專利名稱：嵌合黃病毒疫苗的制作方法
背景技術：
本發明涉及可用作抗黃病毒屬所致疾病之疫苗的傳染性、減毒病毒。
黃病毒科的幾個成員對全球公共健康造成現實或潛在的威脅。例如，日本腦炎(Japanese encephalitis)是一種使遠東數百萬個體遭受風險的重大的公共健康問題。據估計全球范圍內原發性登革熱的年發病率為1億例，出血性登革熱的發病率超過450,000例，登革熱(Dengue)病毒已經顯示出是唯一一種最重要的由節肢動物傳播的人類疾病。其它黃病毒不斷產生性質變化的地方病，具有隨氣候，攜帶者群體的改變，和人類活動導致的環境混亂，而進入新地區的潛能。這些黃病毒包括，例如，St.Louis腦炎病毒，它導致美國中東部，東南部，和西部偶發但嚴重的急性疾病；西尼羅河(West Nile)病毒，它導致熱病，偶爾并發急性腦炎，它在非洲大部，中東，前蘇聯，和歐洲部分地區廣泛傳播；Murray山谷(Murray Valley)腦炎病毒，它引起澳大利亞地方性神經系統疾病；蜱傳(Tick-borne)腦炎病毒，它在前蘇聯大部和東歐傳播，在那里這種病毒的硬蜱傳播者很盛行，造成這些地區腦炎極為嚴重。
丙型肝炎病毒(HCV)是黃病毒屬家族的另一個成員，具有與上述黃病毒相似但不相同的染色體構成和復制策略。HCV大都經非腸道接觸感染，它與能夠發展成為肝硬化和肝細胞癌的慢性肝炎有關，在美國它還是需要常位移植的肝病的起因。
黃病毒科與α病毒屬(alphaviruses)(例如，WEE，VEE，EEE，SFV等)不同，目前包含三個屬黃病毒屬、瘟病毒屬、和丙型肝炎病毒屬。黃病毒屬的完全加工后的成熟病毒顆粒包含三個結構蛋白包膜(envelope，E)蛋白，衣殼(capsid，C)蛋白，和膜(membrane，M)蛋白，以及七個非結構蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，和NS5)。在感染細胞中發現的未成熟的黃病毒顆粒包含前-膜(prM)蛋白，它是M蛋白的前體。
病毒顆粒與宿主細胞受體結合后，E蛋白暴露于內體的酸性pH值下，發生不可逆的構型改變，導致病毒顆粒的雙層包膜與胞內小泡融合，由此將病毒基因組釋放到宿主胞質溶膠中。含有prM的蜱傳腦炎(TBE)病毒無融合能力，表明prM的蛋白酶解加工過程對于產生有融合能力和完全傳染性的病毒顆粒是必要的(Guirakhoo等，病毒遺傳學雜志(J.Gen.Virol.)，72(Pt.2)333-338，1991)。在病毒復制循環后期，用氯化銨處理，產生含prM的Murray山谷腦炎(MVE)病毒，并顯示無融合能力。利用序列特異性肽和單克隆抗體，證明prM可與E蛋白的200-327位氨基酸相互作用。這種相互作用對于保護E蛋白免受由胞外途徑的酸性小泡中熟化導致的不可逆的構型改變是必要的(Guirakhoo等，病毒學，191921-931，1992)。
prM裂解為M蛋白，隨即弗林蛋白酶樣細胞蛋白酶釋放病毒顆粒，(Stadler等，病毒學雜志，718475-8481，1997)，這對激活血凝活性、融合活性、和病毒顆粒的感染性是必要的。M蛋白由位于共有序列R-X-R/K-R(X是可變的)之后的它的前體蛋白(prM)分解而成，并與E蛋白一起摻入病毒的脂質包膜。
裂解序列不僅在黃病毒屬中為保守序列，而且在其它非相關病毒的蛋白質，例如鼠冠狀病毒的PE2、α病毒屬的PE2、流感病毒的HA、和逆轉錄病毒的p160中也為保守序列。病毒感染性的關鍵在于前體蛋白的裂解，而不是顆粒的形成。據報道，在一例TBE-登革熱4型嵌合體中，prM裂解位點的改變導致這種嵌合體的神經毒力降低(Pletnev等，病毒學雜志，674956-4963，1993)，這與以前的觀察結果，即prM的有效加工對完全感染性是必要的一致(Guirakhoo等，1991，同上，1992，同上；Heinz等，病毒學，198109-117，1994)。prM蛋白的抗體可以介導保護性免疫，這顯然是因為能夠中和所釋放的含有一些未裂解prM的病毒顆粒。通過感染性克隆的定點誘變缺失了VEE的PE2的蛋白酶解裂解位點(4個氨基酸)(Smith等，ASTMH會議，12月7-11，1997)。缺失突變體高效復制，PE2蛋白摻入顆粒中。這種突變體在非人靈長動物中得以評價，顯示100％的血清轉化，并保護所有經免疫猴使之免遭致命的攻擊。
發明概述本發明以嵌合、活體、感染性的減毒病毒為特征，它們各由以下方面構成
(a)第一種黃熱病毒(例如，毒株17D)，表示活的、減毒疫苗病毒，其中prM-E蛋白的核苷酸序列或者被缺失、截短、或者被突變，以至于第一黃病毒的功能性prM-E蛋白不能表達，和(b)編碼第二種不同黃病毒的病毒包膜(prM-E)蛋白的核苷酸序列整合到第一種黃病毒的基因組中，以至于第二種黃病毒的prM-E蛋白由第一種黃病毒的改變的基因組表達。
因此嵌合病毒由屬于第一種黃病毒的負責胞內復制的基因和基因產物，和第二種黃病毒的包膜基因和基因產物組成。由于病毒包膜含有所有的負責誘導中和抗體的抗原決定簇，用這種嵌合病毒感染的結果是產生的抗體僅僅抗第二種黃病毒。
在本發明的嵌合病毒中，用作第一種黃病毒的優選活病毒是黃熱病毒。至少一種疫苗已經使用這種活的、減毒病毒；這種疫苗稱為YF17D，已經在人類免疫中應用超過50年。YF17D疫苗已在大量出版物中描述，包括Smithburn等的出版物(“黃熱病免疫”，世界衛生組織，p.238，1956)，以及Freestone(in Plotkin等，(編)，疫苗，第二版，W.B.Saunders，Philadelphis，1995)。另外，黃熱病毒已經在基因水平得以研究(Rice等，科學，229726-733，1985)，相關基因型和表型的資料已經建立(Marchevsky等，美國營養醫學與健康雜志(Am.J.Trop.Med.Hyg.)，5275-80，1995)。
在本發明嵌合病毒中用作第二種黃熱病毒，并因此作為免疫抗原來源的優選黃病毒包括日本腦炎(JE)，登革熱(DEN，例如1-4型登革熱的任意一種)，Murray山谷腦炎(MVE)，St.Louis腦炎(SLE)，西尼羅河(WN)，蜱腦炎(TBE)，和丙型肝炎(HCV)病毒。用作第二種黃病毒的其它黃病毒包括Kunjin病毒，中歐腦炎(Central European Enecphalitis)病毒，俄羅斯春-夏腦炎(Russian Spring-Summer Encephalitis)病毒，Powassan病毒，Kyasanur森林病(Kyasanur Forest Disease)病毒，以及Omsk出血熱(Omsk出血熱)病毒。本發明的優選嵌合病毒中，第二種黃病毒的prM-E蛋白編碼序列代入(snbstitute into)活黃熱病毒的prM-E蛋白編碼序列。在優選嵌合病毒中，prM-E蛋白編碼序列來源于減毒病毒株，例如疫苗株。同時，如同進一步將描述的，蛋白質的prM部分可以含有防止裂解產生成熟膜蛋白的突變。
本發明還包括通過給哺乳動物施用本發明的嵌合黃病毒，預防或治療哺乳動物(例如人)的黃病毒感染的方法；本發明的嵌合黃病毒在制備預防或治療黃病毒感染的藥物中的用途；編碼本發明的嵌合黃病毒的核酸分子；以及本發明嵌合黃病毒的制備方法。
本發明具備以下優點。例如，因為它們是活體，并且正在復制，本發明的嵌合病毒可以用于產生長期保護性免疫力。因為病毒具有減毒病毒復制基因(例如，黃熱17D)，得到的嵌合病毒毒力衰減到可以對人類安全使用的程度。
本發明的其它特征和優點將由下列詳細描述、附圖和權利要求說明。
附圖簡述

圖1圖示構建本發明的黃熱/日本腦炎(YF/JE)嵌合病毒進行的基因操作步驟。
圖2是本發明的嵌合YF/JE病毒在可接受用于制備人類疫苗的細胞培養中的一系列生長曲線。
圖3是顯示RMS(Research Master Seed，YF/JE SA14-14-2)和YF-Vax在MRC-5細胞中的生長比較。
圖4是顯示用本發明YF/JE嵌合病毒進行的小鼠神經毒力分析結果的圖和表。
圖5圖示了產生嵌合YF/DEN-2病毒的兩個質粒系統的結構圖。該策略基本上與描述的YF/JE嵌合病毒的一致。
圖6圖示了經修飾的YF克隆的結構，該克隆被設計為缺失了部分NS1蛋白和/或在內部核糖體進入位點(IRES)的調控下表達外源蛋白。該圖僅顯示病毒基因組的E/NS1區。翻譯終止密碼子被導入包膜(E)蛋白的羧基末端。下游翻譯在基因間的開放讀碼框(ORF)內，由IRES-1起始，驅動外源蛋白的表達(例如，HCV蛋白E1和/或E2)。第二個IRES(IRES-2)控制YF非結構區的翻譯起始，其中嵌套，截短的NS1蛋白得以表達(例如，NS1del-1，NS1del-2，或NS1del-3)。NS1缺失的大小與連接于IRES-1的ORF的大小成反比。
圖7是顯示經YF/JE SA14-14-2嵌合疫苗免疫之小鼠的中和抗體反應圖。
詳細描述本發明提供可以用于預防黃病毒感染之免疫法的嵌合黃病毒。下文描述了本發明的嵌合黃病毒的構建和分析，例如黃熱病毒和日本腦炎(JE)、登革熱1-4型(DEN1-4)、Murray山谷腦炎(MVE)、St.Louis腦炎(SLE)、西尼羅河(WN)、蜱傳腦炎(TBE)、和丙型肝炎(HCV)病毒的嵌合體。
黃病毒蛋白由單一、長的開放閱讀框(編碼，i.a.，結構蛋白衣殼(C)蛋白、前-膜(pr-M)蛋白、和包膜(E)蛋白，以及非結構蛋白)翻譯，以及隨后的一系列復雜的翻譯后蛋白酶解裂解而成。如上面討論的，本發明的嵌合黃病毒包括其中一種黃病毒的pr-M和E蛋白由另一種黃病毒的pr-M和E蛋白取代的黃病毒。因此，這些嵌合黃病毒的產生涉及兩種不同黃病毒的衣殼蛋白和前-膜蛋白之間，以及包膜蛋白和非結構區(NS1)之間的新連接的產生。這些蛋白之間的裂解(C和pr-M，以及E和NS1)在黃病毒蛋白的天然蛋白酶解加工過程中發生，并需要裂解位點連接處的旁側信號序列的存在。
在本發明的嵌合黃病毒中，優選組裝成嵌合體的病毒的信號序列基本上保留，以使C和pr-M以及E和NS1蛋白之間的適當裂解可以有效發生。這些信號序列在下述的嵌合體中已經得以保留。換句話說，大量已知信號序列中的任一種經改造可連接嵌合體的C和pr-M或者E和NS1蛋白(參見，例如，von Heijne，歐洲生物化學雜志，13317-21，1983；von Heijne，分子生物學雜志，18499-105，1985)，或者，例如，利用已知序列為指導，本領域技術人員可以設計能夠用于本發明嵌合體的其它信號序列。具體地說，例如，信號序列的最后一個氨基酸殘基具有小的無電荷側鏈，例如丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、或谷氨酰胺。信號序列的其它要求為本領域已知(參見，例如，von Hei jne，1983，同上；von Heijne，1985，同上)。同樣，每種組裝成嵌合體的病毒的信號序列可以被保留或基本上保留，以便進行適當的裂解。生產YF/JE嵌合病毒的cDNA模板的構建本發明的下述YF/JE嵌合體的全長cDNA模板的獲得，利用了早期工作者在YF復制的分子遺傳分析中使用的由cDNA再生YF17D的操作中應用的類似方法。該方法由，例如，Nestorowicz等描述(病毒學，199114-123，1994)。
簡要地說，本發明的YF/JE嵌合體的獲得包括以下步驟。YF基因組序列在兩個質粒中(YF5’3’IV和YFM5.2)擴增，這兩個質粒編碼YF序列的核苷酸1-2276和8279-10861(YF5’3’IV)，以及核苷酸1373-8740(YFM5.2)(Rice等，新生物學家，1285-296，1989)。全長cDNA模板由來源于上述質粒的合適限制性片段連接而成。這是目前確保YF序列穩定表達和產生高度特異性感染的RNA轉錄物的最可靠方法。
我們構建嵌合體的策略包括由從prM蛋白開始(核苷酸478，氨基酸128)，經過E/NS1裂解位點(核苷酸2452，氨基酸817)的相應JE序列取代YF5’3’IV和YFM5.2質粒中的YF序列。除克隆JEcDNA之外，還需要以下步驟導入或除去YF和JE序列的限制性位點，以進行體外連接。再生嵌合YF(C)/JE(prM-E)病毒的模板的結構如圖4所示。編碼完整JE結構區(C-prM-E)的第二嵌合體用類似方法改造。JE病毒結構區的分子克隆真正的JE結構蛋白基因的克隆由JE SA14-14-2毒株(JE活體減毒疫苗株)產生，因為這一毒株的生物學性質和分子特征已有大量記載(參見，例如，Eckels等，疫苗，6513-518，1988；JE SA14-14-2由疾病控制中心提供，Fort Collins，Colorado和Yale蟲媒病毒研究單位，Yale University，New Haven，Connecticut，它們是世界衛生組織指定的美國蟲媒查詢中心)。獲得傳代水平為PDK-5的JESA14-14-2病毒，并在LLC-MK2細胞中傳代以獲得足夠用于cDNA克隆的病毒量。我們使用的方法包括將結構區克隆為在NheI位點(JE核苷酸1125)重疊的兩段，它們隨后可以用于體外連接。
從感染的LLC-MK2單層細胞提取RNA，利用逆轉錄酶以及反義引物(JE核苷酸序列2456-71)進行反義cDNA的第一條鏈合成，所述反義引物包含嵌套的XbaI和NarI限制性位點區，分別用于在開始時克隆到pBluescript II KS(+)中，隨后克隆到YFM5.2(NarI)中。cDNA的第一條鏈合成之后，對JE的核苷酸序列1108-2471進行PCR擴增，該PCR擴增使用同樣的反義引物和有義引物(JE核苷酸序列1108-1130)，所述引物包含嵌套的XbaI和NsiI限制性位點，分別用于克隆到pBluescript和YFM5.2(NarI)中。JE序列由限制性酶消化和核苷酸測序驗證。JE核苷酸序列的1-1130位核苷酸來源于反義JE cDNA的PCR擴增，該擴增使用相應于JE核苷酸1116-1130的反義引物和相應于JE核苷酸1-18的有義引物，二者均含有EcoRI限制性位點。PCR片段克隆到pBluescript中，并通過核苷酸測序驗證JE序列。它們合起來表示JE序列1-2471位核苷酸(1-792位氨基酸)的克隆。YF5’3’IV/JE和YFM5.2/JE衍生物的構建為了在YF E/NS1裂解位點插入JE包膜蛋白的C末端，由E/NS1裂解位點信號酶序列的(YF的2447-2452位核苷酸，816-817位氨基酸)寡核苷酸-定點突變將唯一一個NarI限制性位點導入YFM5.2質粒，以產生YFM5.2(NarI)。對來源于插入上述突變的模板的轉錄物，檢查其感染力，產生類似于親代模板(約100噬斑形成單位/250納克的轉錄物)的特異感染力。JE序列的1108-2471位核苷酸從幾個獨立的pBluescript/JE的PCR來源的克隆用單一NsiI和NarI限制性位點亞克隆到YFM5.2(NarI)中。鄰近JE prM-E區的包含YF 5’非翻譯區(核苷酸1-118)的YF5’3’IV/JE克隆來源于PCR擴增。
為了得到含有YF衣殼蛋白和JE prM蛋白之連接的序列，使用跨越該區的反義嵌合引物和相應于YF5’3’IV核苷酸6625-6639的有義引物，以生產PCR片段，該片段隨后用作反義PCR引物，并與互補于pBluescript載體EcoRI位點上游序列的有義引物聯合使用，通過位于1125位核苷酸的NheI位點，從477位核苷酸(prM蛋白的N末端)擴增JE序列(在pBluescript載體中被反向編碼)。得到的PCR片段通過NotI和EcoRI限制性位點插入YF5’3’IV質粒。該構建體包括位于YF 5’-非翻譯區之前的SP6啟動子，其后緊跟YF(C)JE(prM-E)序列，該構建體還包括體外連接必要的NheI位點(JE核苷酸1125)。
對YFM5.2和YF5’3’IV進行改造，使它們含有用于體外連接的限制性位點為了將JE包膜序列中的NheI位點用作體外連接的5’位點，將YFM5.2質粒中多余的NheI位點(核苷酸5459)缺失。這通過YF序列5461位核苷酸的沉默突變實現(T→C；丙氨酸，1820位氨基酸)。該位點通過與合適的限制性片段連接而插入YFM5.2，并通過與編碼嵌合YF/JE序列的NsiI/NarI片段交換導入YFM5.2(NarI)/JE。
為了產生用于體外連接的單一3’限制性位點，將BspEI位點連接于AatII位點的下游，AatII位點正常用于由YF5’3’IV和YFM5.2產生全長模板。(在JE的結構序列中出現多個AatII位點，用于體外連接時排除使用該位點。)BspEI位點通過YF的8581位核苷酸沉默突變產生(A→C；絲氨酸，2860位氨基酸)，并通過與合適的限制性片段交換導入YFM5.2。該單一位點通過與XbaI/SphI片段交換插入YFM5.2/JE，并通過三段合適限制性片段的連接插入YF5’3’IV/JE(prM-E)質粒，這些限制性片段來源于母體質粒以及缺失1位和6912位核苷酸處的EcoRI位點之間的YF序列的YFM5.2(BspEI)衍生物。JE Nakayama cDNA通過交換插入YF/JE嵌合質粒由于PCR來源的JE SA14-14-2結構區在嵌合病毒的上下文行使適當功能能力的不確定性，我們使用來源于JE Nakayama毒株的一個克隆的cDNA，該毒株在表達實驗中已被詳細鑒定，并且具有導入保護性免疫的能力(參見，例如，McIda等，病毒學158348-360，1987；JE Nakayama毒株由疾病控制中心提供，Fort Collins，Colorado，和Yale蟲媒病毒研究單位，Yale University，NewHaven，Connecticut)。Nakayama cDNA通過合適的限制性位點(HindIII到PvuII和BpmI到MunI)插入YF/JE嵌合質粒，以替代兩個質粒系統中的全部prM-E區，除了49位的一個氨基酸，絲氨酸，它被完整保留下來以便利用NheI位點進行體外連接。對Nakayama克隆的全部JE區進行測序以便驗證cDNA是否真正被取代(表2)。全長cDNA模板的產生，RNA轉染，以及感染性病毒的回收生產全長cDNA模板的方法基本上與Rice等的描述相同(新生物學家1285-96，1989)(參見圖1)。對于嵌合模板，用NheI/BspEI消化質粒YF5’3’IV/JE(prM-E)和YFM5.2/JE，然后在T4 DNA連接酶存在下，利用50納克純化片段進行體外連接。連接產物用XhoI線性化，從而可以進行失控轉錄。用50納克純化模板合成SP6轉錄產物，通過摻入3H-UTP定量，RNA的完整性通過非變性瓊脂糖凝膠電泳驗證。該方法的產量范圍為每次反應產生5-10微克RNA，它們中的大多數為全長轉錄產物。按照Rice等對YF17D的描述(同上)在陽離子脂質體的存在下進行RNA轉錄產物的轉染。在實驗開始，LLC-MK2細胞用于轉染和定量病毒，因為我們已經確定該細胞對YF和JE親代毒株的復制和噬菌斑形成是許可的。表1例舉了利用脂轉染法(GIBCO/BRL)作為轉染載體的轉染實驗的主要結果。Vero細胞系也已經常規用于制備感染性病毒貯存物、表征標記蛋白、以及中和實驗。嵌合cDNA模板的核苷酸序列對含有嵌合YF/JE cDNA的質粒進行克隆的JE部分的序列分析，以驗證SA14-14-2和Nakayama包膜蛋白的正確序列。表2顯示這些構整體與報道序列(McAda等，同上)之間核苷酸序列差異的比較。嵌合YF/JE病毒的結構和生物學特征通過由感染的單層細胞收獲到的病毒RNA的RT/PCR分析驗證從轉染實驗回收得到的嵌合YF/JE病毒的基因組結構。進行這些實驗是為了消除轉染過程中病毒貯存物被污染的可能性。為了進行這些實驗，使用第一代病毒起始感染循環，以便消除由于殘存的轉染病毒RNA存在而產生的任何可能的假產物。利用YF和JE特異性引物對YF/JE(prM-E)-SA14-14-2或YF/JE(prM-E)-Nakayama嵌合體感染的細胞的總RNA提取物進行RT-PCR，所述引物允許以兩個約1千堿基大小的PCR產物回收全部結構區。然后，利用SA14-14-2和Nakayama序列中可區別這些病毒的預定位點，通過限制性酶消化分析這些產物。使用該方法，確定病毒RNA是嵌合的，經證實回收到的病毒具有合適的限制性位點。然后通過跨越嵌合YF/JE C-prM連接的循環序列分析確證真正的C-prM邊界在序列水平上是完整的。
通過與JE-特異性抗血清的免疫沉淀以及利用YF和JE-特異性抗血清進行的噬菌斑減少中和實驗驗證兩個嵌合體中JE包膜蛋白的存在。利用JE E蛋白的單克隆抗體對經嵌合體感染之LLC-MK2細胞的35S-標記的提取物進行免疫沉淀，顯示JE包膜蛋白可以作為55kD的蛋白被回收，然而同樣的抗血清不能對YF感染細胞的蛋白質發生免疫沉淀。JE和YF超免疫血清證明均能與兩個包膜蛋白交叉反應，但是蛋白之間的大小差異(YF＝53kD，未糖基化；JE＝55kD，糖基化)可以重復觀察到。在免疫沉淀條件下使用YF單克隆抗體不令人滿意，因此，該分析中的特異性依賴于JE單克隆抗體。利用YF和JE-特異性超免疫腹水(ATCC)和YF-特異性純化IgG(單抗2E10)對嵌合病毒以及YF和JE SA14-14-2病毒進行噬菌斑減少中和實驗(PRNT)。在這些實驗中(表3)觀察到與對照病毒相比，對于嵌合體，噬菌斑減少50％之滴度下的抗血清顯示出顯著差異。因此，中和反應需要的表位在感染性嵌合YF/JE病毒中得到表達。
細胞培養中的生長特征在來源于靈長類動物和蚊子的細胞系中定量檢查了上述嵌合體的生長能力。圖2例舉低復數感染(low multiplicity infection)(0.5噬斑形成單位/細胞)后，在LLC-MK2細胞上嵌合體的累積生長曲線。該實驗中，使用YF5.2iv(克隆的衍生物)和JE SA14-14-2(未克隆)病毒進行比較。兩種嵌合病毒都達到比各自親代病毒高約一個對數的最大病毒產量。對于YF/JE SA14-14-2嵌合體，病毒產量峰比YF/JE Nakayama嵌合體遲12小時(50小時對38小時)出現。對于上述細胞系，YF/JE Nakayama嵌合體比YF/JE SA14-14-2嵌合體表現明顯更強的細胞病變作用。對C6/36細胞低復數感染后(0.5噬斑形成單位/細胞)，進行類似實驗。圖2也例舉了在這種無脊椎動物細胞系中病毒的生長動力學。該實驗中收獲病毒的各點均得到類似的病毒產量，進一步支持這樣的觀點，即嵌合病毒的復制效力沒有被削弱。
RMS(YF/JE SA14-14-2)與YF 17D疫苗在MRC-5細胞中的生長動力學比較進行下述實驗評價可接受用作人類疫苗的侯選疫苗在細胞系中的增殖能力。商購的黃熱病17D疫苗(YF-Vax)得自Connaught實驗室，Swiftwater，PA。MRC-5(二倍體人胚肺細胞)購自ATCC(171-CCL，Batch#F-14308，第18代)，并在EMEM、2mM L-谷氨酰胺、調整到含1.5g/L碳酸氫鈉、0.1mM非必需氨基酸、和10％FBS的Earle’s BSS中生長。
為了比較RMS(Research Master Seed，YF/JE SA14-14-2)和YF-Vax的生長動力學，細胞生長到90％的鋪滿度，然后用感染復數為0.1pfu的RMS或YF-Vax感染。因為MRC-5細胞通常生長較緩慢，因此這些細胞接種后保留10天。每日留樣，冷凍7-10天，感染力由在Vero細胞中的噬菌斑檢測確定。
YF-Vax和YF/JE嵌合體在MRC-5細胞中生長到中度滴度(圖3)。YF-Vax在第二天獲得的峰滴度為~4.7log10pfu，RMS略低，6天后的峰滴度為4.5log10pfu。對正常成年小鼠的神經毒力實驗通過剛成年小鼠腦內接種，分析YF/JE SA14-14-2嵌合體的毒性。對每組10只小鼠(4周齡的雄性和雌性ICR小鼠，每組各5只)以10,000噬斑形成單位接種YF/JE SA14-14-2嵌合體、YF5.2iv、或JESA14-14-2，每日觀察，連續3周。該實驗的結果由圖4說明。接種YF5.2iv親代的小鼠接種后約1周死亡。接種JE SA14-14-2親代或嵌合體的小鼠沒有觀察到致死癥狀或疾病癥狀。注射時測定用于該實驗的接種物的滴度，測定存活小鼠小組中和抗體的存在，以確定動物已經被感染。在這些實驗中，抗JE SA14-14-2病毒的滴度與接種該毒株或嵌合體的動物產生的滴度近似。
其它研究YF/JE SA14-14-2嵌合體在小鼠體內的神經毒力的實驗結果如表4說明。這些實驗中，接種YF5.2iv的鼠在7-8天內全部死亡。相反，接種YF/JE SA14-14-2的小鼠接種后兩周沒有觀察到死亡。
研究YF/JE嵌合體的神經侵入力和致病性的實驗結果如表5說明。這些實驗中，以10,000到1百萬噬斑形成單位的劑量經腹膜內途徑給3周齡小鼠接種嵌合病毒。接種YF/JE Nakayama或YF/JESA14-14-2的小鼠在接種后3周內沒有觀察到死亡，表明外周接種后病毒不能產生疾病癥狀。接種YF/JE SA14-14-2的小鼠產生抗JE病毒的中和抗體(圖7)。生產黃熱/登革熱(YF/DEN)嵌合病毒的cDNA模板的構建嵌合黃熱/登革熱(YF/DEN)病毒的獲得如下所述，原則上，與上述YF/JE嵌合體的構建方法相同。其它黃病毒嵌合體可以利用天然或經改造的限制性位點以及，例如，如表6所示的寡核苷酸引物，以類似方法構建。YF/DEN嵌合病毒的構建雖然已經研制出幾種登革熱病毒的分子克隆，但是還是經常遇到病毒cDNA在質粒系統中的穩定性以及回收到的病毒的復制效能的問題。我們選擇使用澳大利亞，Clayton，Monash大學，分子生物學系，Peter Wright博士研制的DEN-2克隆，因為該系統對于再生病毒相對有效，并利用了類似我們自己方法學的雙質粒系統。該DEN-2克隆的完全序列已有公開，從而促進了嵌合YF/DEN模板的構建，因為僅需要對YF克隆作少許修飾。有關步驟如下所示。
與YF5.2iv和YF/JE病毒的雙質粒系統類似，YF/DEN系統使用DEN-2包膜蛋白(E)內唯一的限制性位點作為擴增兩個質粒內的結構區(prM-E)的轉效點，所述結構區在下文被稱為YF5’3’IV/DEN(prM-E’)和YFM5.2/DEN(E’-E)(見圖5)。嵌合模板的兩個體外連接限制性位點為AatII和SphI。DEN E蛋白序列的3’部分的受體質粒為YFM5.2(NarI[+]SphI[-])。該質粒包含E/NSI連接處的NarI位點，它用于插入JE E蛋白的羧基末端。通過沉默定點誘變缺失NS5蛋白區的額外SphI位點以進一步修飾該質粒。這使得DEN-2序列可以通過簡單定向克隆由唯一SphI位點至NarI位點處插入。DEN-2cDNA的合適片段為Wright博士提供的DEN-2克隆MON310的PCR產物。PCR引物包括SphI位點旁側的5’引物和與E/NSI連接處的信號酶位點上游緊鄰的DEN-2核苷酸同源的3’引物，其由產生新位點的取代物取代信號酶位點，并且導入NarI位點。然后將得到的1170個堿基對的PCR片段導入YFM5.2(NarI[+]SphI[-])。
用嵌合PCR引物將包含prM和E蛋白氨基末端部分的DEN-2克隆的5’部分插入YF5’3’IV質粒。該嵌合引物，插入反義YF C蛋白的3’末端和DEN-2prM蛋白的5’末端，與YF5’3’IV質粒的SP6啟動子旁側的有義引物聯合用于制備771個堿基對的PCR產物，它含有代表DEN-2prM序列的20個堿基的延伸。然后該PCR產物用于引發DEN-2質粒與代表DEN-2序列1501-1522并位于SphI旁側的3’引物連接，以產生1800個堿基對的終PCR產物，該產物包括從NotI位點開始，經過SP6啟動子、YF5’非翻譯區和YF C蛋白的YF序列，該序列與DEN-2prM-E1522序列緊鄰。利用NotI和SphI位點將上述PCR產物連接到YF5’3’IV中，以產生YF5’3’IV/DEN(prM-E)質粒。其它黃病毒的嵌合模板的構建生產編碼嵌合YF/MVE、YF/SLE、YF/WN、YF/TBE病毒的全長cDNA模板的方法與上述用于YF/DEN-2系統的方法類似。表6例舉基于YF17D之嵌合病毒的制備方法的特征。表6還顯示了用于體外連接的單一限制性位點、以及用于改造C/prM和E/NSI連接的嵌合引物。這些異源黃病毒的cDNA是易于得到的(MVEDalgarno等，分子生物學雜志187309-323，1986；SLETrent等，病毒學156293-304，1987；TBEMandl等，病毒學166197-205，1988；登革熱1Mason等，病毒學161262-267，1987；登革熱2Deubel等，病毒學155365-377，1986；登革熱3Hahn等，病毒學162167-180，1988；登革熱4zhao等，病毒學15577-88，1986)。
改造其它嵌合病毒的另一種方法是通過PCR來源的限制性片段的平端連接產生C/prM連接，該限制性片段含有適應該連接的末端，以及用于導入YF5’3’IV或中間質粒例如pBS-KS(+)的合適限制性位點旁側的5’和3’末端。嵌合寡核苷酸或平端連接的應用選擇，根據有問題的病毒包膜蛋白編碼區內的單一限制性位點的可用性而改變。編碼HCV抗原的YF病毒的構建因為HCV的結構蛋白E1和E2與上述黃病毒的結構蛋白不同源，表達這些蛋白的方法包括在基因組的非必要區內插入，以便所有這些蛋白隨后可以與黃熱蛋白一起在感染細胞的病毒復制期間共表達。用于插入蛋白的目標區是NS1蛋白的N末端部分，因為病毒復制不需要完整的NS1蛋白。由于存在超過正常基因組大小(約10,000個核苷酸)的異源序列，而導致YF基因組穩定性的潛在問題，可以使用下述檢測方法。另外，上述嵌合YF/黃病毒系統中NS1的缺失也許是有利的，因為該蛋白的部分缺失可以消除對與抗NS1抗體有關的YF的免疫力，因此可以避免如果給定受體需要一種以上嵌合疫苗，或者如果YF疫苗以前已經使用過或者需要進一步使用情況下的載體免疫問題。
該方法包括在YFM5.2質粒的NS1編碼區內產生一系列框內缺失，與E末端的翻譯終止密碼子連接，并產生一系列雙IRES(內部核糖體進入位點)。一個IRES緊接終止子的下游，允許E區和NS1區之間的開放讀碼框得以表達。第二個IRES從截短的NS1蛋白開始翻譯，用于表達其余的YF非結構多蛋白。檢測這些衍生物的感染病毒的回收率，在具有最大缺失的構建體的第一個IRES處插入外源序列(例如，HCV蛋白)。這種特殊構建體也可以作為判斷是否在上述表達prM-E的YF/黃病毒嵌合體病毒中缺失NS1將影響載體-特異性免疫的基礎。
編碼E1、E2、和/或E1加E2 HCV蛋白的核苷酸的插入受NS1蛋白能夠承受的缺失大小限制。基于此，截短的HCV蛋白可以用于在修飾的YF克隆內增強穩定性。用緊接IRES之后的N-端信號序列和C末端終止密碼子改造HCV蛋白。這種構建體將使HCV蛋白進入發揮細胞分泌作用的內質網。這種構建方法如圖6所示。編碼I型基因型的HCV蛋白的質粒可以用于這種構建，例如，從華盛頓大學Charles Rice博士處獲得的HCV質粒(Grakoui等，病毒學雜志，671385-1395，1993)，他已經在加工系統中和一種有復制能力的全長HCV克隆內表達出該病毒的該區。PrM裂解缺失突變體用作候選的黃病毒減毒疫苗本發明包括的其它嵌合病毒包括防止prM裂解的突變，例如在prM裂解位點的突變。例如，目標黃病毒的感染克隆(例如登革熱、TBE、SLE等)的prM裂解位點可以經定點誘變進行突變。裂解位點的部分或所有氨基酸可以如上述缺失或取代。然后含有突變的prM-E基因的核酸片段可以利用上述方法插入黃熱病毒載體。prM缺失可以伴隨也可以不伴隨其它減毒突變，例如，E蛋白的突變，然后插入黃熱病毒。作為候選疫苗，這些突變體比單取代突變體具有優勢，因為這些突變體幾乎不可能恢復缺失序列并恢復毒性。
按照布達佩斯條約的規定，本發明的下列嵌合黃病毒由美國典型培養物保藏中心(ATCC)(Rockville，Maryland，U.S.A.)保藏，授予保藏日為1998年1月6日嵌合黃熱17D/2型登革熱病毒(YF/DEN-2；ATCC登記號為ATCC VR-2593)和嵌合黃熱17D/日本腦炎SA14-14-2病毒(YF/JE A1.3；ATCC登記號為ATCC VR-2594)。
表1.YF/JE嵌合體的特征克隆 產量 感染力 PBS RNAse DNAse(μg)噬菌斑/100ng log滴度 log滴度 log滴度LLC-MK2VERO VERO VEROYF5.2iv 5.5 15 7.2 0 7YF/JE-S 7.6 50 6.2 0 6.2YF/JE-N 760 5 0 5.4
表2.JE毒株與YF/JE嵌合體的序列比較病毒 E E E E E E E EJE 107138176177227243244 279SA14-14-2YF/JE F K V T S K G MSA14-14-2YF/JE F K V A S E G MNAKJE NAK L E l T P E E KJE SA14L E l T P E E KL E l T S E G K表3.YF/JE嵌合體的噬斑減少中和滴度病毒 無免疫 YF腹水 JE腹水 無免疫 YF IgG腹水 IgGYF5.2iv ＜1.3 3.7 ＜1.3 ＜2.2＞4.3JE SA 14-14-2＜1.3 ＜1.33.4 ＜2.2＜2.2YF/JE SA14-14-2 ＜1.3 ＜1.33.1 ＜2.2＜1.9YF/JE Nakayama ＜1.3 ＜1.33.4 ＜2.2＜2.2表4.YF/JE SA14-14-2嵌合體對3周齡雄性ICR小鼠的神經毒力log劑量I.C. ％死亡率YF5.2iv4100 (7/7)YF/JE SA 14-14-2 4 0(0/7)YF/JE SA 14-14-2 5 0(0/7)YF/JE SA 14-14-2 6 0(0/8)表5.YF/JE嵌合體對3周齡雄性ICR小鼠的神經侵入力log劑量(腹膜內) ％死亡率YF/JE Nakayama4 0(0/5)YF/JE Nakayama5 0(0/4)YF/JE Nakayama 6 0 (0/4)YF/JE SA 14-14-24 0 (0/5)YF/JE SA 14-14-25 0 (0/4)YF/JE SA 14-14-26 0 (0/4)表6.YF/黃病毒嵌合體的改造病毒 嵌合C/prM連接 嵌合E/NSI連接 5’ 3’ 刪除或(產生)連接 連接 的位點YF/WN X-cactgggagagcttgaaggtc aaagccagttgcagccgcggtttaa AatllNsil(SEQ ID NO1)(SEQ ID NO2)YF/DEN-1 X-aaggtagactggtgggctccc gatcctcagtaccaaccgcggtttaa AatllSphl Sphl in DEN(SEQ ID NO3)(SEQ ID NO4)YF/DEN-2 X-aaggtagattggtgtgcattg aaccctcagtaccacccgcggtttaa AatllSphl(SEQ ID NO5)(SEQ ID NO6)YF/DEN-3 X-aaggtgaattgaagtgctcta acccccagcaccacccgcggtttaa AatllSphl Xhol in DEN(SEQ ID NO7)(SEQ ID NO8) (Sphl in DEN)YF/DEN-4 X-aaaaggaacagttgttctcta acccgaagtgtcaaccgcggtttaa AatllNsil(SEQ ID NO9)(SEQ ID NO10)YF/SLEX-aacgtgaatagttggatagtc accgttggtcgcacccgcggtttaa AatllSphIAatll in SLE(SEQ ID NO11) (SEQ ID NO12)YF/MVEX-aatttcgaaaggtggaaggtc gaccggtgtttacagccgcggtttaa AatIIAgel(Agel in YF)(SEQ ID NO13) (SEQ ID NO14)YF/TBEX-tactgcgaacgacgttgccac actgggaacctcacccgcggtttaa AatllAgel(Agel in YF)(SEQ ID NO15) (SEQ ID NO16)1，2這兩欄分別說明用于產生嵌合YF/黃病毒引物的寡核苷酸，所述引物對應于C/prM或E/NS1連接。(見正文)。X＝YF衣殼蛋白的羧基末端編碼序列。下化線區對應NarI位點(反義--ccgcgg)上游緊鄰的目標異源序列。該位點允許PCR產物插入產生全長cDNA模板必須的Yfm5.2(NarI)質粒。其它核苷酸為異源病毒專屬的。寡核苷酸引物以5’至3’方向列出。
3，4列出用于產生限制性片段的單一限制性位點，產生的限制性片段可以體外分離和連接以制備全長嵌合cDNA模板。因為一些序列不含有滿意的位點，某些情況下對適當位點的改造是必要的(腳注5)。
5圓括號中是必須產生在YF骨架中或者異源病毒中以保證體外連接有效的限制性酶位點。不在圓括號中的位點必須除去。所有這些修飾均通過用于各自克隆的cDNA的沉默突變實現。空欄說明不需要對cDNA克隆進行修飾。
其它實施方案其它實施方案在本發明權利要求范圍內。例如，其它具有醫藥重要性的黃病毒的prM-E蛋白基因可插入黃熱疫苗病毒骨架，產生抗其它具有醫藥重要性的黃病毒的疫苗(參見，例如，Monath等，“黃病毒，”在病毒學中，Fields(編)，Raven-Lippincott，New York，1995，第1卷，961-1034)。
可以獲得的其它黃病毒(其基因可以插入本發明的嵌合載體)的實例包括例如，Kunjin，、中歐腦炎、俄羅斯春-夏腦炎、Powassan、Kyasanur森林病、和Omsk出血熱病毒。另外，甚至關系較遠的病毒的基因也可以插入黃熱疫苗病毒，用以構建新疫苗。疫苗的制備和使用本發明的疫苗可以采用本領域普通技術人員容易確定的劑量和給藥方法給藥。例如，可采用與黃熱17D疫苗同樣的方式施用和配制本發明疫苗，例如，作為感染的雞胚組織的澄清懸液，或者作為嵌合黃熱病毒感染的細胞培養物的收獲液。因此，活的、減毒嵌合病毒可以制成含100到1,000,000感染單位(例如，噬斑形成單位或組織培養感染劑量)的無菌水溶液，單劑量體積為0.1到1.0ml，通過，例如肌內、皮下、或真皮內途徑給藥。另外，因為黃病毒可以經粘膜途徑，例如口腔途徑，感染人類宿主(Gresikova等，“蜱-傳腦炎，”在《蟲媒病毒，生態學和流行病學》中，Monath(編)，CRC出版社，Boca Raton，Florida，1988，第6卷，177-203)，所以本疫苗病毒可以通過粘膜途徑給藥，以獲得保護性免疫反應。本疫苗可以作為初級預防藥物對可能存在黃病毒感染風險的成人或兒童使用。本疫苗也可以用作治療黃病毒感染病人的二級藥物，通過刺激抗黃病毒的免疫反應實現。
需要將黃熱疫苗載體系統用于免疫宿主抗一種病毒(例如，日本腦炎病毒)，以后再用不同的嵌合構建體再次免疫同樣的宿主抗第二種或第三種病毒。嵌合黃熱系統的顯著優點在于載體將不引起對其自身的強烈免疫作用。以前黃熱病毒的免疫也將不排除嵌合疫苗用作異源基因表達的載體。這些優點是因為去除了部分黃熱疫苗中編碼中和(保護性)黃熱病抗原的E基因，并用另一種不具備對黃熱病交叉保護的異源基因代替。雖然YF17D病毒的非結構蛋白可以起到保護作用，例如，通過引發抗NS1的抗體，其與補體依賴性抗體介導的感染細胞的溶解有關(Schlesinger等，免疫學雜志，1352805-2809，1985)，或者通過誘導對NS3或其它病毒蛋白的細胞毒性T細胞反應，但是看起來這些反應將不會消除活病毒疫苗刺激中和抗體的能力。這一結論由下列事實支持(1)以前感染JE病毒的個體對YF17D的免疫反應類似于以前不曾感染JE病毒的個體，(2)以前接種YF17D疫苗的個體再次免疫，表現為中和抗體滴度升高(Sweet等，美國營養學、醫學和衛生學雜志(Am.J.Trop.Med.Hyg.)11562-569，1962)。因此，嵌合載體可以對以前由于自然感染或接種疫苗而接受黃熱病毒免疫的人群使用，也可以重復使用，或者用幾種不同的構建體同步或連續免疫，上述構建體包括黃熱嵌合體，其中含有來自，例如日本腦炎、St.Lousis腦炎、或西尼羅河病毒的插入物。
應用疫苗時，可以使用本領域技術人員已知的佐劑。能夠增強嵌合疫苗免疫力的佐劑包括例如，脂質體制劑、合成佐劑，例如皂甙(例如，QS21)、胞壁酰二肽、單磷脂酰脂類A、或聚膦嗪。雖然這些佐劑通常用于增強滅活疫苗的免疫反應，但是它們也能夠用于活疫苗。當嵌合疫苗經粘膜途徑，例如經口腔途徑給藥時，例如E.coli(LT)的熱-不穩定毒素或LT的突變體衍生物等粘膜佐劑是有效的佐劑。另外，具有佐劑活性的編碼細胞因子的基因可以插入黃熱病毒載體。因此，編碼細胞因子的基因，例如GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13、或IL-5可以與異源黃病毒基因一起插入，用于制備產生增強的免疫反應的疫苗，或者用于調節更為特異性地對細胞、體液、或粘膜的免疫反應。除疫苗應用外，如同本領域的技術人員能夠容易地理解到的那樣，本發明的載體可以用于基因治療方法，用以將治療基因產物導入病人細胞。在這些方法中，編碼治療基因產物的基因插入載體，例如，代替編碼prM-E蛋白的基因。
黃熱病毒載體系統的其他優點還在于黃病毒在細胞質中復制，因此病毒復制過程與病毒基因組整合入宿主細胞無關(Chambers等，(1990)“黃病毒基因組結構、表達、和復制，”微生物學年度綜述44649-688)，并因此提供了一種重要的安全方法。
本文引證的所有參考文獻全文列入本文作為參考。序列表(1)一般資料(i)申請人OraVax，有限公司，等。(ii)發明題目嵌合黃病毒疫苗(iii)序列數16(iv)通訊地址(A)收件人Clark和Elbing LLP(B)街道176 Federal Street(C)城市Boston(D)州MA(E)國家美國(F)郵政編碼02110(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM可兼容機(C)操作系統DOS(D)軟件FastSEQ for Windows Version 2.0(vi)目前的申請資料(A)申請號(B)申請日98，3，2(C)分類號(vii)在先申請資料(A)申請號08/807,445(B)申請日1997，2，28(vii)在先申請資料(A)申請號未確定(B)申請日98，1，15(ix)代理人/代理資料(A)姓名Clark，Paul T(B)登記號30，162(C)資料/文檔號06132/033WO2(x)通訊資料(A)電話617-428-0200(B)傳真617-428-7045(C)電報(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1CACTGGGAGA GCTTGAAGGT C(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2AAAGCCAGTT GCAGCCGCGG TTTAA(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征
(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3AAGGTAGACT GGTGGGCTCC C(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GATCCTCAGT ACCAACCGCG GTTTAA(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5AAGGTAGATT GGTGTGCATT G(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO6AACCCTCAGT ACCACCCGCG GTTTAA(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7AAGGTGAATT GAAGTGCTCT A(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8ACCCCCAGCA CCACCCGCGG TTTAA(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9AAAAGGAACA GTTGTTCTCT A(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10ACCCGAAGTG TCAACCGCGG TTTAA(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11AACGTGAATA GTTGGATAGT C(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12ACCGTTGGTC GCACCCGCGG TTTAA(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO13AATTTCGAAA GGTGGAAGGT C(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO14GACCGGTGTT TACAGCCGCG GTTTAA(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO15TACTGCGAAC GACGTTGCCA C(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO16ACTGGGAACC TCACCCGCGG TTTAA
權利要求
1.嵌合活體、感染性、減毒病毒，包括黃熱病毒，其中編碼prM-E蛋白的核苷酸序列或者缺失、截短、或者突變，以至功能性黃熱病毒prM-E蛋白不能表達出來，和第二種不同黃病毒之編碼prM-E蛋白的核苷酸序列整合至所述黃熱病毒基因組，以至所述第二種黃病毒的所述prM-E蛋白得以表達。
2.權利要求1的嵌合病毒，其中所述第二種黃病毒為日本腦炎(JE)病毒。
3.權利要求1的嵌合病毒，其中所述第二種黃病毒為選自1-4型登革熱病毒中的一種登革熱病毒。
4.權利要求1的嵌合病毒，其中所述第二種黃病毒選自Murray山谷腦炎病毒、St.Louis腦炎病毒、西尼羅河病毒、蜱傳腦炎病毒、丙型肝炎病毒、Kunjin病毒、中歐腦炎病毒、俄羅斯春-夏腦炎病毒、Powassan病毒、Kyasanur森林病病毒、和Omsk出血熱病毒。
5.權利要求1的嵌合病毒，其中編碼所述第二種不同黃病毒prM-E蛋白的核苷酸序列取代編碼所述黃熱病毒prM-E蛋白的核苷酸序列。
6.權利要求1的嵌合病毒，其中編碼所述第二種不同黃病毒的所述prM-E蛋白的所述核苷酸序列包括防止prM裂解產生M蛋白的突變。
7.權利要求1的嵌合病毒，其中C/prM和E/NS1連接處的信號序列在所述嵌合黃病毒的結構中保留。
8.嵌合活體、感染性、減毒病毒在制備預防或治療黃病毒感染病人的藥物中的用途，其中嵌合的、活體、感染性、減毒病毒包括黃熱病毒，其中編碼prM-E蛋白的核苷酸序列或者缺失、截短、或者突變，以至功能性黃熱病毒prM-E蛋白不能表達出來，和編碼第二種不同黃病毒prM-E蛋白的核苷酸序列整合至所述黃熱病毒基因組，以至所述第二種黃病毒的所述prM-E蛋白得以表達。
9.權利要求8的用途，其中所連第二種黃病毒為日本腦炎(JE)病毒。
10.權利要求8的用途，其中所述第二種黃病毒為選自1-4型登革熱病毒中的一種登革熱病毒。
11.權利要求8的用途，其中所述第二種黃病毒選自Murray山谷腦炎病毒、St.Louis腦炎病毒、西尼羅河病毒、蜱傳腦炎病毒、丙型肝炎病毒、Kunjin病毒、中歐腦炎病毒、俄羅斯春-夏腦炎病毒、Powassan病毒、Kyasanur森林病病毒、和Omsk出血熱病毒。
12.權利要求8的用途，其中編碼所述第二種不同黃病毒prM-E蛋白的核苷酸序列取代編碼所述黃熱病毒prM-E蛋白的核苷酸序列。
13.權利要求8的用途，其中編碼所述第二種不同黃病毒的所述prM-E蛋白的所述核苷酸序列包括防止prM裂解產生M蛋白的突變。
14.權利要求8的用途，其中C/prM和E/NS1連接處的信號序列在所述嵌合黃病毒的結構中保留。
15.編碼嵌合活體、感染性、減毒病毒的核酸分子，所述病毒包括黃熱病毒，其中編碼prM-E蛋白的核苷酸序列或者缺失、截短、或者突變，以至功能性黃熱病毒prM-E蛋白不能表達出來，和第二種不同黃病毒編碼prM-E蛋白的核苷酸序列整合至所述黃熱病毒基因組，以至所述第二種黃病毒的所述prM-E蛋白得以表達。
16.權利要求15的核酸分子，其中所述第二種黃病毒為日本腦炎(JE)病毒。
17.權利要求15的核酸分子，其中所述第二種黃病毒為選自1-4型登蘋熱病毒中的一種登革熱病毒。
18.權利要求15的核酸分子，其中所述第二種黃病毒選自Murray山谷腦炎病毒、St.Louis腦炎病毒、西尼羅河病毒、蜱傳腦炎病毒、丙型肝炎病毒、Kunjin病毒、中歐腦炎病毒、俄羅斯春-夏腦炎病毒、Powassan病毒、Kyasanur森林病病毒、和Omsk出血熱病毒。
19.權利要求15的核酸分子，其中編碼所述第二種不同黃病毒prM-E蛋白的核苷酸序列取代編碼所述黃熱病毒prM-E蛋白的核苷酸序列。
20.權利要求15的核酸分子，其中編碼所述第二種不同黃病毒的所述prM-E蛋白的所述核苷酸序列包括防止prM裂解產生M蛋白的突變。
21.權利要求15的核酸分子，其中C/prM和E/NS1連接處的信號序列在所述嵌合黃病毒的結構中保留。
全文摘要
嵌合活體、感染性、減毒病毒,含有黃熱病毒,其中編碼prM－E蛋白的核苷酸序列或者缺失、截短、或者突變,以至功能性黃熱病毒PrM－E蛋白不能表達出來,和編碼第二種不同黃病毒PrM－E蛋白的核苷酸序列整合至所述黃熱病毒基因組,以至所述第二種黃病毒的所述prM－E蛋白得以表達。
文檔編號A61P31/12GK1253506SQ98804556
公開日2000年5月17日 申請日期1998年3月2日 優先權日1997年2月28日
發明者T·J·錢伯斯, T·P·莫納斯, F·吉拉克胡 申請人:奧拉瓦克斯公司, 圣路易斯大學