背景技術：

技術實現思路

1、本發明涉及一種包含核酸構建體的人類t細胞或nk細胞，該核酸構建體包含：

2、i)包含最小啟動子和至少一個aare(氨基酸應答元件)核酸序列的調節性多核苷酸，當所述t細胞或nk細胞被激活并且在食用缺乏至少一種必需氨基酸的飲食時，所述調節性多核苷酸在所述t細胞或nk細胞中被激活；以及

3、ii)置于所述調節性多核苷酸控制下的轉基因。

4、本發明還涉及所述人類t細胞或nk細胞，其用于細胞免疫療法。

5、還提供了一種制備本發明的人類t細胞或nk細胞的方法，其中用包含核酸構建體的載體轉染或轉導人類t細胞或nk細胞，所述核酸構建體包含：

6、i)包含最小啟動子和至少一個aare(氨基酸應答元件)核酸序列的調節性多核苷酸，當所述t細胞或nk細胞被激活并且在暴露于至少一種必需氨基酸的缺乏時，所述調節性多核苷酸在所述t細胞或nk細胞中被激活；以及

7、ii)置于所述調節性多核苷酸控制下的轉基因。

8、發明詳述

9、gcn2-atf4信號傳遞通路在細胞中普遍存在，但根據組織或器官的不同，該通路可能不會被營養調節系統激活。例如，eaa缺乏不能誘導小鼠肌肉中gcn2-atf4通路的激活。本技術發明人證明，gcn2-atf4通路可被人類t細胞中的eaa饑餓誘導，但最初的體外實驗失敗了，因為本技術發明人還發現人類t淋巴細胞的激活對于gcn2激酶的激活至關重要。因此，只有當t細胞被激活并且eaa剝奪誘導gcn2-atf4通路激活時，該轉基因的表達才是可能的。這些結果有望應用于人類nk細胞，因為nk細胞基本上是沒有tcr的細胞毒性t細胞。

10、nutrireg?t細胞或nk細胞

11、本發明涉及包含核酸構建體的人類t細胞或nk細胞，所述核酸構建體包含：

12、i)包含最小啟動子和至少一個aare(氨基酸應答元件)核酸序列的調節性多核苷酸，所述調節性多核苷酸在受試者食用缺乏至少一種必需氨基酸的飲食時被激活；和

13、ii)置于所述調節性多核苷酸控制下的轉基因。

14、本發明還涉及包含核酸構建體的人類t細胞或nk細胞，所述核酸構建體包含：

15、i)包含最小啟動子和至少一個aare(氨基酸應答元件)核酸序列的調節性多核苷酸，當所述t細胞或nk細胞被激活并且暴露于至少一種必需氨基酸的缺乏時，所述調節性多核苷酸在所述t細胞或nk細胞中被激活；和

16、ii)置于所述調節性多核苷酸控制下的轉基因。

17、人類t細胞或nk細胞以及轉基因

18、根據一些實施方案，本發明的人類t細胞是嵌合抗原受體t(car-t)細胞(其包括car-treg)，或t細胞受體(tcr)轉基因t細胞。

19、在這些實施方案中，選擇轉基因以刺激用所述car-t細胞或轉基因tcr?t細胞進行的細胞免疫療法的功效，或抑制所述car-t細胞或轉基因tcr?t細胞誘導的毒性。具體來說，該轉基因是一種防止car-t細胞耗竭的轉基因。

20、根據近期有希望的研究，適合刺激用car-t細胞或轉基因tcr?t細胞進行的細胞免疫療法的功效的轉基因包括c-jun、t-bet、il-7、il-12、il-15、il-18、il-21、il-23(以逆轉或延緩t細胞耗竭或刺激那些改造的t細胞)(poorebrahim等人,oncogene?40.2(2021):421-435；pietrobon等人,international?journal?of?molecular?sciences?22.19(2021):10828)。

21、適合抑制car-t細胞或轉基因tcr?t細胞誘導的毒性的轉基因包括抑制性受體(例如pd-1、ctla-4、tim-3、lag-3)，或免疫抑制因子(例如il-35、il-10、tgf-β、foxp3、ido、tox、eomes)(poorebrahim等人,oncogene?40.2(2021):421-435；pietrobon等人,international?journal?of?molecular?sciences?22.19(2021):10828)。

22、根據本發明的這些人類t細胞特別預期用于治療癌癥，例如血液系統惡性腫瘤或實體癌。

23、根據一些實施方案，本發明的人類t細胞預期用于同種異體移植，或用于治療血液系統癌癥。

24、在這些實施方案的第一方面，選擇轉基因以促進人類t細胞分化為調節性t細胞(treg)或1型調節性t細胞(tr1)。

25、適合促進人類t細胞分化為(i)tr1的轉基因包括編碼細胞因子例如il-10、tgf-β、ifn-α或il-6的轉基因(roncarolo等人,immune-mediated?diseases,immunity,volume49,issue?6,2018)，或(ii)treg的轉基因主要包括foxp3。優選地，促進人類t細胞分化為tr1的轉基因是編碼il-10的轉基因。

26、根據該方面，當檢測到gvhd的跡象時，將誘導轉基因表達，以抑制或控制gvhd。

27、根據這些實施方案的第二個方面，預期通過同種異體移植用于治療血液系統癌癥的人類t細胞包含刺激個體(即人類或非人類哺乳動物)的細胞免疫療法的功效的轉基因。例如，轉基因編碼刺激性細胞因子，例如il-2、ifn-γ、tnf-α、il-7、il-15(ringdén等人,british?journal?of?haematology?147.5(2009):614-633)。

28、根據一些實施方案，本發明的人類t細胞預期用于控制實體器官移植的同種異體排斥，或用于治療自身免疫性疾病。在這些實施方案中，人類t細胞是人類car-treg，更具體地說是抗原特異性car-treg，其中抗原是移植物特異性同種抗原，或與自身免疫性疾病相關的自身抗原。

29、可以通過分離多克隆treg(來自個體的外周血)并用抗原特異性car構建體轉導它們，或者用抗原特異性car構建體和foxp3?cdna共轉導cd4+或cd3+t細胞，產生抗原特異性人類car-treg(arjomandnejad等人，biomedicines?2022,10(2),287)。

30、在這些實施方案中，選擇轉基因以刺激car-treg功效和/或防止car-treg耗竭，并且包括c-jun、t-bet、il-7、il-12、il-15、il-18、il-21、il-23，如上文已提及的。

31、根據一些實施方案，包含核酸構建體(包括調節性多核苷酸和轉基因)的人類細胞是人類nk細胞。本文使用的術語nk細胞包括nk細胞和改造的nk細胞，例如car-nk細胞。

32、在這些實施方案中，選擇轉基因以利用本發明的所述人類nk細胞或car-nk細胞刺激細胞免疫療法的功效。具體來說，該轉基因是增強nk細胞或car-nk細胞的激活或增殖的轉基因。

33、合適的轉基因包括nkg2d、il-12、il-15或il-18(shimasaki?n等人,nat?rev?drugdiscov.2020mar；19(3):200-218；daher?m.等人,blood.2021年2月4日；137(5):624-636；wang?x.等人,blood?adv.2020年5月12日；4(9):1950-1964)。

34、根據本發明的這些人類nk細胞或car-nk細胞預期特別用于治療血液系統惡性腫瘤或實體腫瘤。

35、核酸構建體和調節性多核苷酸

36、核酸構建體包含：

37、i)包含最小啟動子和至少一個aare(氨基酸應答元件)核酸序列的調節性多核苷酸，所述調節性多核苷酸在受試者食用缺乏至少一種必需氨基酸的飲食后是可激活的或被激活；和

38、ii)置于所述調節性多核苷酸控制下的轉基因。

39、或者，核酸構建體包含：

40、i)包含最小啟動子和至少一個aare(氨基酸應答元件)核酸序列的調節性多核苷酸，當所述t細胞或nk細胞被激活并且暴露于至少一種必需氨基酸的缺乏時，所述調節性多核苷酸在所述t細胞或nk細胞中被激活；和

41、ii)置于所述調節性多核苷酸控制下的轉基因。

42、這種核酸構建體已在國際專利申請公布文本wo2013/068096a1和wo2017/207744a1中進行了描述，這些專利申請以其全文并入本文中。

43、調節性多核苷酸包含最小啟動子和至少一個aare(氨基酸應答元件)核酸序列。

44、如本文所用，“最小啟動子”意指包含正確啟動位于下游的目標基因轉錄所需的所有元件的啟動子。“最小啟動子”和“核心啟動子”這兩個表述被視為等效表述。本領域技術人員理解，“最小啟動子”包含至少轉錄起始位點、rna聚合酶結合位點和一般轉錄因子結合位點(tata盒)。

45、合適的最小啟動子是本領域技術人員已知的。

46、在一些實施方案中，最小啟動子選自胸苷激酶(tk)啟動子、β-珠蛋白啟動子、巨細胞病毒(cmv)啟動子、sv40啟動子等。

47、本文中使用的“aare”或“氨基酸應答元件”表示在因必需氨基酸(eaa)缺乏而激活gcn2-eif2α-atf4通路后，通過激活轉錄因子4(atf4)結合并借此誘導由aare驅動的靶基因表達的核酸序列。

48、在哺乳動物中，食用缺乏一種eaa的飲食后，限制性eaa的血液濃度迅速大幅下降，從而引發一種普遍存在的適應性過程，稱為氨基酸應答通路。該通路的初始步驟是無電荷的trna激活哺乳動物gcn2蛋白激酶。然后gcn2在絲氨酸51上磷酸化真核起始因子2(eif2α)的α亞基，導致atf4翻譯上調。一旦誘導，atf4就會通過與aare結合來激活特定靶基因的轉錄。gcn2-eif2α-atf4通路可以通過施用缺失的eaa被迅速關閉。

49、在細胞水平上也可以觀察到該通路。事實上，在暴露于至少一種eaa的缺乏的激活的t細胞或nk細胞中，氨基酸應答通路也會被觸發，例如當激活的t細胞或nk細胞在缺乏至少一種eaa的培養基中培養時。

50、根據一些實施方案，氨基酸應答元件(aare)核酸序列選自由核酸序列seq?id?no:1、seq?id?no:2、seq?id?no:3、seq?id?no:4和seq?id?no:5組成的組。

51、包含至少一個aare的調節性多核苷酸可以包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個aare核酸序列。因此，表述“至少一個aare核酸序列”包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個aare核酸序列。

52、在某些實施方案中，調節性多核苷酸包含至少兩個aare核酸序列。在一些其他實施方案中，調節性多核苷酸包含1至20個aare核酸序列，優選1至10個aare核酸序列。在某些實施方案中，調節性多核苷酸包含2至6個aare核酸序列。

53、在一些實施方案中，調節性多核苷酸包含選自由核酸序列seq?id?no:2和seq?idno:4組成的組的2個aare核酸序列。在一些實施方案中，調節性多核苷酸包含6個序列為seqid?no:1的aare核酸序列。

54、在某些實施方案中，至少兩個aare核酸序列可以相同或不同。

55、根據一個實施方案，所述調節性多肽包括胸苷激酶(tk)最小啟動子和來自trib3基因的六個拷貝的aare核酸序列，并且包含如seq?id?no:6所示的序列或由如seq?id?no:6所示的序列組成。

56、因此，調節性多核苷酸構建體包含至少一個aare核酸序列，該aare核酸序列位于最小啟動子的直接上游，該啟動子控制位于下游的轉基因的表達。

57、在食用缺乏至少一種必需氨基酸的飲食后，調節性多核苷酸在受試者的t細胞或nk細胞中被激活。

58、受試者是人類或非人類哺乳動物，優選為人類。在一些實施方案中，非人類哺乳動物選自由小鼠、大鼠等；靈長類動物例如黑猩猩、猴等組成的組。

59、在哺乳動物中，飲食中必須供應九種eaa，其中任何一種的缺乏都能誘導aare驅動的表達系統。

60、如本文所用，“必需氨基酸”包括組氨酸(his，h)、異亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、賴氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、蘇氨酸(thr，t)、色氨酸(trp，w)和纈氨酸(val，v)。

61、如本文所用，“缺乏至少一種必需氨基酸的飲食”意指缺乏1、2、3、4、5、6、7、8或9種必需氨基酸的飲食。根據一些實施方案，飲食缺乏亮氨酸。

62、當暴露于至少一種必需氨基酸的缺乏時，例如在缺乏至少一種必需氨基酸的培養基中培養時，調節性多核苷酸在激活的t細胞或nk細胞中被激活。

63、所述細胞是人類細胞或非人類哺乳動物細胞，優選為人類細胞。在一些實施方案中，非人類哺乳動物選自由小鼠、大鼠等；靈長類動物例如黑猩猩、猴等組成的組。

64、對于細胞來說，飲食中必須供應九種eaa，其中任何一種的缺乏都能誘導aare驅動的表達系統。

65、如本文所用，“缺乏至少一種必需氨基酸的培養基”意指缺乏1、2、3、4、5、6、7、8或9種必需氨基酸的飲食。根據一些實施方案，飲食缺乏亮氨酸。

66、調節性多核苷酸的激活

67、為了激活調節肽，向受試者(即如上定義的人類或非人類哺乳動物)施用缺乏至少一種必需氨基酸的飲食。

68、根據優選實施方案，在施用缺乏至少一種必需氨基酸的飲食之前，受試者已經置于饑餓狀態。

69、為了在體外激活細胞中的調節肽，將細胞培養在缺乏至少一種必需氨基酸的培養基中進行培養，優選培養至少2h，至少6h，至少10h，并優選至少16h。

70、利用nutrireg?t細胞或nk細胞的細胞免疫療法

71、根據本發明的人類t細胞或nk細胞用于細胞免疫療法。

72、本發明還提供了一種對有需要的受試者進行細胞免疫療法的方法，其包括向所述受試者施用根據本發明的t細胞或nk細胞。

73、細胞免疫療法預期針對的是人類或非人類哺乳動物，優選是人類。在一些實施方案中，非人類哺乳動物選自由小鼠、大鼠等；靈長類動物例如黑猩猩、猴等組成的組。

74、在一些實施方案中，t細胞或nk細胞對于人類受試者來說是自體的。在一些實施方案中，t細胞或nk細胞對于人類受試者來說是同種異體的。

75、細胞免疫療法包括但不限于治療癌癥、控制實體移植物的同種異體移植排斥、或治療自身免疫性疾病。

76、癌癥可能是實體癌或血液系統癌癥。

77、在某些時間點，被施用人類t細胞或nk細胞的受試者進一步接受缺乏至少一種必需氨基酸的飲食以誘導轉基因表達。

78、根據本發明的人類細胞、尤其是根據本發明的人類t細胞的一個優點是，僅在被激活的人類細胞、尤其是t細胞中通過eaa剝奪(或aare核酸的激活)誘導轉基因表達。

79、通過將本發明的人類t細胞或nk細胞暴露于eea缺乏，這使得轉基因僅在需要時表達。事實上，除了通過食物可誘導的內源性信號傳遞通路(gcn2-atf4)誘導之外，nutrireg-t細胞或nk細胞系統的主要優勢之一是對轉基因表達進行開/關調節并隨著時間的推移控制這種表達的可能性。

80、在本發明的一個實施方案中，施用的本發明的t細胞或nk細胞未被激活。僅當細胞在受試者體內被激活時，轉基因表達才會在細胞中誘導，特別是在炎癥的情況下，并且僅當該受試者接受缺乏至少一種必需氨基酸的飲食時。

81、本發明的人類t細胞的第一個應用是在同種異體干細胞移植(allo-sct)的情況下，這是許多血液系統惡性腫瘤的首選治療方法。同種異體供體t細胞識別次要組織相容性抗原(次要h抗原)，其導致白血病細胞的消除，這種現象稱為移植物抗白血病(gvl)效應。由于許多次要h抗原遍在表達，gvl效應常常伴有患者正常組織的破壞，即移植物抗宿主病(gvhd)，這是allo-sct的主要副作用。

82、可以使用本發明的人類t細胞實現對gvhd的預防性或治療性控制，所述人類t細胞包含促進具有抗炎特性的人類t淋巴細胞擴增的轉基因，以減緩導致gvhd的細胞毒性反應。在這方面，使用包括treg或tr1誘導性轉基因的nutrireg系統對供體t細胞(存在于將要移植到有需要的受試者體內的同種異體干細胞中，或以供體淋巴細胞注射的形式存在)進行離體基因修飾，然后重新注射到受試者體內。這樣，只需在幾個小時內食用缺乏eaa的飲食，即可(i)在激活的t細胞(其導致gvhd)中表達這種treg或tr1誘導性轉基因(通常是一種抗炎細胞因子)，以及(ii)促進t反應朝向t調節表型(treg或tr1)的極化。

83、相反，為了在受試者的血液系統疾病復發時重新獲得移植物抗白血病(gvl)效應，還可以考慮使用在eea剝奪依賴下瞬時表達的刺激性細胞因子來重新啟動供體t淋巴細胞。

84、因此，根據一些實施方案，人類nutrireg?t細胞用于通過同種異體移植治療癌癥，特別是血液系統癌癥。血液系統癌癥具體為白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。

85、根據一些實施方案，人類t細胞用于通過同種異體移植治療血液系統癌癥，其中：

86、-轉基因的表達促進人類t細胞分化為treg或tr1，并預防或治療移植物抗宿主病(gvhd)，或

87、-轉基因的表達通過所述人類t細胞誘導或刺激移植物抗白血病(gvl)效應來刺激細胞免疫療法的功效。

88、在一些方面，轉基因促進人類t細胞分化為調節性t細胞(treg或tr1)；例如轉基因編碼細胞因子如il-10、tgf-β、ifn-α和il-6或轉錄因子如foxp3。促進人類t細胞分化為treg或tr1的轉基因的表達預防或治療移植物抗宿主病(gvhd)。在這方面，預期通過間歇性食用缺乏一種eaa的飲食來重復誘導促進人類t細胞分化為treg或tr1的轉基因。

89、在控制gvhd的細胞毒性反應方面，nutrireg-t細胞系統能夠實現的開/關調節是一項關鍵有利條件，因為食用缺失的eaa將在適當的時候停止促進人類t細胞分化為treg或tr1(例如抗炎細胞因子)的轉基因的表達。因此，nutrireg系統具有很大的優勢，因為它允許轉基因的瞬時表達，從而保留移植物的抗腫瘤作用，而這是目前使用的免疫抑制藥物無法實現的。另一個優點是轉基因只會在激活的t細胞中表達，因為gcn2-atf4通路不能在靜止的t細胞中誘導，這代表了必要的安全性控制。

90、在其他方面，轉基因刺激用所述人類t細胞進行的細胞免疫療法的功效，以重新獲得gvl效應；例如轉基因編碼刺激性細胞因子，例如il-2、ifn-γ、tnf-α、il-7、il-15。刺激用所述人類t細胞進行的細胞免疫療法的功效的轉基因的表達誘導或刺激gvl效應。在這方面，當懷疑受試者的血液疾病復發時，預期通過間歇性食用缺乏一種eaa的飲食來重復誘導刺激用所述人類t細胞進行的細胞免疫療法的功效的轉基因。

91、第二個應用涉及本發明的人類car-t細胞或tcr轉基因t細胞的治療策略，目的是使用編碼抑制性受體(例如pd-1、ctla-4、tim-3、lag-3)或免疫抑制因子(例如il-35、il-10、tgf-β、foxp3、ido、tox、eomes)的轉基因來限制它們的毒性，或者相反地刺激它們的活性。根據本發明的人類car-t細胞或tcr轉基因t細胞可以允許目標基因的瞬時表達以防止t細胞耗竭。文獻中已經描述了有關c-jun的令人鼓舞的結果，當c-jun過度表達時，其將使car-t細胞能夠抵抗耗竭(lynn等人,nature?576,293–300(2019))。因此，在car-t細胞或tcr轉基因t細胞中，在nutrireg的依賴下瞬時重復表達c-jun可以使其抵抗耗竭并促進維持其隨時間的功效。使用t-bet、il-7、il-12、il-15、il-18、il-21、il-23逆轉或延遲t細胞耗竭或刺激修飾的t細胞也獲得了一些有前景的結果(poorebrahim等人,oncogene?40.2(2021):421-435；pietrobon等人,international?journal?of?molecular?sciences22.19(2021):10828)。

92、類似地，治療策略可以使用根據本發明的人類nk細胞或car-nk細胞，目的是通過利用轉基因(例如nkg2d、il-12、il-15或il-18)增強激活或增殖來刺激它們的活性。

93、在car-t細胞、tcr轉基因t細胞、nk細胞或car-nk細胞的情況下，nutrireg系統能夠實現的開/關調節也非常重要，因為它既可以允許(i)具有瞬時表達的基因的有益作用，又可以允許(ii)限制其表達時間過長可能產生的毒性作用(例如cjun，其可能具有致癌作用)。

94、因此，在一些實施方案中，利用本發明的人類car-t細胞或tcr轉基因t細胞、或人類nk細胞或car-nk細胞進行的細胞免疫療法用于治療癌癥，特別是實體癌。

95、對于癌癥療法，本領域技術人員將特別選擇針對患有癌癥的受試者的腫瘤抗原具有特異性的人類car-t細胞、tcr轉基因t細胞或car-nk細胞。

96、在這些方面，轉基因刺激利用所述人car-t細胞、轉基因tcr?t細胞、nk細胞或car-nk細胞進行的細胞免疫療法的功效，或抑制所述car-t細胞或轉基因tcr?t細胞誘導的毒性。具體來說，轉基因防止car-t細胞耗竭或轉基因tcr?t細胞耗竭。

97、在一些其他實施方案中，利用本發明的人car-t細胞或tcr轉基因t細胞進行的細胞免疫療法用于治療自身免疫性疾病。具體來說，對于由自身抗體產生導致的自身免疫性疾病，人類car-t細胞或tcr轉基因t細胞將靶向產生自身抗體的b細胞。對于由細胞毒性t細胞導致的自身免疫性疾病(例如結腸炎、多發性硬化癥或1型糖尿病)，本發明的人car-t細胞或tcr轉基因t細胞將靶向致病性自身免疫t細胞。

98、根據這些方面，人類t細胞是嵌合抗原受體t(car-t)細胞或t細胞受體(tcr)轉基因t細胞。取決于治療用途，car-t細胞或tcr轉基因t細胞針對自身抗體或致病性自身免疫t細胞具有特異性。在這些方面，轉基因刺激了用所述car-t細胞或轉基因tcr?t細胞進行的細胞免疫療法的功效，或抑制了所述car-t細胞或轉基因tcr?t細胞誘導的毒性。具體來說，轉基因防止car-t細胞耗竭或轉基因tcr?t細胞耗竭。

99、在一些實施方案中，細胞免疫療法用于控制實體移植的同種異體移植排斥。

100、此外，利用離體擴增的自體treg進行的細胞療法是調節同種免疫和減少免疫抑制的最有前景的方法之一。臨床前研究表明，通過使用對供體同種抗原具有特異性的treg(即供體特異性(ds)treg)可以顯著增強treg療法的效力。car-treg技術用于生成dscar-treg，發現這些細胞能夠抑制體液免疫，并延遲未致敏的免疫功能正常的接受者的同種異體移植排斥(sicard等人,am?j?transplant.2020；20:1562–1573)。因此，在一些實施方案中，細胞免疫療法用于使用根據本發明的對供體同種抗原具有特異性的人類car-t細胞或tcr轉基因t細胞來控制同種異體移植排斥。在一些方面，轉基因延長了所述供體特異性car-t細胞或供體特異性轉基因tcr?t細胞的壽命，特別是防止了dscar-t細胞耗竭或轉基因dstcr?t細胞耗竭，如上文已描述的。

101、制備nutrireg?t細胞或nk細胞的方法

102、提供了一種制備根據本發明的人類t細胞或nk細胞的方法，其中人類t細胞或nk細胞被包含核酸構建體的載體轉染或轉導，所述核酸構建體包含：

103、i)包含最小啟動子和至少一個aare(氨基酸應答元件)核酸序列的調節性多核苷酸，所述調節性多核苷酸在受試者食用缺乏至少一種必需氨基酸的飲食后被激活；和

104、ii)置于所述調節性多核苷酸控制下的轉基因。

105、還提供了一種制備根據本發明的人類t細胞或nk細胞的方法，其中人類t細胞或nk細胞被包含核酸構建體的載體轉染或轉導，所述核酸構建體包含：

106、i)包含最小啟動子和至少一個aare(氨基酸應答元件)核酸序列的調節性多核苷酸，當所述t細胞或nk細胞被激活時，以及當暴露于至少一種必需氨基酸的缺乏時，例如當在缺乏至少一種必需氨基酸的培養基中培養時，所述調節性多核苷酸在所述t細胞或nk細胞中被激活；和

107、ii)置于所述調節性多核苷酸控制下的轉基因。

108、載體可以是合成載體(陽離子脂質、聚合物脂質體等)、質粒或病毒載體。

109、如果需要，它可以與一種或多種改善載體的轉染效率和/或穩定性的物質組合。這些物質在本領域技術人員可獲得的文獻中被廣泛記載(例如參見felgner等人,1987,proc.west.pharmacol.soc.32,115-121；hodgson和solaiman,1996,naturebiotechnology?14,339-342；remy等人,1994,bioconjugate?chemistry?5,647-654)。通過非限制性舉例說明的方式，它們可以是聚合物、陽離子脂質、脂質體、核蛋白或中性脂質。這些物質可以單獨使用或者組合使用。一種可能的組合是與陽離子脂質(dogs、dc-chol、精胺-膽固醇、亞精胺-膽固醇等)和中性脂質(dope)組合的重組質粒載體。

110、在本發明的情況下可以使用廣泛選擇的質粒。它們可以是克隆和/或表達載體。一般而言，它們是本領域中已知的，并且其中許多是可商購的，但也可以使用基因操作技術來構建或修飾它們。舉例來說，我們可以提及源自pbr322(gibco?brl)、puc(gibco?brl)、pbluescript(stratagene)、prep4、pcep4(invitrogene)或ppoly(lathe等人,1987,gene57,193-201)的質粒。優選地，本發明所實施的質粒含有確保在生產細胞和/或宿主細胞中開始復制的復制起點(例如，如果要在大腸桿菌中生產質粒，將使用coiei起點，而如果要在哺乳動物宿主細胞中自我復制，將使用orip/ebnai系統，lupton和levine,1985,mol.cell.biol.5,2533-2542；yates等人,nature?313,812-815)。它還可以包括用于選擇或識別轉染細胞的選擇基因(營養缺陷型突變的補充、編碼抗生素抗性的基因等)。它還可以包括改善其在給定細胞中的維持和/或穩定性的額外元件。

111、當涉及病毒載體時，其可以是源自腺病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒相關病毒(aav)、皰疹病毒、甲病毒、細小病毒、痘病毒(雞痘、金絲雀痘、痘苗病毒，特別是mva(改良安卡拉病毒)或哥本哈根株等)或泡沫病毒的載體。優選地，使用非復制性且任選地非整合性載體。逆轉錄病毒具有感染并主要整合到分裂細胞的性質，因此特別適合用于抗癌療法應用。適用于實施本發明的逆轉錄病毒載體包含ltr(長末端重復)末端序列和衣殼化區域。其可源自任何來源(鼠科動物、靈長類動物、貓科動物、人類等)的逆轉錄病毒，并且特別地，可源自選自包括momulv(moloney鼠白血病病毒)、mvs(鼠肉瘤病毒)或friend鼠逆轉錄病毒(fb29)的組中的逆轉錄病毒。它在包殼線中繁殖，該包殼線能夠反式提供構成病毒顆粒所需的gag、pol和/或env病毒多肽。這些類型的線在文獻中有描述(pa317、psi?crip?gp+am-12等)。本發明的逆轉錄病毒載體可以包括修飾，特別是在ltr處(用真核生物啟動子替換啟動子區域)或在衣殼化區域處(用(例如vl30類型的)異源衣殼化區域替換)。

112、在本發明的優選實施方案中，所述載體為慢病毒載體、腺病毒載體、或源自腺病毒相關病毒(aav)的載體。

113、根據有利的實施方案，根據本發明使用的病毒載體可以是dna載體或感染性病毒顆粒的形式。

114、本發明將通過下面的附圖和實施例進一步說明。

115、附圖簡要說明

116、圖1：nutrireg的一般原理。

117、圖2：eaa饑餓后，人類t細胞中gcn2-atf4通路上靶基因(trb3)的可誘導性的條件。

118、圖3：在nutrireg的控制下誘導熒光素酶轉基因的表達。nt細胞：未轉導細胞；ltaare-tk-luc：用2xaare-tk-luc構建體轉導的t細胞。

119、圖4：在nutrireg的控制下誘導gfp轉基因的表達。nt細胞：未轉導細胞；lt?aare-tk-egfp：用2xaare-tk-egfp構建體轉導的t細胞。

120、圖5：流式細胞術中t細胞和egfp蛋白激活標記物的共表達分析。

121、圖6：使用nutrireg誘導t細胞中il-10表達的原理。

122、圖7：在nutrireg的控制下誘導il-10轉基因的mrna(a)和蛋白(b)表達。nt細胞：未轉導細胞；lt?aare-bg-il10：用2xaare-bg-il10構建體轉導的t細胞。

123、圖8：nutrireg介導的il-10轉基因mrna(a)和蛋白(b)表達的可逆性。

124、圖9：nutrireg依賴性il-10表達對1型調節性t細胞(tr1)特征性細胞因子mrna表達的影響。

125、圖10：實驗設計示意圖。nxg免疫缺陷小鼠通過尾靜脈注射接受了10.106個用含有aare-tk-il-10構建體的病毒載體轉導的人類t細胞和5.106個輻照的人類pbmc。七天后，然后每周一次，直到第三周，給小鼠喂食對照飲食或缺乏亮氨酸的飲食16小時，然后進行血樣采集以進行流式細胞術分析和il-10測量。

126、圖11：監測小鼠血液中人類cd45+細胞的擴增。從第1周到第3周，在小鼠已食用對照飲食或缺乏亮氨酸的飲食16小時后，每周用流式細胞術分析pbmc。結果表示為人類cd45+細胞(左)的百分比或人類cd45+細胞中cd4+或cd8+細胞的百分比(學生t檢驗-leu(16h)vsctl：ns不顯著；每種條件n＝4-5；誤差線，s.e.m.)。

127、圖12：監測小鼠血漿中的人類il-10。按照方法部分，從第1周到第3周，每周在小鼠食用對照飲食或缺乏亮氨酸的飲食16小時后，立即用elisa測定血漿中人類il-10濃度(每種條件n＝3-4；誤差線，s.e.m.；右側：線性回歸分析)。

128、圖13：nutrireg-t細胞與foxp3治療基因的應用。(a)通過rt-qpcr分析未轉導的t細胞(nt細胞)和用aare-tk-foxp3構建體(lt)(moi?10)轉導的t細胞中的foxp3?mrna水平，這些細胞在對照培養基(ctl)或在16小時期間缺乏亮氨酸(-leu(16h))中培養。根據肌動蛋白表達歸一化表達。anova檢驗(-leu?vs?ctl?et?nt細胞vs?lt?aare-tk-foxp3)，ns不顯著，***p<0.001，n＝3/條件。(b)通過蛋白質印跡分析未轉導的t細胞(nt細胞)和用aare-tk-foxp3構建體(lt)(moi?10)轉導的t細胞中的foxp3蛋白水平、eif2α蛋白水平以及磷酸化eif2α蛋白水平，這些t細胞在對照培養基(ctl)或在16小時期間缺乏亮氨酸(-leu(16h))中培養。

129、圖14：通過rt-qpcr分析未轉導的t細胞(nt細胞)和用aare-tk-foxp3構建體(lt)(moi?10)轉導的t細胞中的tgf-βmrna水平，這些t細胞在對照培養基(ctl)或在16小時期間缺乏亮氨酸(-leu(16h))中培養。根據肌動蛋白表達歸一化表達。anova檢驗(-leu?vs?ctlet?nt細胞vs?lt?aare-tk-foxp3)，ns不顯著，*p<0.05，n＝3/條件。

130、實施例

131、實施例1：驗證eaa饑餓后人類t細胞中gcn2-atf4通路的可誘導性(圖2)

132、為了隨后能夠在人類t細胞中使用nutrireg，我們首先驗證了gcn2-atf4通路在該細胞類型中可通過eaa饑餓誘導。先前的文獻數據強調了小鼠t細胞在響應于ido(吲哚胺2.3-雙加氧酶)、常山酮(halofuginone)或天冬酰胺酶時激活了這一信號傳遞通路(munn等人,immunity?2005,vol.22,633–642；van?de?velde等人,cell?reports?17.9(2016):2247-2258；sundrud等人,science?324.5932(2009):1334-1338.；bunpo等人,journal?ofnutrition?2010,140,2020-2027)，但關于人類t細胞中響應于aa缺乏時gcn2-atf4通路激活的數據卻很少。

133、因此，我們利用從來自法國血液機構(french?blood?establishment)的預期用于研究的“血沉棕黃層(buffy?coat)”中純化的人類t細胞進行了體外實驗。我們在對照培養基或缺乏亮氨酸的培養基中培養這些細胞。

134、我們證明了(圖2)：

135、(1)t細胞中6小時eaa饑餓(亮氨酸或任何其他eaa)能顯著誘導gcn2-atf4通路的已知靶基因(trb3)的表達。

136、(2)在饑餓培養基中添加亮氨酸后16小時，在t細胞中通過短時間亮氨酸饑餓對gcn2-atf4通路的誘導可被快速逆轉。

137、(3)重要的是，t細胞的激活(通過抗cd3和cd28抗體，在il-2的存在下)對于誘導響應于eaa饑餓的gcn2-atf4通路至關重要。t淋巴細胞的激活對于gcn2激酶的激活至關重要，這一事實已在小鼠t細胞在缺乏色氨酸的培養基中培養后被描述過(munn等人,immunity2005,vol.22,633–642；van?de?velde等人,cell?reports?17.9(2016):2247-2258)，但沒有關于人類t淋巴細胞的信息。

138、(4)響應于短時間亮氨酸饑餓，對gcn2-atf4通路的靶基因trb3的表達的誘導完全依賴于gcn2激酶；這經由使用gcn2的藥理學抑制劑得到證實。

139、實施例2：使用熒光素酶報告基因驗證人類t細胞中的nutrireg功能(圖3)。

140、然后，我們使用兩個報告基因評估了nutrireg在人類t細胞中的功能。使用的第一個報告基因是熒光素酶基因，其插入到2xaare-tk-luc構建體并通過慢病毒載體轉導。在il-2的存在下，通過載有抗cd2/cd3/cd28抗體的磁珠激活t細胞后24小時進行轉導。然后細胞在其激活后8天剝奪亮氨酸，然后測量熒光素酶活性。

141、因此，我們證明了，與(i)在對照培養基中培養的轉導t細胞和(ii)剝奪亮氨酸16小時的非轉導t細胞相比，16小時的亮氨酸饑餓確實會經由nutrireg在t細胞中誘導熒光素酶轉基因的表達。從3小時的亮氨酸缺乏開始就可以檢測到這種誘導，并且當eaa缺乏持續時間增加(6小時、9小時)時，轉基因的表達會增加(圖3)。

142、實施例3：使用egfp報告基因體外驗證人類t細胞中nutrireg的功能(圖4-5)。

143、評價的第二個報告基因是egfp基因，其插入到2xaare-tk-egfp構建體并通過慢病毒載體轉導。在il-2的存在下用載有抗cd2/cd3/cd28抗體的磁珠激活t淋巴細胞后24小時進行了轉導。然后細胞在其激活8天后剝奪亮氨酸，并通過流式細胞術測量egfp蛋白發出的熒光。

144、我們證明了，與(i)在對照培養基中培養的轉導t細胞和(ii)剝奪亮氨酸16小時的非轉導t細胞相比，16小時的亮氨酸饑餓確實會經由nutrireg在t細胞中誘導egfp轉基因的表達。在較短的亮氨酸饑餓時間內無法進行這種誘導，可能是因為egfp蛋白的穩定性問題(圖4)。

145、此外，通過流式細胞術分析t細胞激活標志物(cd69作為早期激活標志物，cd25作為晚期激活標志物)和egfp蛋白的共表達，我們能夠確認t細胞激活在nutrireg的控制下誘導轉基因表達的關鍵作用。事實上，未激活的細胞(cd25-cd69-)不表達egfp，那些中度激活的細胞(cd69-cd25+或cd69+cd25-)表達egfp較弱，而強激活的細胞(cd69+cd25+)是表達最多的egfp蛋白的那些細胞(圖5)。

146、實施例4：nutrireg-t細胞與白細胞介素-10(il-10)治療基因的應用(圖6-9)及體內結果(圖10-12)。

147、為了在治療或預防gvhd(移植物抗宿主病)模型中使用nutrireg技術進行治療的目的，我們設計了一種2xaare-bg-il10構建體，其中插入了位于最小β-珠蛋白(bg)啟動子和2xaare序列下游的白細胞介素10(il-10)cdna(圖6)。事實上，文獻中已經證明，用il-10慢病毒轉導t細胞可以(i)將免疫反應導向tr1型抗炎反應(t調節型1)和(ii)防止小鼠模型中出現gvhd(andolfi等人,molecular?therapy?2012,vol.20,1778-1790；locafaro等人,molecular?therapy?25.10(2017):2254-2269)。

148、早期人體臨床試驗也旨在將免疫反應導向tr1表型，以預防gvhd。為此，在il-10的存在下，通過將供體t細胞與宿主cd3耗竭的單核細胞(pbmc)一起培養，使這些供體t細胞對宿主細胞失去反應性。然后，在同種異體造血干細胞移植后幾周，將無反應性t細胞重新注射到接受者體內(bacchetta等人,frontiers?in?immunology?5(2014):16.)。這些1型調節性t細胞(tr1)具有特定的細胞因子譜，因為它們強烈表達il-10，且較小程度地表達tgfβ、gzmb、ifnγ和il-22。另一方面，它們不表達il-2、il4和il17，也不表達foxp3轉錄因子(gregori等人,frontiers?in?immunology?6(2015):593)。

149、在我們的實驗中，在il-2的存在下，在用載有抗cd2/cd3/cd28抗體的磁珠激活t細胞后24小時，用攜帶2xaare-bg-il-10構建體的慢病毒進行轉導。然后細胞在其激活后8天剝奪亮氨酸，并(i)通過rt-qpcr測量il-10mrna的表達，(ii)通過elisa或流式細胞術測量il-10蛋白的表達，以及(iii)通過rt-qpcr測量tr1表型的不同細胞因子的表達(圖6)。

150、因此，我們證明了，與(i)在對照培養基中培養的轉導t細胞和(ii)置于亮氨酸饑餓的非轉導t細胞相比，16小時亮氨酸饑餓確實會經由nutrireg誘導il-10轉基因的mrna和蛋白表達(圖7a-b)。

151、我們還檢查了饑餓后在培養基中添加亮氨酸確實會停止轉導的t細胞中的轉基因表達，在24小時時停止mrna的表達，在48小時時停止il-10蛋白的表達(圖8a-b)。

152、最后，我們能夠表明，經由nutrireg瞬時表達il-10轉基因可以引導免疫反應向tr1型反應轉變，如細胞因子和轉錄因子譜(mrna)所示：il-10++gzmb+il22+ifnγ+foxp3-il4-(圖9)。

153、最后，我們研究了缺乏亮氨酸的飲食上調注射到小鼠體內的人類t細胞中aare驅動的il-10表達的能力。確實，哺乳動物飲食中缺乏任何一種eaa都可能是aare轉基因表達的潛在誘導因素。由于t細胞的激活對于eaa誘導gcn2-atf4通路必不可少，我們建立了一個小鼠模型，在該模型中我們注射了轉導的人類t細胞和自體輻照的人類pbmc。我們假設轉導的人類t細胞將被輻照的pbmc瞬時激活，并且這種激活足以使gcn2-atf4通路通過eaa營養缺乏來誘導。簡而言之，向免疫缺陷的nxg小鼠的尾靜脈注射(i)攜帶2xaare-tk-il-10構建體的慢病毒轉導的人類t細胞和(ii)人類輻照的pbmcs，然后每周一次用對照飲食或不含亮氨酸的飲食喂養16小時，直到第3周(圖10)。每周對pbmc進行流式細胞術分析使我們能夠跟蹤人類cd45+細胞的正確擴增，而缺乏亮氨酸的飲食對細胞擴增以及cd4+或cd8+表型沒有顯著影響(圖11)。亮氨酸缺乏組中人類il-10隨時間呈線性增加(r2＝0.581；p＝0.004)，而對照組中人類il-10隨時間沒有顯著變化(圖12)。

154、總的來說，這些結果證明了nutrireg技術能夠在體外和體內調節激活的人類t細胞中治療基因的表達，例如il-10。

155、實施例5：nutrireg-t細胞與foxp3轉錄因子的應用(圖13-14)。

156、文獻中的一些出版物表明，用foxp3基因轉導t淋巴細胞可以將這些t淋巴細胞的表型轉向treg?foxp3+表型。例如，將用攜帶foxp3的逆轉錄病毒轉導的cd4+cd25-t細胞(沒有foxp3的組成型表達)注射到免疫缺陷的rag-/-小鼠中，可以使這些細胞轉向表型cd4+cd25+，抑制細胞毒性cd8+反應，并防止出現炎癥性結腸炎的出現。通過慢病毒轉導foxp3在人類細胞中體外證實了小鼠中的這些結果。在此背景下，我們研究了經由nutrireg過表達轉錄因子foxp3，目的是瞬時且可逆地將t淋巴細胞極化為treg表型。因此，我們設計了2xaare-tk-foxp3(人類)轉基因，我們將其轉導到激活的人類t淋巴細胞中(激活24小時)。轉導八天后，我們將細胞轉移到對照培養基或缺乏亮氨酸的培養基中16小時。因此，我們觀察到在nutrireg控制下的foxp3的轉導使得可以在缺乏亮氨酸的培養基中培養16小時后誘導該轉基因的表達。該表達在轉錄水平(圖13a)和翻譯水平(圖13b)上誘導。這種foxp3表達與抗炎細胞因子tgf-β(圖14)以及細胞毒性分子顆粒酶b和穿孔素1的表達增加有關，這些都是foxp3+treg表現出的特征。