本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體地涉及一種用于制備抗體與藥物偶聯(lián)物(adc)的中間體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、通常抗體藥物偶聯(lián)物(adc)屬于腫瘤靶向治療的一種，靶向腫瘤抗原的抗體通過化學合成的連接子與具有細胞毒性的有效載荷共價偶聯(lián)。藥物連接子和有效載荷的選擇在adc的治療效果和安全性中起關(guān)鍵作用。

2、目前，大多數(shù)進入臨床開發(fā)階段的adc分子都利用了可裂解的連接子，包括：酸不穩(wěn)定連接子、肽連接子和二硫化物的連接子。纈氨酸-瓜氨酸(val-cit，vc)與自切割式間隔基芐基羥基(pab)相連形成的可裂解的二肽連接子被廣泛應(yīng)用在adc的臨床開發(fā)中。然而，由于vc連接子具有較強的疏水性，若與中高疏水性有效載荷組合在一起，會與抗體中較為親水的部分一起形成易于聚集的“表面活性劑樣”結(jié)構(gòu)，特別是當dar值高于4時。在體內(nèi)，adc的聚集容易導致快速的血漿清除，療效降低以及毒性增加，高dar值的adc分子尤甚。

3、單甲基澳瑞他汀e(mmae)能夠抑制微管蛋白聚合而起到有效的有絲分裂抑制作用，廣泛用作adc藥物的有效載荷(payload)，盡管在許多難治性實體瘤中有效，但因其水溶性較差，現(xiàn)有連接子在偶聯(lián)mmae時，其dar值在～4時發(fā)揮最優(yōu)的療效，而在更高的dar下，分子會聚集，并導致快速清除。由于平均dar值～4，也導致其在分子均一性及批間穩(wěn)定性方面存在問題，不利于質(zhì)控，同樣的問題也存在于其他中高疏水性化合物中。

4、綜上所述，本領(lǐng)域亟待開發(fā)新的穩(wěn)定的連接子和有效載荷，從而得到有效靶向的adc，以實現(xiàn)最高的治療指數(shù)。

5、人滋養(yǎng)層細胞表面抗原2(trop-2)在多種人類實體瘤中高表達，如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌和胰腺癌等，但其在皮膚和粘膜等關(guān)鍵正常組織中也有不同水平的表達，是它作為adc靶點是否能夠成藥的挑戰(zhàn)。然而，adc技術(shù)能否成功地運用于trop-2陽性腫瘤的靶向治療，其關(guān)鍵問題在于篩選出最佳的連接子和有效載荷的組合，以實現(xiàn)最高的治療指數(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種含有單甲基澳瑞他汀等中高疏水性化合物作為有效載荷且能偶聯(lián)成高dar值的adc分子，以及可高效地將單甲基澳瑞他汀等化合物與抗體進行偶聯(lián)的中間體(即式i化合物)。

2、本發(fā)明的第一方面，提供一種用于制備抗體與藥物偶聯(lián)物的下式i所示的化合物，

3、

4、式i中，

5、z1為用于與抗體進行連接的接頭部分(moiety)；

6、m1為1-10的整數(shù)；

7、m2為10-50的整數(shù)；

8、x表示由小分子細胞毒藥物衍生的基團。

9、在另一優(yōu)選例中，所述z1為取代或未取代的馬來酰亞胺基團。

10、在另一優(yōu)選例中，所述z1通過馬來酰亞胺的5元環(huán)的1位、3位或4位與抗體連接。

11、在另一優(yōu)選例中，所述連接包括：與抗體上的巰基連接、與抗體上的ε-氨基(如賴氨酸的ε-氨基)連接、與抗體上的硒半胱氨酸進行連接、或其組合。

12、在另一優(yōu)選例中，所述z1與抗體上天然存在的活性基團或人工引入的非天然活性基團發(fā)生反應(yīng)所生成的化學連接結(jié)構(gòu)。

13、在另一優(yōu)選例中，所述z1與抗體連接后，形成選自下組的化學連接結(jié)構(gòu)：

14、(a)與抗體上巰基與馬來酰亞胺通過偶聯(lián)反應(yīng)，形成的化學連接結(jié)構(gòu)；

15、(b)與抗體上巰基與二溴馬來酰亞胺通過偶聯(lián)反應(yīng)，形成的化學連接結(jié)構(gòu)；

16、(c)抗體上賴氨酸的ε-氨基與連接子上的活性胺基團反應(yīng)，形成的化學連接結(jié)構(gòu)；

17、(d)抗體上賴氨酸與含馬來酰亞胺的衍生物進行的偶聯(lián)反應(yīng)，形成的化學連接結(jié)構(gòu)；

18、(e)抗體上賴氨酸與碘乙酰胺類的偶聯(lián)反應(yīng)，形成的化學連接結(jié)構(gòu)；

19、(f)抗體上賴氨酸基于亞氨基硫烷的偶聯(lián)反應(yīng)，形成的化學連接結(jié)構(gòu)；

20、(g)抗體上賴氨酸基于吡啶二硫化物的偶聯(lián)反應(yīng)，形成的化學連接結(jié)構(gòu)；

21、(h)與抗體上人工引入的硒半胱氨酸進行的定點偶聯(lián)，形成的化學連接結(jié)構(gòu)；

22、(i)上述的任意組合；

23、

24、在另一優(yōu)選例中，上式(a)和(b)中，m3為1-8(較佳地2-6)的正整數(shù)。

25、在另一優(yōu)選例中，上式(d)和(e)中，spacer選自：-(ch2)m4-、-(ch2o)m4-，其中，m4為0-10的整數(shù)，較佳地，1-6的整數(shù)。

26、在另一優(yōu)選例中，所述的式i化合物為式ia化合物：

27、

28、式ia中，

29、m1為1-10的整數(shù)；

30、m2為10-50的整數(shù)；

31、x為單甲基澳瑞他汀等疏水性化合物(即單甲基澳瑞他汀等化合物失去h原子后的基團)。

32、在另一優(yōu)選例中，m1為1-8，更佳地為4、5，最佳地為5。

33、在另一優(yōu)選例中，m2為12-40，更佳地16-36，最佳地為24。

34、在另一優(yōu)選例中，x為單甲基澳瑞他汀e(mmae)衍生的基團，即

35、

36、在另一優(yōu)選例中，所述式i化合物的結(jié)構(gòu)如式iii所示：

37、

38、mmae的定義如上所述。

39、本發(fā)明第二方面，提供一種抗體與藥物偶聯(lián)物(adc)，所述抗體與藥物偶聯(lián)物是第一方面所述的式i化合物與抗體偶聯(lián)形成的抗體與藥物偶聯(lián)物(adc)。

40、在另一優(yōu)選例中，抗體與藥物偶聯(lián)物具有式ii所示的結(jié)構(gòu)：

41、ab-(l-x)n?ii

42、式ii中，

43、ab表示抗體，

44、l為如下所示的二價連接子：

45、

46、其中z1’為z1基團去掉一個氫后剩下的基團；

47、x如上文所定義；n為偶聯(lián)于所述抗體的所述藥物的平均偶聯(lián)數(shù)量；

48、m1和m2的定義如上所述。

49、在另一優(yōu)選例中，n是>0整數(shù)或非整數(shù)，較佳地1≤n≤15，例如，n為5-10的整數(shù)或非整數(shù)；較佳地，為6-9的整數(shù)或非整數(shù)；更佳地，為7-8的整數(shù)或非整數(shù)。

50、在另一優(yōu)選例中，所述抗體選自下組：嵌合抗體、二價或雙特異性分子、雙抗體、三抗體和四抗體。

51、在另一優(yōu)選例中，所述抗體可以是任意靶點的抗體，例如所述靶點選自下組：

52、trop-2、pd-l1、ctla4、ox40、epcam、egfr、egfrviii，her2、ptpn2、vegf、cd11a、cd19、cd20、cd22、cd25、cd30、cd33、cd40、cd56、cd64、cd70、cd73、cd74、cd79、cd105、cd138、cd174、cd205、cd227、cd326、cd340、muc16、gpnmb、psma、cripto、ed-b、tmeff2、ephb2、apo2、nmp179、p16ink4a、nectin-4、b7h3、ema、cea、mib-1、gd2、april受體、葉酸受體、間皮素抑制劑、met、tm4sf1、il13受體等。

53、在另一優(yōu)選例中，所述抗體與藥物偶聯(lián)物中，在二價連接子l中，m1為1到8的整數(shù)。

54、在另一優(yōu)選例中，所述抗體與藥物偶聯(lián)物中，在二價連接子l中，m2為20、21、22、23、24、25、26的整數(shù)。

55、在另一優(yōu)選例中，所述抗體與藥物偶聯(lián)物中，在二價連接子l中，m1為4，m2為24。

56、在另一優(yōu)選例中，所述抗體與藥物偶聯(lián)物中，在二價連接子l中，m1為5，m2為24。

57、在另一優(yōu)選例中，所述抗體為hrs7。

58、在另一優(yōu)選例中，所述抗體hrs7的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含seq?id?no.:1所示的序列或為seq?id?no.:1所示的序列；和/或所述抗體hrs7的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含seq?id?no.:2所示的序列或為seq?id?no.:2所示的序列。

59、在另一優(yōu)選例中，所述抗體與藥物偶聯(lián)物中，所述抗體為hrs7，且在所述l中，z1’為馬來酰亞胺去掉一個氫后剩下的基團，m1為5，m2為24，n為1-15之間的整數(shù)。

60、本發(fā)明第三方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含：(a)如第二方面所述抗體與藥物偶聯(lián)物，以及(b)藥學上可接受的載體。

61、本發(fā)明第四方面，提供一種如第二方面所述抗體與藥物偶聯(lián)物或如第三方面所述的藥物組合物在制備治療腫瘤或免疫疾病的藥物中的用途。

62、在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤選自trop-2靶向的腫瘤、her2靶向的腫瘤和egfr靶向的腫瘤。

63、在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤為trop-2靶向的腫瘤，并且選自乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌和胰腺癌。

64、本發(fā)明第五方面，提供一種制備第二方面所述抗體與藥物偶聯(lián)物的方法，所述方法包括步驟：

65、(1)提供一反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系中包括待偶聯(lián)的抗體和第一方面所述的式i化合物；

66、(2)在所述反應(yīng)體系中，將所述抗體和所述的式i化合物進行偶聯(lián)反應(yīng)，從而制得第二方面所述抗體與藥物偶聯(lián)物。

67、在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系的ph為6.0-8.0；較佳地，為7.0-8.0。

68、在另一優(yōu)選例中，所述抗體與式i化合物(或單甲基澳瑞他汀等疏水性化合物)的摩爾比為1:1～1：20；較佳地，為1：6～1：15，更佳地，為1:8～1：12。

69、在另一優(yōu)選例中，反應(yīng)時間為1h～48h；較佳地，為3h～36h。

70、在另一優(yōu)選例中，所述的偶聯(lián)包括定點偶聯(lián)和隨機偶聯(lián)。

71、在另一優(yōu)選例中，所述的定點偶聯(lián)包括k-lock和c-lock兩種偶聯(lián)方式。在k-lock偶聯(lián)方式中，vk-x偶聯(lián)于抗體序列中賴氨酸(k)殘基，在c-lock偶聯(lián)方式中，vk-x偶聯(lián)于抗體序列中的半胱氨酸(c)殘基。

72、本發(fā)明第六方面，提供一種式iv所示的化合物

73、

74、式中，w1選自：h、fmoc-、

75、w2選自：h、trt-、其中，當w1為時，w2不為或當w2為時，w1不為

76、x、m1、m2、z1的定義如上所述。

77、本發(fā)明第七方面，提供一種第六方面所述的式iv化合物的制備方法，包括如下步驟：

78、(s1)在惰性溶劑中，堿存在下，化合物1與x-h反應(yīng)，得到式iv化合物；

79、

80、x、w1、w2的定義如上所述。

81、在另一優(yōu)選例中，步驟(s1)中，惰性溶劑為dmf。

82、在另一優(yōu)選例中，步驟(s1)中，堿為diea。

83、本發(fā)明第八方面，提供一種第一方面所述的式i化合物在制備抗體與藥物偶聯(lián)物中的用途。

84、本發(fā)明第九方面，提供一種治療或預防腫瘤的方法，所述方法包括以下步驟：給需要的對象施用如上所述抗體與藥物偶聯(lián)物或如上所述的藥物組合物。

85、在另一優(yōu)選例中，所述對象為哺乳動物，包括人。

86、在另一優(yōu)選例中，所述抗體與藥物偶聯(lián)物的給藥劑量為0.1-60毫克/千克；較佳地，為0.5-15毫克/千克；更佳地，為1-10毫克/千克。

87、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

88、有益效果

89、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的主要有益效果包括：

90、(1)本發(fā)明式i化合物能有效地將單甲基澳瑞他汀等化合物以高dar值偶聯(lián)到抗體上，而常規(guī)的val-cit-pab連接子則不能。

91、(2)本發(fā)明式i化合物具有較好的親水性。

92、(3)由本發(fā)明式i化合物得到的抗體與藥物偶聯(lián)物具有經(jīng)優(yōu)化的dar值和載荷，使得本發(fā)明adc的治療窗口更大。

93、(4)本發(fā)明提供的抗體與藥物偶聯(lián)物對腫瘤細胞具有顯著殺滅腫瘤細胞的活性。

94、(5)本發(fā)明首次開發(fā)了可與抗體(如hrs7抗體)高效偶聯(lián)并穩(wěn)定的含x分子的adc，所述adc具有協(xié)同的治療作用，可以顯著地擴大x對腫瘤細胞的殺傷活性。

95、(6)本發(fā)明式i化合物可與各種不同抗體偶聯(lián)，所形成的抗體與藥物偶聯(lián)物具有經(jīng)優(yōu)化的dar值，從而使得本發(fā)明adc具有更高的親水性和熱穩(wěn)定性。

96、(7)本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物具有更高的藥效。

97、(8)本發(fā)明提供的抗體與藥物偶聯(lián)物具有更好的藥代性能以及更低的毒副作用。

98、下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sam?brook等人，分子克隆：實驗室手冊(new?york:cold?spring?harborlaboratory?press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。