本發(fā)明涉及具有淋巴靶向功能的新劑型的設(shè)計(jì)和制備，提供了一種在體自組裝納米晶注射劑的處方組成、制備方法。

背景技術(shù)：

淋巴道轉(zhuǎn)移是影響惡性腫瘤預(yù)后的重要因素之一。腫瘤細(xì)胞在早期即可進(jìn)入淋巴系統(tǒng)而擴(kuò)散,通過(guò)淋巴管側(cè)支循環(huán)進(jìn)入非所屬淋巴結(jié)或遠(yuǎn)離原發(fā)灶的淋巴結(jié),形成所謂跳躍式轉(zhuǎn)移,使外科手術(shù)的應(yīng)用受到限制。區(qū)域淋巴結(jié)對(duì)放療的敏感性低于原發(fā)灶,全身化療對(duì)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的療效不佳,原因在于常規(guī)劑型的化療藥物不易轉(zhuǎn)運(yùn)至淋巴結(jié)。由于治療淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的療效直接影響患者的治愈率和生存率,所以針對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的靶向越來(lái)越受到重視。淋巴結(jié)已成為腫瘤化療中一個(gè)非常有潛力的靶器官。

利用大分子物質(zhì)和微粒易被淋巴系統(tǒng)吞噬的特性設(shè)計(jì)新型給藥系統(tǒng)使淋巴靶向得以實(shí)現(xiàn)。目前所用藥物載體有乳劑、活性炭、環(huán)糊精、脂質(zhì)體、微球、樹狀大分子、納米結(jié)晶等,它們與化療藥物或成像物質(zhì)的結(jié)合方式有化學(xué)鍵、乳化、吸附、包合、包封等。雖然這些藥物載體與小分子藥物相比具有明顯的淋巴靶向性，但是同時(shí)這些載體的體外儲(chǔ)存穩(wěn)定性和體內(nèi)稀釋穩(wěn)定性較差，生理環(huán)境下維持有效的藥物包載和載體完整性的能力也不明確。

納米結(jié)晶(nanocrystals)也稱為納米晶或納米混懸液，是以少量表明活性劑或聚合物為穩(wěn)定劑，通過(guò)自組裝或粉碎技術(shù)制備的一種亞微膠體分散系，其粒徑在1-100nm之間，因此也具有良好淋巴靶向功能。相比于其它給藥系統(tǒng)，納米晶體直接由藥物形成，具有載藥量高、易工業(yè)化生產(chǎn)、制備成本相對(duì)較低的優(yōu)勢(shì),同時(shí)還能應(yīng)用于多種給藥途徑，如皮下注射、靜脈注射、口服給藥、經(jīng)皮給藥等。

納米晶體本身具有較高的活性，非常不穩(wěn)定，滿足一定激活條件時(shí)，就會(huì)釋放出過(guò)剩的自由能，粒子長(zhǎng)大，從而也將失去納米材料所具有的特性。目前制備藥物納米結(jié)晶有自下而上(體外自組裝技術(shù))和自上而下(破碎技術(shù))兩種基本工藝，因?yàn)轶w外自組裝技術(shù)種類有一些無(wú)法克服的缺陷，如有機(jī)溶劑殘留、制劑物理穩(wěn)定性差、易發(fā)生奧式熟化等，因此破碎技術(shù)在醫(yī)藥行業(yè)中應(yīng)用相對(duì)廣泛，但是由于在破碎過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的能量，可能產(chǎn)生晶型轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。因此與其他給藥系統(tǒng)相比，納米晶體也具有體外穩(wěn)定性差、體內(nèi)穩(wěn)定性難于控制、制備技術(shù)會(huì)影響制劑的穩(wěn)定性且難于放大的缺陷。因此對(duì)納米晶體的制備產(chǎn)生了困難，阻礙了臨床應(yīng)用。

以上所述的具有淋巴靶向功能的新型給藥系統(tǒng)，給藥方式可以選擇組織間隙給藥、粘膜給藥、血管給藥、消化道給藥等。其中，組織間隙給藥也稱為間質(zhì)給藥，當(dāng)給藥系統(tǒng)進(jìn)行皮下、肌內(nèi)、瘤周、瘤內(nèi)等組織間隙給藥時(shí)同時(shí)具有毛細(xì)血管和毛細(xì)淋巴管的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取，由于內(nèi)皮細(xì)胞間連接松散，常有許多開放的間隙存在，載藥系統(tǒng)可通過(guò)毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞間間隙和內(nèi)皮細(xì)胞的胞飲及吞噬作用進(jìn)入毛細(xì)淋巴管內(nèi)，然后通過(guò)淋巴引流到達(dá)區(qū)域淋巴結(jié)。由于這種給藥方式在淋巴靶向方面的優(yōu)勢(shì)，成為了具有淋巴靶向功能的給藥系統(tǒng)最為常見的給藥方式。迄今為止，fda共批準(zhǔn)過(guò)三種用于淋巴靶向的制劑，分別為1974年批準(zhǔn)的硫膠體、1981年批準(zhǔn)的異硫藍(lán)和2013年批準(zhǔn)的lymphoseek。國(guó)內(nèi)僅有重慶萊美藥業(yè)的納米炭混懸注射液(卡納林)批準(zhǔn)上市。這四種具有淋巴靶向功能的已上市制劑的給藥方式均選擇的是瘤內(nèi)或瘤周組織間隙給藥。

米托蒽醌(mitoxantrone)是廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)，藥理學(xué)等科研方面的科研試劑。同時(shí)也是一種抗生素類抗腫瘤藥物，其結(jié)構(gòu)及抗癌作用與阿霉素相近，其無(wú)氨基糖結(jié)構(gòu)，不產(chǎn)生自由基，且有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用，可以殺滅任何細(xì)胞周期的腫瘤細(xì)胞，增殖與非增殖細(xì)胞均受到抑制，因此其抗腫瘤活性相當(dāng)或略高于阿霉素，明顯高于環(huán)磷酰胺、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿和阿糖胞苷，抗癌譜廣。米托蒽醌原料藥粉末和溶液均具有顏色，原料藥粉末外觀為紫褐色粉末，于水溶液中呈深藍(lán)色，于濃硫酸中呈深紫紅色。已上市的注射用鹽酸米托蒽醌為溶液劑，給藥途徑為靜脈注射，適應(yīng)癥為主要用于惡性淋巴瘤、乳腺癌和急性白血病。國(guó)內(nèi)外均無(wú)已上市并且具有淋巴靶向功能的米托蒽醌及其鹽類的藥物制劑上市。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明多解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種能夠在體生物自組裝成納米晶體的溶液型注射劑的處方組成、制備方法、給藥方式和設(shè)計(jì)原理。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種具有淋巴靶向功能的生物自組裝納米晶注射劑，其組分按照質(zhì)量體積比(g/ml)含有米托蒽醌或米托蒽醌鹽類：0.05％-5％，滲透壓調(diào)節(jié)劑：0.1-10％，其余為溶劑。

優(yōu)選的，還含有緩沖劑：0.01-0.1％、抗氧劑：0.01-0.1％、吸附劑：0.05-1％，填充劑：0-20％。

優(yōu)選的，注射劑中米托蒽醌或米托蒽醌鹽類濃度范圍為0.1％到1％。

ph范圍為2.0到6.0。

優(yōu)選的，ph范圍為3.5到5.5。

滲透壓范圍為285到2317mmol/kg。

優(yōu)選的，滲透壓范圍為307到1503mmol/kg。

優(yōu)選的，米托蒽醌鹽類采用鹽酸米托蒽醌、草酸米托蒽醌、硫酸米托蒽醌、磷酸米托蒽醌、醋酸米托蒽醌、枸櫞酸米托蒽醌中的一種或幾種。

生物自組裝納米晶在生理?xiàng)l件下粒徑范圍為1-1000nm。

優(yōu)選的，生物自組裝納米晶在生理?xiàng)l件下粒徑范圍為10-100nm。

優(yōu)選的，生物自組裝納米晶在生理?xiàng)l件下粒徑范圍為30-60nm。

優(yōu)選的，注射劑類別分為小水針或粉針劑，小水針中填充劑為0，粉針劑中填充劑為大于0小于等于20％。

優(yōu)選的，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑采用氯化鈉、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、甘油、peg、磷酸鹽、枸櫞酸鹽、采用上述一種或者幾種物質(zhì)的混合物；

優(yōu)選的，所述的緩沖劑采用醋酸、醋酸鈉、枸櫞酸、枸櫞酸鈉中的一種或者幾種；

優(yōu)選的，所述的抗氧劑采用亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、依地酸二鈉中的一種或者幾種；

優(yōu)選的，所述的填充劑采用單糖類的葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖或脫氧核糖、或者采用二糖類的蔗糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖、或者采用聚合糖類的甘露醇、山梨醇、乳糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、赤蘚糖醇中的一種或者幾種；

優(yōu)選的，所述吸附劑為活性炭。

優(yōu)選的，實(shí)現(xiàn)淋巴靶向功能后，淋巴結(jié)會(huì)產(chǎn)生肉眼可見的藍(lán)色。

優(yōu)選的，實(shí)現(xiàn)淋巴靶向功能后，腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)縮小或恢復(fù)正常大小。

優(yōu)選的，其中給藥注射劑為溶液型，米托蒽醌或其鹽類以完全溶解的分子形式存在。

優(yōu)選的，溶液型注射劑間質(zhì)給藥后，在注射部位自組裝成納米晶體。

優(yōu)選的，實(shí)現(xiàn)淋巴靶向功能給藥方式為間質(zhì)注射給藥。

優(yōu)選的，包括皮下間質(zhì)注射、肌肉間質(zhì)注射、肌肉間質(zhì)注射、粘膜下間質(zhì)注射、腹腔間質(zhì)注射、組織內(nèi)間質(zhì)注射、組織周間質(zhì)注射，或者采用上述幾種給藥方式的組合。

一種具有淋巴靶向功能的生物自組裝納米晶注射劑的制備方法，所述的注射劑為小水針類生物自組裝納米晶注射劑，包含如下制備流程：稱取適量的原輔料，向濃配罐中加入處方量70％注射用水，加入處方量的輔料，攪拌約15分鐘使溶解，再加入米托蒽醌或米托蒽醌鹽類，攪拌約20分鐘使溶解，投入活性炭，于40-60℃攪拌吸附20分鐘，濃配液經(jīng)3μm不銹鋼折疊濾芯過(guò)濾后轉(zhuǎn)至稀釋罐中，補(bǔ)加注射用水至配液總量，攪拌10分鐘，藥液經(jīng)兩支串聯(lián)的除菌過(guò)濾器過(guò)濾，過(guò)濾器孔徑為0.22μm，無(wú)菌分裝封口。

優(yōu)選的，所述注射劑為粉針類生物自組裝納米晶注射劑，包含如下制備流程：稱取適量的原輔料，向濃配罐中加入處方量70％注射用水，加入處方量的輔料，攪拌約15分鐘使溶解，再加入米托蒽醌或米托蒽醌鹽類，攪拌約20分鐘使溶解，投入活性炭，于40-60℃攪拌吸附20分鐘，濃配液經(jīng)3μm不銹鋼折疊濾芯過(guò)濾后轉(zhuǎn)至稀釋罐中，補(bǔ)加注射用水至配液總量，攪拌10分鐘，藥液經(jīng)兩支串聯(lián)的除菌過(guò)濾器，孔徑為0.22μm，過(guò)濾，加入甘露醇溶解后，經(jīng)冷凍干燥去除水分，得到干燥的生物自組裝納米晶注射用凍干粉，使用前水化振搖后可間質(zhì)注射給藥，水化介質(zhì)選擇注射用水、生理鹽水、葡萄糖注射液中的一種或者幾種。

本發(fā)明中的質(zhì)量體積百分比均指的是g/ml。

本發(fā)明選擇鹽酸米托蒽醌作為生物自組裝納米晶體的活性成分，鹽酸米托蒽醌在本品制備形成的酸性條件下以水溶性良好的鹽酸鹽形式存在。

(1)酸性條件的ph值對(duì)注射劑體內(nèi)自組裝納米晶行為有關(guān)鍵的影響，當(dāng)注射劑的ph范圍在2.0到6.0之間時(shí)，以間質(zhì)注射作為給藥方式，間質(zhì)部位的特點(diǎn)是存在ph7.4的體液，在生理?xiàng)l件ph環(huán)境，鹽酸米托蒽醌的鹽酸基團(tuán)被中和后還原成為米托蒽醌，從而溶解度降低產(chǎn)生納米晶析出的現(xiàn)象。當(dāng)注射劑的ph值小于2.0，ph7.4的體液不能實(shí)現(xiàn)中和作用，從而無(wú)法有效產(chǎn)生納米晶；當(dāng)注射劑的ph值大于6.0，注射液中鹽酸米托蒽醌產(chǎn)生不穩(wěn)定的析出現(xiàn)象，影響注射劑的質(zhì)量。經(jīng)過(guò)有效的處方優(yōu)化，確定當(dāng)注射劑的ph值范圍在3.5到5.5之間時(shí)，ph7.4體液的中和作用發(fā)揮的最充分，能夠在間質(zhì)部位快速形成大量滿足淋巴靶向功能的納米晶。

(2)間質(zhì)部位體液量少，因此給藥濃度顯著影響納米晶的生成量和生成速度。本發(fā)明的最適給藥濃度范圍為0.05-5％(g/ml，w：v)，低于給藥濃度范圍，間質(zhì)注射后在生理?xiàng)l件下難于形成具有靶向能力的納米晶體，高于給藥濃度范圍，對(duì)淋巴系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生毒副作用。

(3)間質(zhì)部位體液循環(huán)速度較慢，間質(zhì)部位注射的藥物進(jìn)入淋巴系統(tǒng)的動(dòng)力主要來(lái)自于間質(zhì)部位和淋巴系統(tǒng)的滲透壓差異，低滲注射劑不利于藥物通過(guò)毛細(xì)淋巴管間隙引流至淋巴系統(tǒng)，因此注射劑等滲或偏高滲有利于自主裝納米晶的淋巴引流。本發(fā)明中適合的滲透壓范圍為285到2317mmol/kg，最適的滲透壓范圍為307到1503mmol/kg，當(dāng)滲透壓小于285mmol/kg時(shí)，淋巴引流動(dòng)力不足，當(dāng)滲透壓大于2317mmol/kg，在注射劑中滲透壓調(diào)節(jié)劑濃度過(guò)高，產(chǎn)生注射部位刺激性。

間質(zhì)注射部位體液量少、ph值7.4、循環(huán)速度較慢，正因?yàn)檫@樣的生理?xiàng)l件特征，在適當(dāng)?shù)淖⑸鋭﹑h值、適當(dāng)?shù)慕o藥濃度和適當(dāng)?shù)臐B透壓，鹽酸米托蒽醌脫去鹽酸基團(tuán)后水溶性降低，在間質(zhì)部位自組裝成為粒徑大于30nm、小于60nm的納米晶體，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞間存在一定交疊間隙，小分子藥物和粒徑小于20nm的納米粒子，皮下注射后會(huì)在注射部位產(chǎn)生彌散效果，粒徑在20nm到100nm的范圍內(nèi)，能通過(guò)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，產(chǎn)生良好的淋巴靶向效果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

小水針型生物自組裝納米晶注射劑的處方及1000支的用量如下：

稱取適量的原輔料，向濃配罐中加入處方量70％注射用水，加入處方量的輔料，攪拌約15分鐘使溶解，再加入鹽酸米托蒽醌，攪拌約20分鐘使溶解。

由該處方工藝制備的小水針型生物自組裝納米晶注射劑中鹽酸米托蒽醌的濃度為0.58％，測(cè)定ph值為3.5，滲透壓為196mmol/kg。在間質(zhì)生物條件下自組裝納米晶的粒徑為50nm。皮下間質(zhì)給藥后轉(zhuǎn)移的一級(jí)呈肉眼可見的深藍(lán)色，二級(jí)和三級(jí)淋巴結(jié)呈肉眼可見淺藍(lán)色。各級(jí)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的重量和體積顯著下降或恢復(fù)正常且對(duì)注射部位和淋巴細(xì)胞沒(méi)有顯著毒性。

實(shí)施例2

小水針型生物自組裝納米晶注射劑的處方及1000支的用量如下：

稱取適量的原輔料，向濃配罐中加入處方量70％注射用水，加入處方量的輔料，攪拌約15分鐘使溶解，再加入鹽酸米托蒽醌，攪拌約20分鐘使溶解，投入活性炭，于40-60℃攪拌吸附20分鐘。濃配液經(jīng)3μm不銹鋼折疊濾芯過(guò)濾后轉(zhuǎn)至稀釋罐中，補(bǔ)加注射用水至配液總量，攪拌10分鐘。藥液經(jīng)兩支串聯(lián)的除菌過(guò)濾器(孔徑為0.22μm)過(guò)濾，無(wú)菌分裝封口。

由該處方工藝制備的小水針型生物自組裝納米晶注射劑中鹽酸米托蒽醌的濃度為0.57％，測(cè)定ph值為3.5，滲透壓為938mmol/kg。在間質(zhì)生物條件下自組裝納米晶的粒徑為50nm。皮下間質(zhì)給藥后轉(zhuǎn)移的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)淋巴結(jié)呈肉眼可見的深藍(lán)色。各級(jí)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的重量和體積顯著下降或恢復(fù)正常且對(duì)注射部位和淋巴細(xì)胞沒(méi)有顯著毒性。

實(shí)施例3

小水針型生物自組裝納米晶注射劑的處方及1000支的用量如下：

稱取適量的原輔料，向濃配罐中加入處方量70％注射用水，加入處方量的輔料，攪拌約15分鐘使溶解，再加入草酸米托蒽醌，攪拌約20分鐘使溶解，投入活性炭，于40-60℃攪拌吸附20分鐘。濃配液經(jīng)3μm不銹鋼折疊濾芯過(guò)濾后轉(zhuǎn)至稀釋罐中，補(bǔ)加注射用水至配液總量，攪拌10分鐘。藥液經(jīng)兩支串聯(lián)的除菌過(guò)濾器(孔徑為0.22μm)過(guò)濾，無(wú)菌分裝封口。

由該處方工藝制備的小水針型生物自組裝納米晶注射劑中草酸米托蒽醌的濃度為0.056％，測(cè)定ph值為5.5，滲透壓為1503mmol/kg。在間質(zhì)生物條件下自組裝納米晶的粒徑為40nm。皮下間質(zhì)給藥后轉(zhuǎn)移的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)淋巴結(jié)呈肉眼可見的淺藍(lán)色，各級(jí)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的重量和體積有一定的下降且對(duì)注射部位和淋巴細(xì)胞沒(méi)有顯著毒性。

實(shí)施例4

小水針型生物自組裝納米晶注射劑的處方及1000支的用量如下：

稱取適量的原輔料，向濃配罐中加入處方量70％注射用水，加入處方量的輔料，攪拌約15分鐘使溶解，再加入硫酸米托蒽醌，攪拌約20分鐘使溶解，投入活性炭，于40-60℃攪拌吸附20分鐘。濃配液經(jīng)3μm不銹鋼折疊濾芯過(guò)濾后轉(zhuǎn)至稀釋罐中，補(bǔ)加注射用水至配液總量，攪拌10分鐘。藥液經(jīng)兩支串聯(lián)的除菌過(guò)濾器(孔徑為0.22μm)過(guò)濾，無(wú)菌分裝封口。

由該處方工藝制備的小水針型生物自組裝納米晶注射劑中硫酸米托蒽醌的濃度為5.44％，測(cè)定ph值為3.5，307mmol/kg。在間質(zhì)生物條件下自組裝納米晶的粒徑為60nm。皮下間質(zhì)給藥后轉(zhuǎn)移的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)淋巴結(jié)呈肉眼可見的深藍(lán)色，各級(jí)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的重量和體積恢復(fù)至正常大小且對(duì)注射部位和淋巴細(xì)胞有顯著毒性。

實(shí)施例5

粉針型生物自組裝納米晶注射劑的處方及1000支的用量如下：

制備工藝如下：

稱取適量的原輔料，向濃配罐中加入處方量70％注射用水，加入除填充劑以外的處方量的輔料，攪拌約15分鐘使溶解，再加入鹽酸米托蒽醌，攪拌約20分鐘使溶解，投入活性炭，于40-60℃攪拌吸附20分鐘。濃配液經(jīng)3μm不銹鋼折疊濾芯過(guò)濾后轉(zhuǎn)至稀釋罐中，補(bǔ)加注射用水至配液總量，攪拌10分鐘。藥液經(jīng)兩支串聯(lián)的除菌過(guò)濾器(孔徑為0.22μm)過(guò)濾，加入甘露醇溶解后，經(jīng)冷凍干燥去除水分，得到干燥的生物自組裝納米晶注射用凍干粉，使用前水化振搖后可間質(zhì)注射給藥。

由該處方工藝制備的粉針型生物自組裝納米晶注射劑冷凍干燥后表面光滑無(wú)塌陷，無(wú)皺縮。注射用水水化后形成鹽酸米托蒽醌注射液，其中鹽酸米托蒽醌的濃度為0.52％，測(cè)定ph值為3.5，滲透壓為938mmol/kg。在間質(zhì)生物條件下自組裝納米晶的粒徑為40nm。皮下間質(zhì)給藥后，轉(zhuǎn)移的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)淋巴結(jié)呈肉眼可見的深藍(lán)色，各級(jí)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的重量和體積顯著減小或恢復(fù)至正常大小且對(duì)注射部位和淋巴細(xì)胞沒(méi)有顯著毒性。

實(shí)施例6

粉針型生物自組裝納米晶注射劑的處方及1000支的用量如下：

制備工藝如下：

稱取適量的原輔料，向濃配罐中加入處方量70％注射用水，加入除填充劑以外的處方量的輔料，攪拌約15分鐘使溶解，再加入磷酸米托蒽醌，攪拌約20分鐘使溶解，投入活性炭，于40-60℃攪拌吸附20分鐘。濃配液經(jīng)3μm不銹鋼折疊濾芯過(guò)濾后轉(zhuǎn)至稀釋罐中，補(bǔ)加注射用水至配液總量，攪拌10分鐘。藥液經(jīng)兩支串聯(lián)的除菌過(guò)濾器(孔徑為0.22μm)過(guò)濾，加入蔗糖溶解后，經(jīng)冷凍干燥去除水分，得到干燥的生物自組裝納米晶注射用凍干粉，使用前水化振搖后可間質(zhì)注射給藥。

由該處方工藝制備的粉針型生物自組裝納米晶注射劑冷凍干燥后表面出現(xiàn)塌陷和皺縮。注射用水水化后形成磷酸米托蒽醌注射液，其中磷酸米托蒽醌的濃度為0.499％，測(cè)定ph值為5.5，滲透壓為307mmol/kg。在間質(zhì)生物條件下自組裝納米晶的粒徑為55nm。皮下間質(zhì)給藥后，轉(zhuǎn)移的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)淋巴結(jié)呈肉眼可見的深藍(lán)色，各級(jí)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的重量和體積顯著減小或恢復(fù)至正常大小且對(duì)注射部位和淋巴細(xì)胞沒(méi)有顯著毒性。

實(shí)施例7

粉針型生物自組裝納米晶注射劑的處方及1000支的用量如下：

制備工藝如下：

稱取適量的原輔料，向濃配罐中加入處方量70％注射用水，加入除填充劑以外的處方量的輔料，攪拌約15分鐘使溶解，再加入醋酸米托蒽醌，攪拌約20分鐘使溶解，投入活性炭，于40-60℃攪拌吸附20分鐘。濃配液經(jīng)3μm不銹鋼折疊濾芯過(guò)濾后轉(zhuǎn)至稀釋罐中，補(bǔ)加注射用水至配液總量，攪拌10分鐘。藥液經(jīng)兩支串聯(lián)的除菌過(guò)濾器(孔徑為0.22μm)過(guò)濾，加入海藻糖溶解后，經(jīng)冷凍干燥去除水分，得到干燥的生物自組裝納米晶注射用凍干粉，使用前水化振搖后可間質(zhì)注射給藥。

由該處方工藝制備的粉針型生物自組裝納米晶注射劑冷凍干燥后表面出現(xiàn)塌陷和皺縮。注射用水水化后形成醋酸米托蒽醌注射液，其中醋酸米托蒽醌的濃度為0.52％，測(cè)定ph值為3.5，滲透壓為1503mmol/kg。在間質(zhì)生物條件下自組裝納米晶的粒徑為60nm。皮下間質(zhì)給藥后，轉(zhuǎn)移的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)淋巴結(jié)呈肉眼可見的深藍(lán)色，各級(jí)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的重量和體積顯著減小或恢復(fù)至正常大小且對(duì)注射部位和淋巴細(xì)胞沒(méi)有顯著毒性。

本發(fā)明中1000支指的是制備出的注射劑分成1000份。

對(duì)比例1

小水針型生物自組裝納米晶注射劑的處方及1000支的用量如下：

稱取適量的原輔料，向濃配罐中加入處方量70％注射用水，加入處方量的輔料，攪拌約15分鐘使溶解，再加入鹽酸米托蒽醌，攪拌約20分鐘使溶解，投入活性炭，于40-60℃攪拌吸附20分鐘。濃配液經(jīng)3μm不銹鋼折疊濾芯過(guò)濾后轉(zhuǎn)至稀釋罐中，補(bǔ)加注射用水至配液總量，攪拌10分鐘。藥液經(jīng)兩支串聯(lián)的除菌過(guò)濾器(孔徑為0.22μm)過(guò)濾，無(wú)菌分裝封口。

由該處方工藝制備的小水針型生物自組裝納米晶注射劑中鹽酸米托蒽醌的濃度為0.01％，測(cè)定ph值為6.83，滲透壓為196mmol/kg。皮下間質(zhì)給藥后僅轉(zhuǎn)移的一級(jí)淋巴結(jié)呈淡藍(lán)色且肉眼較難分辨。對(duì)各級(jí)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的重量和體積沒(méi)有顯著影響。

對(duì)比例2

小水針型生物自組裝納米晶注射劑的處方及1000支的用量如下：

稱取適量的原輔料，向濃配罐中加入處方量70％注射用水，加入處方量的輔料，攪拌約15分鐘使溶解，再加入鹽酸米托蒽醌，攪拌約20分鐘使溶解，投入活性炭，于40-60℃攪拌吸附20分鐘。濃配液經(jīng)3μm不銹鋼折疊濾芯過(guò)濾后轉(zhuǎn)至稀釋罐中，補(bǔ)加注射用水至配液總量，攪拌10分鐘。藥液經(jīng)兩支串聯(lián)的除菌過(guò)濾器(孔徑為0.22μm)過(guò)濾，無(wú)菌分裝封口。

由該處方工藝制備的小水針型生物自組裝納米晶注射劑中鹽酸米托蒽醌的濃度為10.34％，測(cè)定ph值為1.66，滲透壓為196mmol/kg。在間質(zhì)生物條件下自組裝納米晶的粒徑為120nm。皮下間質(zhì)給藥后，轉(zhuǎn)移的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)淋巴結(jié)呈肉眼可見的深藍(lán)色，各級(jí)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的重量和體積顯著減小或恢復(fù)至正常大小，但是對(duì)注射部位和淋巴細(xì)胞有顯著毒性。

對(duì)照例

1.對(duì)照溶液劑的制備

選擇異硫藍(lán)溶液劑(ib)作為對(duì)照溶液劑，處方和制備工藝如下：

處方：

制備工藝：

稱取處方量的磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和氯化鈉，加入處方量80％的注射用水，攪拌約15min使溶解，再加入處方量ib，攪拌約20min使溶解，投入藥用炭，于50℃攪拌吸附20min。濃配液經(jīng)3μm炭棒過(guò)濾后轉(zhuǎn)至稀配罐中，沖洗并合并沖洗液。補(bǔ)加注射用水至稀配罐內(nèi)藥液體積達(dá)到規(guī)定量后，攪拌約10min。取樣檢測(cè)性狀、ph和含量。中間體檢驗(yàn)合格的藥液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，取樣檢驗(yàn)可見異物。可見異物檢驗(yàn)合格的藥液充氮、灌封，每支5.1±0.1ml。121℃滅菌15min。檢漏，燈檢，貼標(biāo)，包裝，即得成品。

2.對(duì)照納米制劑的制備

選擇鹽酸米托蒽醌脂質(zhì)體(mih-lip)作為對(duì)照納米制劑，處方和制備工藝如下：

處方：

制備工藝：

采用薄膜法制備mih-lip：分別城區(qū)大豆卵磷脂、膽固醇，溶解于5ml無(wú)水乙醚中，抽真空旋轉(zhuǎn)至無(wú)水乙醚全部去盡，加入適量磷酸鹽緩沖液，水化，得到均勻淡黃色乳液，轉(zhuǎn)入聚丙烯離心管，離心管放置在冰浴探頭超聲，3min(工作50s，間歇10s)。將此淡黃色半透明液體倒入裝有已稱重的鹽酸米托蒽醌原底燒瓶中，37℃旋轉(zhuǎn)至生成均勻的藍(lán)黑色膠體溶液。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.粒徑測(cè)定

使用生理鹽水模擬體內(nèi)生理環(huán)境，將鹽酸米托蒽醌生物自組裝注射劑(mih-injection)置于生理環(huán)境中，以粒徑為考察指標(biāo)，檢測(cè)其生物條件下自組裝情況。由于鹽酸米托蒽醌(mih)比較特殊，傳統(tǒng)的粒徑檢測(cè)手段如馬爾文粒度儀等不能準(zhǔn)確檢測(cè)出其粒徑范圍，而透射電鏡等檢測(cè)方法需要干燥的樣品來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，均不能完整的模擬在體環(huán)境的真實(shí)自組裝形態(tài)，故而我們選擇原子力顯微鏡，對(duì)其生理?xiàng)l件下自組裝納米粒的形態(tài)進(jìn)行表征，結(jié)果表明，mih在生理?xiàng)l件下可自組裝成粒徑在60nm左右的納米粒子，形態(tài)圓整，分散均勻，粒度一致。而在酸性條件下，粒徑約為10nm。

4.ib粒徑的測(cè)定

按照上述方法，將同等濃度的ib溶液置于生理?xiàng)l件下，原子力顯微鏡對(duì)其粒徑及形貌進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果顯示，ib在生理?xiàng)l件下，單個(gè)粒子的粒徑為10nm到20nm，粒度均勻，形貌圓整。

5.mih-lip粒徑的測(cè)定

使用馬爾文粒度測(cè)定儀，對(duì)對(duì)照制劑mih-lip的粒徑進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果顯示，mih-lip的粒徑為140nm左右。

6.ph值考察

6.1.ph值對(duì)藥物穩(wěn)定性的影響

以鹽酸米托蒽醌作為模型藥物，分別調(diào)節(jié)的注射液的ph值為1.5，2.0，2.5，3.5，4.5，5.5，6.0，6.5，7.0，在調(diào)節(jié)ph值1小時(shí)后利用0.22μm的濾膜過(guò)濾后測(cè)定藥物的含量，當(dāng)ph值在1.5和6.0之間時(shí)，藥物含量在98.45±0.61％～101.72±0.20％，當(dāng)ph值為6.5和7.0使，藥物含量出現(xiàn)了一個(gè)明顯的下降，分別為83.76±0.53％和75.38±0.22％，說(shuō)明注射液的ph值大于6.0時(shí)，注射液中藥物出現(xiàn)了不穩(wěn)定析出的現(xiàn)象。

6.2.ph值對(duì)藥物靶向能力的影響

以鹽酸米托蒽醌作為模型藥物，分別調(diào)節(jié)的注射液的ph值為1.5，2.0，2.5，3.5，4.5，5.5，6.0，選擇間質(zhì)注射的給藥方式，于昆明種小鼠腳掌皮下注射，在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)，將小鼠脫頸椎致死，摘取小鼠一、二、三級(jí)淋巴結(jié)，觀察其染色情況。當(dāng)ph值小于2.0時(shí)，僅有一級(jí)淋巴結(jié)能夠染色。當(dāng)ph值在2.0～6.0之間時(shí)，三級(jí)淋巴結(jié)能染色，但是ph值為2.0，2.5和6.0時(shí)，第三級(jí)淋巴結(jié)藍(lán)色較淺，在ph值3.5～5.5之間時(shí)，三級(jí)淋巴結(jié)均能染色，且為深藍(lán)色。

7.滲透壓考察

7.1.滲透壓對(duì)注射部位刺激性的影響

以鹽酸米托蒽醌作為模型藥物，分別調(diào)節(jié)的注射液的滲透壓值分別為112，196，285，307，1503，2317，3011mmol/kg，選擇間質(zhì)注射的給藥方式，于昆明種小鼠腳掌皮下注射，在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)，將小鼠脫頸椎致死，摘取小鼠給藥部位進(jìn)行h&e染色，評(píng)價(jià)局部刺激性，當(dāng)注射液的滲透壓是3011mmol/kg，出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象，h&e染色結(jié)果顯示具有局部的刺激性，其他滲透壓值沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的局部刺激性。

7.2.滲透壓對(duì)藥物靶向能力的影響

以鹽酸米托蒽醌作為模型藥物，分別調(diào)節(jié)的注射液的滲透壓值分別為112，196，285，307，1503，2317，3011mmol/kg，選擇間質(zhì)注射的給藥方式，于昆明種小鼠腳掌皮下注射，在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)，將小鼠脫頸椎致死，摘取一、二、三級(jí)淋巴結(jié)，觀察其染色情況。當(dāng)滲透壓值小于285mmol/kg時(shí)，僅有一級(jí)淋巴結(jié)能夠染色。當(dāng)滲透壓值在,285～2317mmol/kg之間時(shí)，三級(jí)淋巴結(jié)都能夠染色，但是滲透壓值為285和2317mmol/kg時(shí)，第三級(jí)淋巴結(jié)藍(lán)色較淺，在ph值307～1503mmol/kg之間時(shí)，三級(jí)淋巴結(jié)均能染色，且為深藍(lán)色。

8.間質(zhì)給藥后的淋巴靶向能力的考察

對(duì)這一新型生物體內(nèi)自組裝納米藥物遞送體系的淋巴靶向能力進(jìn)行考察，選擇間質(zhì)注射的給藥方式，于昆明種小鼠腳掌皮下注射鹽酸米托蒽醌生物自組裝注射液(mih-injection)20μl。在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)，將小鼠脫頸椎致死，摘取小鼠一、二、三級(jí)淋巴結(jié)，觀察其染色情況，并用hplc對(duì)淋巴結(jié)中mih的含量進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，mih-injection經(jīng)間質(zhì)給藥后，由藥時(shí)曲線下面積(auc)和最大峰濃度(cmax)可知，對(duì)一級(jí)淋巴結(jié)(plns)、二級(jí)淋巴結(jié)(ilns)和三級(jí)淋巴結(jié)(rlns)靶向效果良好，以血液中藥物含量做參考(血液中未檢測(cè)到藥物存在)，靶向效率可達(dá)到100％，即通過(guò)間質(zhì)給藥自組裝后的粒徑能滿足全部進(jìn)入淋巴系統(tǒng)而不進(jìn)入血液循環(huán)。

表1.mih-injection皮下注射后在淋巴結(jié)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

注釋：plns：popliteallymphnodes腘淋巴結(jié)

ilns：iliaclymphnodes髂淋巴結(jié)

rlns：renallymphnodes腎淋巴結(jié)

auc(藥時(shí)曲線下面積)

cmax(最大峰濃度)

同時(shí)，分別以ib和mih-lip作為對(duì)照制劑，探索了不同粒徑因素對(duì)給藥系統(tǒng)淋巴靶向能力的影響。選擇間質(zhì)注射ib(20nm)、mih-injection(60nm)和mih-lip(130nm)，注射兩個(gè)小時(shí)后，試驗(yàn)結(jié)果如下表2。說(shuō)明鹽酸米托蒽醌生物自組裝納米晶賦予了鹽酸米托蒽醌藥物分子一定的粒徑，使其具備了優(yōu)于脂質(zhì)體的淋巴靶向能力，而由于普通注射液的淋巴靶向能力。

表2.具有不同粒徑的制劑的淋巴靶向能力

注釋：plns：popliteallymphnodes腘淋巴結(jié)

ilns：iliaclymphnodes髂淋巴結(jié)

rlns：renallymphnodes腎淋巴結(jié)

9.淋巴靶向速度考察

昆明種小鼠9只，隨機(jī)分成三組：mih-injection組、mih-lip組、ib組。每組3只，分別于小鼠腳掌皮下給藥。給藥后10min將小鼠脫頸椎致死，解剖取出一、二、三級(jí)淋巴結(jié)，觀察染色效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，mih-injection的三級(jí)淋巴結(jié)染色程度均深于ib組和mih-lip組，效果均良好，淋巴結(jié)示蹤效果良好，mih-injection與mih-lip比較更具有淋巴結(jié)示蹤優(yōu)勢(shì)，探討其原因可能是溶液的流動(dòng)性優(yōu)于脂質(zhì)體的流動(dòng)性導(dǎo)致。

10.轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)治療效果的考察

10.1.局部間質(zhì)給藥對(duì)對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移瘤的抑制效果考察

對(duì)局部給藥方案下，不同療程一、二級(jí)淋巴結(jié)大小進(jìn)行比較，分別考察淋巴結(jié)的質(zhì)量和體積兩個(gè)指標(biāo)。結(jié)果見表3，分析該組數(shù)據(jù)可得出結(jié)論，mih-injection對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移癌的抑制效果明顯，各級(jí)淋巴轉(zhuǎn)移瘤體積和重量出現(xiàn)明顯的縮小，并且其療效與化療周期有關(guān)。mih-injection局部給藥對(duì)轉(zhuǎn)移的二級(jí)淋巴瘤的抑制作用與對(duì)轉(zhuǎn)移的一級(jí)淋巴瘤的抑制作用差異不顯著(p>0.05)。

表.3局部注射組不同療程淋巴結(jié)大小的比較

注：

phaseⅰ：化療第一周期

phaseⅱ：化療第二周期

phaseⅲ：化療第三周期

phaseⅳ：化療第四周期

mplns：mestastaticpopliteallymphnodes腘淋巴結(jié)

milns：mestastaticiliaclymphnodes髂淋巴結(jié)

v：體積

m：質(zhì)量

10.2.局部給藥方案與靜脈給藥方案對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移瘤的抑制效果的比較

設(shè)計(jì)不同的給藥方案，通過(guò)比較局部注射與靜脈注射mih-injection在不同的給藥周期對(duì)淋巴瘤的治療效果。以下為局部給藥組和靜脈給藥組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)列表，由結(jié)果可知局部給藥的治療方式比較全身靜注而言，對(duì)淋巴瘤的抑制作用程度大，起效快。

表4.局部注射與靜注組不同療程淋巴結(jié)大小的比較

注：

phaseⅰ：化療第一周期

phaseⅱ：化療第二周期

phaseⅲ：化療第三周期

phaseⅳ：化療第四周期

mplns：mestastaticpopliteallymphnodes腘淋巴結(jié)

milns：mestastaticiliaclymphnodes髂淋巴結(jié)

v：體積

m：質(zhì)量

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。