本發明屬于醫學生物技術領域，具體地說是涉及一種il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠模型在篩選治療自身免疫性骨髓纖維化的藥物中的應用。

背景技術：

骨髓纖維化(myelofibrosis)是一種造血系統疾病，多發于老年人，主要特征為骨髓中網狀纖維組織增生，通常表現為造血干細胞異常增多、髓系細胞增生、貧血、脾臟腫大、脾臟與肝臟的髓外造血、生存率下降等。絕大多數情況下，骨髓纖維化患者伴有jak2、calr、mpl等基因突變，出現髓系細胞腫瘤。骨髓纖維化的發病機制被認為主要是基因突變所導致的造血干細胞分化功能紊亂、巨核細胞異?；罨人l的成纖維細胞活化并產生大量膠原。

但少數骨髓纖維化患者伴隨有自身免疫病，如系統性紅斑狼瘡、干燥綜合癥、類風濕性關節炎、原發性膽汁性膽管炎等。這種自身免疫性骨髓纖維化往往不具有jak2、calr、mpl等基因突變，會出現淋巴細胞在骨髓中的浸潤，可以被免疫抑制劑皮質類固醇所治療。但是目前對于自身免疫性骨髓纖維化的研究還很少，尚不清楚自身免疫性骨髓纖維化的具體發病機制。因此需要合適的動物模型來進行藥物研發，但是目前缺乏自發自身免疫性骨髓纖維化的動物模型。

il-2rα(-/-)小鼠由于缺乏il-2rα分子，調節性t細胞的發育與功能受到了影響，因此il-2rα(-/-)小鼠有著嚴重的全身性自身免疫病，表現為脾臟和淋巴結變大、t細胞尤其是cd8⁺t細胞增多、血清中抗體含量上升、自發結腸炎等[willerford,d.m.,etal.(1995).immunity3(4):521-530]。之前的工作發現il-2rα(-/-)小鼠具有門脈炎癥與膽管破壞，并且血清中可以檢出抗線粒體抗體(ama)，血清中多種炎性細胞因子的含量升高，表明il-2rα(-/-)小鼠具有這些類似于人類原發性膽汁性膽管炎的癥狀，因此可以作為原發性膽汁性膽管炎的動物模型[wakabayashi,k.,etal.(2006).hepatology44(5):1240-1249]。il-2rα(-/-)小鼠的結腸炎主要由cd4⁺t細胞引起，而自身免疫性膽管炎主要由cd8⁺t細胞引起[hsu,w.,etal.(2009).hepatology49(1):133-140]。但是il-2rα(-/-)小鼠的自身免疫性膽管炎并不是很嚴重，門脈炎癥與膽管破壞的水平較低，也沒有發展到肝纖維化的程度。而且il-2rα(-/-)小鼠同時存在著結腸炎，而結腸炎通常不存在于人類原發性膽汁性膽管炎患者中。因此我們雜交得到了il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠，該小鼠與il-2rα(-/-)小鼠相比，結腸炎的程度較低，門脈炎癥與膽管破壞的水平的程度更高，出現了肝纖維化，表明il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠具有更嚴重的自身免疫性膽管炎[yao,y.,etal.,(2014).jautoimmun51:99-108]。

之前的骨髓纖維化動物模型如jak2^v617f小鼠[marty,c.,etal.,(2010).blood116(5):783-7]、gata1^low小鼠[vannucchi,a.m.,etal.,(2002).blood100(4):1123-32]、myb^boo小鼠[papathanasiou,p.,etal.,(2010).blood116(26):5849-58]等，可以模擬人類骨髓纖維化的多種癥狀。但是尚缺乏自身免疫性骨髓纖維化的動物模型。

技術實現要素：

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠模型在篩選治療自身免疫性骨髓纖維化的藥物中的應用。

il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)模型小鼠具有多種類似人類自身免疫性骨髓纖維化的特征。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

本發明提供一種il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠模型在篩選治療自身免疫性骨髓纖維化的藥物中的應用。

本發明提供一種培育作為自身免疫性骨髓纖維化動物模型的il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的方法，包括下述步驟：

(1)將il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)小鼠進行雜交，培育得到il-12p40(+/-)il-2rα(+/-)小鼠；

(2)將步驟(1)培育得到的il-12p40(+/-)il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)小鼠進行雜交，培育得到il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠；

(3)將步驟(2)培育得到的il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠進行自交培育，鑒定得到il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠。

其中步驟(1)所用的il-2rα(-/-)小鼠(b6.129s4-il2ratm1dw)與il-12p40(-/-)小鼠(b6.129s1-il12btm1jm)購自美國jackson實驗室。

其中鑒定小鼠il-12p40基因的方法是用基因分型方法鑒定小鼠后代中是否存在il-12p40的野生型基因；鑒定小鼠il-2rα基因的方法是用流式細胞術檢測外周血中cd4陽性細胞的cd25的平均熒光強度。il-2rα(-/-)小鼠的cd4陽性細胞不包括cd25陽性的細胞；而il-2rα(+/-)小鼠cd4陽性細胞的cd25的平均熒光強度為il-2rα(+/-)小鼠的一半，據此可以鑒定小鼠的il-2rα基因。

本發明還涉及通過本發明的培育方法獲得的il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠，進一步的實驗證明該小鼠可以用作自身免疫性骨髓纖維化模型來篩選治療自身免疫性骨髓纖維化的藥物。

本發明中我們觀察到與對照小鼠il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠相比，il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的外周血中紅細胞和白細胞的數目顯著減少，血紅蛋白的含量和紅細胞壓積顯著下降。部分il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的脾臟出現造血集落，he染色顯示出脾臟結構發生改變并且出現大量的巨核細胞，il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的脾臟中出現大量的lsk(lin^-c-kit⁺sca-1⁺)細胞，這些結果均表明il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的脾臟出現了髓外造血。同時il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的肝臟中出現了造血島，肝臟中出現大量的lsk細胞，證明肝臟同樣出現了髓外造血。

本發明中我們發現il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的股骨和脛骨顏色偏白，he染色和網狀纖維銀染的結果表明il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓出現了纖維化。同時il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓中b細胞、紅細胞數目下降，表明產生b細胞、紅細胞的造血功能下降。il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓中lsk細胞的比例和數目顯著上升，但是骨髓嵌合實驗證明il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓造血能力較弱。

本發明中我們發現與對照小鼠相比，il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓中cd4⁺t細胞和cd8⁺t細胞的數目顯著增高，并且更傾向于effectormemory表型，能表達更高水平的ifn-γ。并且il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓中cd4⁺t細胞和cd8⁺t細胞的比例與骨髓中lsk細胞的比例呈正相關。這些結果提示了活化的t細胞導致了il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的造血功能異常。

本發明發現il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的造血系統異常。經過檢測，我們發現il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠能較好的模擬人類自身免疫性骨髓纖維化的癥狀。

本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果：

(1)目前骨髓纖維化的動物模型無法自發自身免疫病，難以模擬人類的自身免疫性骨髓纖維化。il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠具有自發產生貧血、骨髓纖維化、骨髓t細胞浸潤、髓外造血等特征。因此，il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠可以作為一個合適的自身免疫性骨髓纖維化的動物模型。

(2)il-12p40在免疫系統中是一種很重要的細胞因子，能夠影響cd4⁺t與cd8⁺t細胞的功能與分化；il-2rα是il-2受體的α鏈，對于維持免疫系統的平衡起著關鍵作用。我們雜交得到il-12p40與il-2rα雙缺陷的小鼠，即il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠。我們發現與對照小鼠il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠相比，il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠出現了造血系統的異常，包括外周血中紅細胞和白細胞數目減少；骨髓中cd4⁺t細胞和cd8⁺t細胞大量浸潤，lsk細胞(lin^-c-kit⁺sca-1⁺細胞)的比例和數目上升，骨髓造血能力下降，骨髓出現大量網狀纖維；脾腫大，脾臟和肝臟出現髓外造血。因此，該小鼠可以作為一種動物模型用于篩選治療自身免疫性骨髓纖維化藥物。

附圖說明

圖1是il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的血常規數據，包括外周血紅細胞數(rbc)、血紅蛋白含量(hgb)、紅細胞壓積(hct)、白細胞數(wbc)和血小板數(plt)。

圖2是il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的脾臟與肝臟的髓外造血情況；其中，a是部分il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的脾臟照片，顯示出造血集落；b是il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的脾臟he染色，il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的脾臟結構發生改變，箭頭指向巨核細胞；c是il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的肝臟he染色，箭頭指向造血島(hematopoieticislands)。

圖3是il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的脾臟與肝臟的lsk細胞數目。

圖4是il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓纖維化；其中，a是il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的股骨和脛骨的外觀對比；b是il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓he染色，可以看出il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓中存在著成纖維細胞，而il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠的骨髓則沒有這一現象；c是il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓網狀纖維銀染，可以看出il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓中存在著黑色的網狀纖維，而il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠的骨髓則沒有這一現象。

圖5是il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓造血功能異常；其中，a是il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓中各種細胞亞群的數目，il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓中紅細胞、b細胞的數目減少；b是il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓中lsk細胞的比例和數目，結果證明il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓中lsk細胞的比例和數目均顯著上升；c是骨髓嵌合實驗以驗證il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓造血能力，結果證明il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓造血能力顯著下降。

圖6是il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓t細胞浸潤；其中，a是il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓中t細胞數目，結果表明il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓cd4⁺t細胞和cd8⁺t細胞的數目均顯著上升；b是il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓中t細胞表型，結果表明il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓cd4⁺t細胞和cd8⁺t細胞中effectormemory的比例更高，能產生更高水平的ifn-γ；c是il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓lsk細胞比例與骨髓cd4⁺t細胞和cd8⁺t細胞比例的相關性分析，結果證明成正相關。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。

本領域技術人員應該理解，如果沒有特別說明，下述實施例中所用的化學試劑均為市售分析純級別的試劑。下述動物實驗遵照實驗動物倫理進行。

il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠模型在專利“201410020633.9、培育作為肝纖維化與原發性膽汁性肝硬化動物模型的il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的方法”中公開。

實施例1.il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的建立

c57bl/6j背景的il-2rα(-/-)小鼠(b6.129s4-il2ratm1dw)[willerford,d.m.,etal.(1995).immunity3(4):521-530]與il-12p40(-/-)小鼠(b6.129s1-il12btm1jm)[magram,j.,etal.(1996).immunity4(5):471-481]購自美國jackson實驗室(thejacksonlaboratory，美國緬因州，http://www.jax.org/)，飼養于無特殊病原菌(spf)環境中。

我們將il-2rα(+/-)小鼠與il-12p40(-/-)小鼠進行雜交，得到il-12p40(+/-)il-2rα(+/-)小鼠；再與il-12p40(-/-)小鼠進行雜交，得到il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠。實驗中用到的il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠和il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠均由il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠進行繁殖。由于il-12p40與il-2rα的突變基因都包含一個neo基因，所以鑒定小鼠il-12p40基因的方法是用基因分型(genotyping)的方法鑒定il-12p40的野生型基因，鑒定小鼠il-2rα基因的方法是用流式細胞術檢測外周血中cd4陽性細胞的cd25的平均熒光強度。其中il-2rα(-/-)小鼠的cd4陽性細胞不包括cd25陽性的細胞；而il-2rα(+/-)小鼠cd4陽性細胞的cd25的平均熒光強度為il-2rα(+/-)小鼠的一半，由此可以鑒定小鼠il-2rα基因。所有的小鼠都在11到13周齡用于實驗，實驗符合動物倫理要求。

實施例2.血常規檢測

收集小鼠的外周血到抗凝管中，吸取150μl血液，通過全自動血細胞分析儀收集血常規數據。

結果見圖1，與il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠相比，il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的外周血紅細胞數(rbc)、血紅蛋白含量(hgb)、紅細胞壓積(hct)和白細胞數(wbc)均顯著下降，但血小板數(plt)未有顯著變化。

實施例3.組織病理學檢驗

將小鼠的肝臟、脾臟與骨髓組織固定于4％的中性甲醛中1～2天。骨髓組織再放入脫鈣液(5％鹽酸+5％醋酸)中24小時。組織經脫水并包埋于石蠟當中，切成4μm的薄片。薄片脫蠟后進行h&e染色。骨髓組織通過網狀纖維銀染來顯示纖維化。

結果見圖2、圖3，從圖2的he染色圖中可以看到與il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠相比，il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的脾臟結構發生改變、紅髓、白髓的區分不夠明顯，并且出現了大量的巨核細胞。il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的肝臟存在著造血島。這些結果證明了il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的脾臟和肝臟中的髓外造血現象。圖3的he染色圖中顯示出il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓出現成纖維細胞，網狀纖維銀染顯示出il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓可以出現明顯的網狀纖維。

實施例4.各臟器細胞的分離與流式細胞術

取出肝臟，用含0.2％bsa的pbs進行研磨，經鋼絲網過濾后1500rpm離心5min，取沉淀。用40％percoll(gehealthcare公司)重懸沉淀，2000rpm離心20min，取沉淀。脾臟用兩塊玻片與pbs/0.2％bsa進行研磨，經尼龍網過濾。取股骨和脛骨，用注射器吸取pbs后吹打骨髓，經尼龍網過濾。所收集的細胞經紅細胞裂解液處理后通過血細胞計數器在顯微鏡下進行細胞計數。取1×10⁶細胞，用純化cd16/32抗體(biolegend公司)進行封閉，然后標記抗cd3、b220、ter119、gr-1、nk1.1、cd11c、cd11b(lineagemarkers)、c-kit、sca-1、cd4、cd8β、cd62l、cd44(biolegend公司)、cd8α(bd公司)的熒光抗體。對于細胞因子胞內染色，細胞由含有10％胎牛血清的rpmi-1640培養基重懸，用含有蛋白轉運抑制劑的細胞刺激cocktail(購自ebioscience公司)進行刺激，37℃培養4小時。細胞用純化cd16/32抗體進行封閉，再用抗cd3、cd4、cd8β、nk1.1的熒光抗體(biolegend公司)進行標記，然后用固定液(biolegend公司)進行固定。固定后的細胞用穿膜液(biolegend公司)進行穿膜，再用抗ifn-γ的熒光抗體(biolegend公司)進行標記。

結果見圖3、圖5、圖6。圖3顯示il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的脾臟和肝臟中lsk細胞增多。圖5顯示il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓各亞群細胞中未成熟紅細胞、成熟紅細胞和b細胞的數目下降，但單核細胞和中性粒細胞的數目沒有顯著改變，表明紅細胞、b細胞的生成被削弱。圖6顯示il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠骨髓中cd4⁺t細胞和cd8⁺t細胞的數目增多，且cd4⁺t細胞和cd8⁺t細胞中效應性記憶t細胞的比例上升，產生ifn-γ的能力增強；并且il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠骨髓中cd4⁺t細胞和cd8⁺t細胞的比例與骨髓lsk細胞的比例成正相關，提示著骨髓中t細胞浸潤導致了骨髓異常。

實施例6.骨髓嵌合實驗

用10gy輻照ly5.1/ly5.2小鼠，24h后無菌分離ly5.2il-12p40(-/-)il-2rα(+/-)小鼠和ly5.1il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的全骨髓細胞，分別取5×10⁵細胞混合轉輸給ly5.1/ly5.2小鼠。8周后檢測受體小鼠。

結果見圖5。圖5顯示骨髓嵌合實驗證明il-12p40(-/-)il-2rα(-/-)小鼠的骨髓造血能力顯著下降。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。