接受途徑施藥，施藥途徑例如口服、注射等。在本發明提供的實施例中，amd3100的劑型優選為注射劑。

當用于上述治療和/或預防或其他治療和/或預防時，本發明化合物的總日用量須由主診醫師在可靠的醫學判斷范圍內作出決定。對于任何具體的患者，具體的治療有效劑量水平須根據多種因素而定，所述因素包括所治療的障礙和該障礙的嚴重程度；所采用的具體化合物的活性；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所采用的具體化合物的給藥時間、給藥途徑和排泄率；治療持續時間；及醫療領域公知的類似因素。例如，本領域的做法是，化合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。

本發明所述藥物可制成藥學上可接受的劑型，一般來說，藥物有效成分占治療給藥總質量的1-95％。藥物的劑型要適合不同給藥方式，例如口服制劑(如片劑、膠囊劑、溶液或混懸液)；可注射的制劑(如可注射的溶液或混懸液，或者是可注射的干燥粉末，可在臨用前溶解或分散于無菌水或其他無菌可注射介質可立即使用)等。制劑的制備可采用傳統工藝。

本發明所述藥物還可以含有藥學上允許的輔料或載體。可根據需要任選使用藥學上可接受的輔料或載體。這些輔料或載體是我們廣泛熟知的，包括：口服制劑使用的粘合劑(如淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮)，稀釋劑(如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素，和/或甘油)，潤滑劑(如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其鹽，通常是硬脂酸鎂或硬脂酸鈣，和/或聚乙二醇)，以及如果需要，還含有崩解劑，如淀粉、瓊脂、海藻酸或其鹽，通常是藻酸鈉，和/或泡騰混合物、助溶劑、穩定劑、懸浮劑、色素、矯味劑等、可注射的制劑使用的防腐劑、加溶劑、穩定劑等；局部制劑用的基質、稀釋劑、潤滑劑、防腐劑等。

本發明所述“藥學上允許”是指該輔料或載體可與藥效成分兼容，較佳為能穩定藥效成分且對被治療的個體無害。

本發明所述的惡液質包含在惡性腫瘤、結核、糖尿病、血液疾病、內分泌疾病、感染癥、獲得性免疫缺陷綜合癥等的慢性疾病中，以顯著的體重減少、食欲不振等為主癥狀的全身性的綜合癥。例如癌癥惡液質、結核性惡液質、糖尿病性惡液質、血液疾病性惡液質、內分泌疾病性惡液質、感染癥性惡液質、由獲得性免疫缺陷綜合癥導致的惡液質。

優選地，所述惡液質為腫瘤惡液質(即由腫瘤所導致的惡液質)。

優選地，所述治療和/或預防惡液質包括能減輕或改善腫瘤惡液質的癥狀。

優選地，所述治療和/或預防惡液質包括能減輕或改善肌肉、脂肪耗損的惡液質病征。

本文使用的治療和/或預防惡液質，包括減輕或改善患者的惡液質癥狀，進一步的，所述癥狀包括但不限于肌肉、脂肪耗損。

本文使用的短語“藥學上可接受的鹽”是指能保持原有生物活性并且適合于醫藥用途的某些鹽類。化合物1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環十四烷能夠與不同的無機酸和有機酸生成許多不同的鹽。可以制備所述鹽的酸為生成無毒性酸加成鹽的酸，所述鹽包括但不限于檸檬酸鹽、馬來酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、丁二酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、延胡索酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽等。

本文使用的術語“治療”是指減輕或改善病癥，即延緩或抑制病癥或至少一種臨床癥狀的發展。

本文使用的術語“預防”是指所述病癥的癥狀出現之前向受試者施用本發明化合物。

如本文使用，如果受試者將在生物學上、醫學上或生活質量上受益于治療，則受試者“需要”此類治療。

本申請發明人提出機體間充質干細胞的缺失是導致腫瘤惡液質發生的原因，并經過長期研究發現，化合物1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環十四烷或其藥學上可接受的鹽可以有效地治療和/或預防惡液質，為惡液質的治療提供新的思路。不僅是理論上，而且經由實驗結果驗證，它們主要通過阻斷腫瘤對肌肉、脂肪等全身多種組織的間充質干細胞的招募，從而有利于維持機體組織的穩態，延緩惡液質的發生，而且還有利于減輕或緩解患者的惡液質癥狀，改善治療效果，提高生活質量以及延長患者的生存預期。

附圖說明

圖1中的圖a-圖d分別是c57bl/6惡液質組小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后及對照組：(a)小鼠進食檢測；(b)小鼠體重監測；(c)和(d)分別是對脂肪組織和肌肉組織的重量檢測。

圖2中的圖a-圖d分別是nestin-gfp轉基因小鼠對照組和惡液質組：(a)和(b)分別是小鼠脂肪組織切片免疫熒光染色、對切片中nestin-gfp+細胞統計；(c)熒光定量pcr檢測脂肪組織中nestin表達；(d)和(e)分別是小鼠肌肉組織切片免疫熒光染色、對切片中nestin-gfp+細胞統計；(f)熒光定量pcr檢測肌肉組織中nestin表達。

圖3是nestin-gfp轉基因小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后:(a)小鼠腫瘤組織切片免疫熒光染色，以及對切片中nestin-gfp+細胞統計；(b)熒光定量pcr檢測腫瘤組織中gfp表達；(c)和(d)是利用流式細胞術檢測外周血中nestin-gfp+細胞。

圖4是腫瘤趨化因子表達熒光定量pcr檢測結果。

圖5是小鼠msc趨化受體表達檢測結果。

圖6是cxcl12促進小鼠nestin+細胞遷移實驗結果。

圖7是amd3100體內抑制msc遷移實驗結果。

圖8是體內使用amd3100后，小鼠腫瘤惡液質癥狀監測結果。

圖9是體內使用amd3100的荷瘤小鼠生存期實驗結果。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明的技術方案做進一步說明。

amd3100從美國apexbio公司購買，藥物貨號為a2025。

實施例中所用試劑若非特別說明，均為本領域現有常規試劑，均可通過商業渠道購買獲得。實施例中未特別說明的實驗操作，均為本領域常規操作或是本領域技術人員根據其掌握的現有技術或公知常識所能理解或知曉的。

實施例1路易斯肺癌llc的培養，以及小鼠nestin+細胞的分離和培養

1.1llc細胞培養：利用dmem基礎培養基(含10％胎牛血清)培養llc細胞(atcc#crl-1642)，備用。

1.2小鼠肌肉nestin+細胞的分離

取成年nestin-gfp轉基因雄性小鼠(由drmasahiroyamaguchi提供，也可通過商業渠道獲得)，在無菌條件下，完整切取雙側腓腸肌，迅速置于盛有pbs的培養皿中。將肌肉塊以pbs沖洗3遍，剪成小塊肌組織，盡可能剔除血管、神經、結締組織。采用i型膠原酶消化分離肌細胞：將肌組織轉移至離心管，加入i型膠原酶，置于37℃恒溫振蕩水浴箱消化30分鐘。加入血清中止消化，將消化液1,100rpm離心4分鐘，吸除上清液，沉淀以pbs重懸，濾過200目濾網。收集濾液，離心4分鐘，去除上清，沉淀加入pbs重懸，利用流式細胞儀分選nestin+細胞。

1.3小鼠脂肪nestin+細胞的分離

選取6周左右的雄性nestin-gfp轉基因小鼠，在無菌條件下分離小鼠腹股溝處的脂肪組織，pbs充分清洗(至少洗6遍)后，用剪刀將脂肪組織充分剪碎；加入10ml0.1％膠原酶iv+0.05％胰酶+0.1％dispaseⅱ混合液，在37℃攪拌60min；然后加入含10％fbs的α-mem培養基終止消化，用100目及200目篩網過濾，以800g離心5min，棄去上清液，加入培養基輕輕吹打混勻制備細胞懸液；利用流式細胞儀分選nestin+細胞。

1.4小鼠肌肉、脂肪來源nestin+細胞的培養

上述1.2、1.3中從肌肉、脂肪組織獲得的nestin+細胞，用dmem/低糖(10％胎牛血清)培養基貼壁培養。

實施例2小鼠飼養及腫瘤惡液質模型的構建

2.1小鼠飼養方法：用常規小鼠飼料(蛋白質含量在20-25wt％，脂肪含量在5％-10wt％，粗纖維含量在3-5wt％)飼養小鼠。

2.2小鼠腫瘤惡液質模型的構建

取8周齡體重相差不超過2g的雄性c57bl/6小鼠(從南京大學模式動物研究所購買)或nestin-gfp轉基因小鼠，將小鼠隨機分為對照組和惡液質組。每只惡液質組小鼠腹股溝皮下注射約4*10^6個路易斯肺癌llc細胞，實驗過程在超凈臺中進行，注意無菌操作。接種當天計為day0，然后為day1、day2，依次類推。在腫瘤接種第7天檢測到荷瘤小鼠體重開始下降，腫瘤惡液質已經開始發生；到第21天，小鼠體重明顯下降，惡液質體征明顯。

實施例3小鼠腫瘤惡液質的評價

實施例2中惡液質組小鼠接種腫瘤后每天同一時間點觀察小鼠毛色和活動情況、體重、攝食量和腫瘤大小，并與對照組對比。接種腫瘤后每隔2天直至21天，或取第7天、第14天、第21天，采用過量麻醉法處死小鼠，去除腫瘤組織，并稱量所有動物去瘤體重；分離股四頭肌(quad)、腓腸肌(gast)、脛骨前肌(ta)、附睪脂肪組織(ewat)、腹股溝脂肪組織(iwat)、背肩胛間棕色脂肪組織(ibat)，分別進行稱重。

圖1中圖a所示為對照組和惡液質組c57bl/6小鼠每天進食檢測結果，圖b是對照組和惡液質組小鼠的體重監測結果；圖c和圖d分別是脂肪組織和肌肉組織的重量檢測。由圖1可知：c57bl/6小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后，小鼠發生了腫瘤惡液質。

實施例4小鼠骨骼肌、脂肪組織、腫瘤中nestin-gfp+細胞的檢測

4.1免疫熒光染色

對照組和惡液質組的nestin-gfp轉基因小鼠分別分離股四頭肌(quad)、腓腸肌(gast)、脛骨前肌(ta)，用4％pfa固定8h后，換30％濃度(質量)蔗糖脫水48小時，采用冰凍切片。利用laminin抗體標示基底膜后，孵育熒光二抗，利用0.2％1g/mldapi復染細胞核5min，0.01mpbs洗2次，顯微鏡下觀察。

對照組和惡液質組的c57bl/6小鼠分別分離附睪脂肪組織(ewat)、腹股溝脂肪組織(iwat)、背肩胛間棕色脂肪組織(ibat)，用4％pfa固定8h后，利用酒精梯度脫水，采用石蠟切片。利用二甲苯、酒精梯度脫蠟后，參考前文中骨骼肌染色方法利用nestin抗體染色，并在顯微鏡下觀察。

惡液質組nestin-gfp轉基因小鼠的腫瘤組織的處理同肌肉組織，冰凍切片后，利用0.2％1g/mldapi復染細胞核5min，0.01mpbs洗2次，顯微鏡下觀察。

圖2中的圖a為nestin-gfp轉基因小鼠惡液質組在皮下移植llc腫瘤細胞后7天、14天、21天，以及對照組的小鼠脂肪組織切片免疫熒光染色觀察結果；圖2中的圖b是nestin-gfp轉基因小鼠惡液質組在皮下移植llc腫瘤細胞后7天、14天、21天的小鼠脂肪組織切片中nestin-gfp+細胞統計和對照組的nestin-gfp+細胞統計結果。

圖2中的圖d是nestin-gfp轉基因小鼠惡液質組在皮下移植llc腫瘤細胞后7天、14天、21天，以及對照組培養21天的小鼠肌肉組織切片免疫熒光染色觀察結果；圖2中的圖e是nestin-gfp轉基因小鼠惡液質組在皮下移植llc腫瘤細胞后7天、14天、21天，以及對照組培養21天的小鼠肌肉組織切片中nestin-gfp+細胞統計結果。

圖3中的圖a是nestin-gfp轉基因小鼠惡液質組在皮下移植llc腫瘤細胞后7天、14天、21天的腫瘤組織切片免疫熒光染色觀察結果；圖3中的圖c和圖d是利用流式細胞術檢測對照組和惡液質組的小鼠外周血中nestin-gfp+細胞的結果圖。

4.2熒光定量pcr

用定量pcr對nestin基因表達進行分析的具體步驟如下：從實施例2每個實驗組中小鼠取肌肉(quad、gast、ta)和脂肪(ewat、iwat、ibat)、以及惡液質組中小鼠取腫瘤組織，液氮研磨組織后，使用trizol法提取總rna。對rna進行逆轉錄，得到單鏈cdna，然后利用roche公司lc480系統進行熒光定量pcr檢測nestin或gfp基因表達狀況，所用的nestin引物為5’-ggctacatacaggattctgctgg-3’(f)和5’-caggaaagccaagagaagcct-3’(r)，所用的gfp引物為5’-ggagctgcacacaacccattgcc-3’(f)和5’-gatcactctcggcatggacgagc-3’(f)。

檢測結果見圖2中的圖c、f。其中，圖2中的圖c是nestin-gfp轉基因小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后熒光定量pcr檢測脂肪組織中的nestin表達；圖2中的圖f是nestin-gfp轉基因小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后熒光定量pcr檢測肌肉組織中的nestin表達。

圖3中的圖b是nestin-gfp轉基因小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后熒光定量pcr檢測腫瘤組織中gfp表達。

由實施例4的檢測結果可見：nestin-gfp轉基因小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后，骨骼肌和脂肪組織中nestin-gfp+細胞不斷減少，腫瘤中nestin-gfp+細胞不斷增加。

實施例5腫瘤趨化因子表達檢測，與小鼠msc趨化受體表達檢測

5.1腫瘤趨化因子表達利用熒光定量pcr檢測

利用4.2提到的腫瘤組織處理方法得到單鏈cdna，然后利用roche公司lc480系統進行熒光定量pcr檢測各趨化因子基因表達狀況。

熒光定量pcr所用的各引物如下：

(1)小鼠ccl2引物為：

5’-tgtcatgcttctgggcctgct-3’(f)；和

5’-ttcactgtcacactggtcact-3’(r)；

(2)小鼠ccl3引物為：

5’-ggtctccacactgccctt-3’(f)；和

5’-tcaggcattcagttccaggtc-3’(r)，

(3)ccl5引物為：

5’-atatggctcggacaccactc-3’(f)；和

5’-tccttcgagtgacaaacacg-3’(r)，

(4)ccl7引物為：

5’-gtgtccctgggaagctgtta-3’(f)；和

5’-ctttggagttggggttttca-3’(r)，

(5)ccl8引物為：

5’-cgcagtgcttctttgcctg-3’(f)；和

5’-tctggcccagtcagcttctc-3’(r)，(6)cxcl1引物為：

5’-gctgggattcacctcaagaa-3’(f)；和

5’-aagggagcttcagggtcaag-3’(r)，

(7)cxcl2引物為：

5’-gccaagggttgacttcaaga-3’(f)；和

5’-ttcagggtcaaggcaaactt-3’(r)，

(8)cxcl3引物為：

5’-ttctaaatcagagaaaagcgat-3’(f)；和

5’-tagatgcaattatacccgtag-3’(r)，

(9)cxcl11引物為：

5’-tgtaatttacccgagtaacggc-3’(f)；和

5’-cacctttgtcgtttatgagcctt-3’(r)，

(10)cxcl12引物為：

5’-tgcatcagtgacggtaaacca-3’(f)；和

5’-ttcttcagccgtgcaacaatc-3’(r)，

(11)hgf引物為：

5’-tcttgccagaaagatatccc-3’(f)；和

5’-ttttaattgcacaatactccc-3’(r)。

熒光定量pcr結果如圖4所示，從圖4可見，小鼠腫瘤中高表達趨化因子cxcl12。

5.2小鼠msc趨化受體cxcr4表達檢測

將小鼠脂肪和肌肉來源的細胞利用4％pfa固定15min后，利用0.2％triton穿透15min，再利用1％bsa封閉30min。4℃孵育1:100稀釋的nestin抗體(小鼠來源)和1:100稀釋的cxcr4抗體(兔來源)14h。pbs洗10min，3遍，再37℃孵育綠色小鼠熒光二抗(1:500)和紅色兔熒光二抗(1:500)30min。pbs洗10min，3遍，利用0.2％1g/mldapi復染細胞核5min，0.01mpbs洗2次，顯微鏡下觀察。可見，從小鼠肌肉和脂肪組織分離得來的nestin+細胞表達cxcr4。

實施例6cxcl12促進小鼠nestin+細胞遷移實驗

將corningtranswell小室(8μm孔徑)架在24孔板上，接種體外培養的肌肉和脂肪來源的nestin+細胞(見實施例1)于transwell的小室中，2x10⁴個/孔，置5％co²、37℃培養箱中培養。每孔分別加入500μldmem/低糖到transwell下室，實驗組含1μmol/mlcxcl12因子，對照組不添加cxcl12因子。24小時后取出小室，用棉簽擦去小室內側的細胞，輕柔沖洗；無水乙醇固定漂洗兩遍；將各組小室做好標記，分別架在廢棄的孔板上，每孔中加入結晶紫染色液，室溫孵育15分鐘；洗去多余染液。在倒置顯微鏡下檢測各組遷移的細胞數量，隨機取個5視野(400倍)，計算每組遷移細胞鏡下數目，每組3個復孔，將所得結果取平均值。結果見圖6所示，從圖6可見，cxcl12可促進小鼠nestin+細胞的遷移。

實施例7amd3100體內抑制msc遷移實驗實施例

取8周齡體重相差不超過2g的雄性c57bl/6小鼠，設對照組(control)、惡液質組(llc)、及amd3100組(llc+amd3100)。

對照組：不處理。

惡液質組：將4x106llc移植至小鼠腹股溝皮下。7天后，使用100μl10％水合氯醛麻醉小鼠，在其背部皮下植入alzet緩釋泵(型號：1004)，泵內含有生理鹽水。

amd3100組：將4x106llc移植至小鼠腹股溝皮下。7天后，使用100μl10％水合氯醛麻醉小鼠，在其背部皮下植入alzet緩釋泵(型號：1004)，泵內含有amd3100。小鼠amd3100的使用量為0.15mg/kg體重/天。安裝緩釋泵14天后，處死小鼠，取肌肉和脂肪組織切片進行免疫熒光染色或提取rna逆轉錄進行熒光定量pcr，檢測nestin的表達。

免疫熒光染色結果參見圖7中圖a、圖b。圖7中的圖a為nestin-gfp轉基因小鼠惡液質組、amd3100組在皮下移植llc腫瘤細胞后21天后，以及對照組小鼠培養21天后小鼠脂肪組織切片免疫熒光染色觀察結果；圖7中的圖b是nestin-gfp轉基因小鼠惡液質組、amd3100組在皮下移植llc腫瘤細胞后21天后，以及對照組小鼠培養21天后的小鼠脂肪組織切片中nestin-gfp+細胞統計結果。

圖7中圖c、圖d。圖7中的圖c為nestin-gfp轉基因小鼠惡液質組、amd3100組在皮下移植llc腫瘤細胞后21天后，及對照組小鼠培養21天后小鼠肌肉組織切片免疫熒光染色觀察結果；圖7中的圖d是nestin-gfp轉基因小鼠惡液質組、amd3100組在皮下移植llc腫瘤細胞后21天后，及對照組小鼠培養21天后的小鼠肌肉組織切片中nestin-gfp+細胞統計結果。

由實驗結果可見，體內使用amd3100后，荷瘤小鼠骨骼肌和脂肪組織中nestin-gfp+細胞增加。

實施例8amd3100延長荷瘤小鼠生存期實施例

取8周齡體重相差不超過2g的雄性c57bl/6小鼠。設對照組(control)、惡液質組(llc)、及amd3100組(llc+amd3100)。

對照組：不處理。

惡液質組：將4x106llc移植至小鼠腹股溝皮下。7天后，使用100μl10％水合氯醛麻醉小鼠，在其背部皮下植入alzet緩釋泵(型號：1004)，泵內含有生理鹽水。

amd3100組：將4x10⁶llc移植至小鼠腹股溝皮下7天后，使用100μl10％水合氯醛麻醉小鼠，在其背部皮下植入alzet緩釋泵(型號：1004)，泵內含有amd3100。小鼠amd3100的使用量為0.15mg/kg體重/天。連續觀察小鼠狀態至腫瘤細胞接種后35天。

實驗結果參見圖8、圖9。

其中，圖8中的圖a是各實驗組小鼠體重情況，圖8中的圖b是各實驗組小鼠脂肪和肌肉組織發生萎縮情況。圖8中的圖c是各實驗組小鼠的脂肪和肌肉重量情況。由圖8的實驗結果可見，體內使用amd3100后，小鼠腫瘤惡液質癥狀得到緩解。

圖9是各實驗組小鼠生存期對比圖，可見，體內使用amd3100，能夠延長荷瘤小鼠生存期。

本發明通過上述實驗，證實了腫瘤惡液質的發生與間充質干細胞有關，并評估了nestin+間充質干細胞在發生腫瘤惡液質的小鼠肌肉和脂肪組織中的含量。對小鼠肌肉和脂肪進行切片和免疫熒光染色，統計nestin+細胞數量，發現發生腫瘤惡液質小鼠相對正常小鼠具有更少的nestin+細胞。同時，熒光定量pcr也提示，發生腫瘤惡液質小鼠肌肉和脂肪中nestin表達下降。以上結果提示，腫瘤惡液質的發生，伴隨著肌肉和組織中間充質干細胞的減少。

本申請發明人利用nestin-gfp轉基因小鼠，給小鼠荷瘤后，在腫瘤切片中發現了nestin-gfp+細胞。并且隨著腫瘤惡液質的發生，nestin-gfp+細胞的數目會越來越多。以上結果提示，機體nestin+細胞減少，是因為向腫瘤發生了遷移，證明了機體間充質干細胞的減少是因為向腫瘤發生了遷移。

本申請發明人首先利用熒光定量pcr在腫瘤中檢測到了cxcl12的高表達，而通過免疫熒光染色，發現從小鼠肌肉和脂肪組織分離得來的nestin+細胞表達cxcr4。在體外，發明人使用cxcl12發現可以促進肌肉和脂肪來源nestin+細胞的transwell遷移。在小鼠體內，利用alzet緩釋泵給荷瘤小鼠使用0.15mg/kg體重/天的amd3100，可以成功抑制肌肉和脂肪nestin+細胞向腫瘤的遷移，使肌肉脂肪中nestin+細胞相對不給amd3100組有明顯恢復。以上結果證實在腫瘤惡液質的情況下，cxcl12-cxcr4趨化軸介導小鼠肌肉和脂肪來源nestin+細胞的遷移。

本申請發明人通過對小鼠體重以及肌肉、脂肪的重量的稱量，發現在荷瘤同等天數，使用amd3100的小鼠比不使用的小鼠惡液質癥狀更輕。另外，對荷瘤小鼠的生存期觀察發現，amd3100的小鼠比不使用的小鼠生存期更長。

以上實驗結果顯示，amd3100對于腫瘤惡液質的預防和治療有著明顯的療效，對腫瘤患者使用amd3100，可以阻斷腫瘤對肌肉、脂肪、骨髓等全身多種組織的間充質干細胞的招募，有利于維持機體組織的穩態，延緩腫瘤惡液質的發生，并有利于減輕腫瘤患者的惡液質癥狀，改善腫瘤治療效果，提高生活質量，延長生存預期。

以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非對本發明做任何形式上的限制，故凡未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發明技術方案的范圍內。

序列表

<110>中山大學

<120>amd3100在制備治療和/或預防惡液質的藥物中的應用

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