專利名稱：活性蛋白c制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類藥物領(lǐng)域，特別涉及用活性蛋白C治療血管疾病。更具體地說，本發(fā)明涉及活性人蛋白C的制劑。
背景技術(shù)：
蛋白C是絲氨酸蛋白酶和天然存在的抗凝劑，其通過在凝結(jié)級聯(lián)反應(yīng)中滅活因子Va和VIIIa而調(diào)節(jié)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。人蛋白C體內(nèi)主要在肝臟中合成，是單一的461個氨基酸的多肽。這個單鏈母體分子經(jīng)歷多個翻譯后修飾，包括1)裂解42個氨基酸信號序列；2)蛋白酶解從一個鏈酶原去除位置156處的賴氨酸殘基和位置157處的精氨酸殘基，制備成2-鏈酶原形式的分子(即通過二硫橋與含有絲氨酸蛋白酶的262個氨基酸殘基的重鏈連接的155個氨基酸殘基的輕鏈)；3)在輕鏈的前42個氨基酸中聚簇的9個谷氨酸殘基的維生素K-依賴性羧化作用，產(chǎn)生9個γ-羧基谷氨酸殘基；和4)在4個位點(一個在輕鏈中和三個在重鏈中)連接碳水化合物。重鏈含有已充分研究的Asp257，His211和Ser360絲氨酸蛋白酶三聯(lián)體。最后，成環(huán)的2-鏈酶原在鈣離子存在下在磷脂表面被凝血酶體內(nèi)激活。激活作用來自去除重鏈的N-末端處的十二肽，產(chǎn)生具有酶活性的活性蛋白C(aPC)。
除了血液凝結(jié)級聯(lián)反應(yīng)中aPC的酶活性外，aPC也可以自身降解，導(dǎo)致作為一種抗凝劑的降低的功能性。申請人發(fā)現(xiàn)了重要的降解途徑。輕鏈的N-末端的自身降解可以導(dǎo)致位置10處組氨酸殘基任一側(cè)上的切斷。這樣，該降解途徑得到兩種滅活產(chǎn)物；1)去(1-9)活性蛋白C，其中去除了輕鏈的前9個N-末端殘基；和2)去(1-10)活性蛋白C，其中去除了輕鏈的前10個N-末端殘基。該降解途徑先前沒有報道過，其由于去除位置6和7處的重要的GLA殘基而導(dǎo)致抗凝活性降低。因此，降低去(1-9)和去(1-10)活性蛋白C自身降解產(chǎn)物水平在獲得強效高純度的活性蛋白C藥物制劑中是重要的。這些變體產(chǎn)物是先前未知的降解產(chǎn)物，并且通過常規(guī)純化技術(shù)是非常難以去除的。申請人進一步發(fā)現(xiàn)在選定的一組填充劑的存在下固態(tài)溶解性明顯提高。
十分期望將溶液和凍干固態(tài)中的活性蛋白C的這樣的降解最小化。因此，這些發(fā)現(xiàn)允許制備對于健康護理從業(yè)者來說是優(yōu)良藥物的強效高純度的活性蛋白C制劑。
本發(fā)明提供基本上沒有這樣的自身降解產(chǎn)物特別是活性蛋白C的輕鏈的去(1-9)和去(1-10)形式的改進的活性蛋白C的制劑。因此，所說的制劑適合對需要它的患者給藥。
發(fā)明概述本發(fā)明提供含有活性蛋白C和選自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，蔗糖及其混合物的填充劑的穩(wěn)定凍干制劑。
本發(fā)明還提供含有大約2.5mg/ml活性蛋白C，大約15mg/ml蔗糖和大約20mg/ml氯化鈉的穩(wěn)定凍干制劑。此外，本發(fā)明提供含有大約5mg/ml活性蛋白C，大約30mg/ml蔗糖和大約38mg/ml氯化鈉的穩(wěn)定凍干制劑。
本發(fā)明還提供了制備含有活性蛋白C和選自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，蔗糖及其混合物的填充劑的制劑的方法。
本發(fā)明還提供單位劑量形式，包括含有制劑的單位劑量容器，所述制劑中重量與重量比例是大約1份活性蛋白C，大約7.6份鹽和大約6份填充劑。
本發(fā)明進一步提供治療涉及血管內(nèi)凝結(jié)的疾病狀態(tài)的方法，包括給予這里所描述的活性蛋白C的制劑。
發(fā)明詳述為了本發(fā)明目的，按照這里所公開的和權(quán)利要求書所要求的，下面的術(shù)語如下定義。
aPC或活性蛋白C指或者重組或者血漿產(chǎn)生的活性蛋白C。aPC包括和優(yōu)選是人活性蛋白C，但是aPC也可以包括具有蛋白C的蛋白水解活性，酰胺水解活性，酯水解活性和生物活性(抗凝劑或血纖維蛋白溶酶原)的其它種類或衍生物。蛋白C衍生物的例子描述于Gerlitz等美國專利5453373和Foster等美國專利5516650，其中全部內(nèi)容在這里引作參考。
APTT--激活的部分組織促凝血酶原激酶時間。
r-hPC--重組人蛋白C酶原。
r-aPC--通過體外或體內(nèi)激活蛋白C酶原或者通過從原核細胞，真核細胞或者轉(zhuǎn)基因動物直接分泌激活形式的蛋白C來制備的重組活性蛋白C，包括，例如從人腎293細胞分泌酶原后根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的和在Yan的美國專利4981952和Cottingham的WO97/20043中證明的技術(shù)純化和激活，這兩篇專利全部在此引作參考。
連續(xù)灌輸--基本上不間斷地連續(xù)將溶液灌注到血管中，灌注一段特定時間。
大丸劑注射--以確定量(稱之為大丸劑)一次注射藥物。
適合給藥--適合于作為治療劑給予的凍干的制劑或溶液。
酶原--這里所使用的蛋白C酶原指分泌的滅活形式的一條鏈或兩條鏈形式的蛋白C。
可藥用的緩沖劑--可藥用的緩沖劑是本領(lǐng)域已知的。可藥用的緩沖劑包括磷酸鈉，檸檬酸鈉，乙酸鈉或TRIS。
活性蛋白C是一種抗凝劑，具有比可得到的抗凝劑更寬的治療指數(shù)，所述可得到的抗凝劑是例如肝素和口服羥基香豆素型抗凝劑。作為一種抗凝劑，aPC對治療各種各樣的涉及血管內(nèi)凝結(jié)的獲得性病態(tài)具有深刻的影響，包括血栓形成性中風，深處靜脈血栓形成，肺栓塞，外周動脈血栓形成，來自心臟或外周動脈的栓塞，急性心肌梗死，彌散性血管內(nèi)凝結(jié)，和急性前毛細血管或后毛細血管閉塞(包括移植或視網(wǎng)膜血栓形成)。
本發(fā)明涉及活性蛋白C的制劑。期望的制劑應(yīng)該是一種由活性蛋白C和選自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，蔗糖的填充劑組成的高純度穩(wěn)定凍干產(chǎn)物。凍干產(chǎn)物用合適的稀釋劑例如無菌水或無菌鹽水重新配制。優(yōu)選地，得到的溶液具有大約5.5至大約6.5的pH。
制劑中活性蛋白C，緩沖液，鹽濃度，pH，溫度和填充劑之間的分子相互作用是復(fù)雜的，而且每一個因素對于制劑的穩(wěn)定性的作用是不可預(yù)測的。本發(fā)明凍干制劑在重新懸浮時由于減小的自身降解作用而得到穩(wěn)定的，酶激活的活性蛋白C。本發(fā)明具有特別減小水平的去(1-9)aPC和去(1-10)aPC。一般情況下，去(1-9)和去(1-10)aPC的水平小于10％的自身降解產(chǎn)物。優(yōu)選地，去(1-9)和去(1-10)aPC的水平小于8％的自身降解產(chǎn)物。更優(yōu)選地，去(1-9)和去(1-10)aPC的水平小于5％并且最優(yōu)選小于3％的自身降解產(chǎn)物。通過小心控制該過程的條件和通過加入蔗糖，海藻糖，棉子糖或甘露糖醇而獲得這種穩(wěn)定性。令人感興趣的是，其它填充劑例如羥乙基淀粉和甘氨酸不提供必需的穩(wěn)定性或藥學效果。
本發(fā)明填充劑提供一種優(yōu)良的藥物制劑，其具有均一的外觀并且當用合適的溶液重新懸浮時易于溶解。重新配制時，該制劑在室溫下穩(wěn)定達24小時至48小時。得到先前沒有獲得的穩(wěn)定性。
活性蛋白C的制劑中優(yōu)選的填充劑是蔗糖，海藻糖和棉子糖。更優(yōu)選的填充劑是蔗糖和棉子糖，最優(yōu)選的填充劑是蔗糖。制劑中填充劑的量是以重量對重量為基礎(chǔ)1份aPC對1-10份填充劑。此外，制劑中填充劑的濃度是冷凍干燥過程中重要的制劑變量。填充劑的最佳濃度取決于aPC的量和所選擇的填充劑的種類。冷凍溶液中蔗糖優(yōu)選的濃度是10-40mg/ml。蔗糖更優(yōu)選的濃度是15-30mg/ml。2.5mg/ml aPC的制劑中冷凍溶液的蔗糖最優(yōu)選的濃度是15mg/ml。 5.0mg/ml aPC的制劑中冷凍溶液的蔗糖最優(yōu)選的濃度是30mg/ml。所要求的活性蛋白C的制劑中填充劑的存在提供提高的化學和物理穩(wěn)定性。
冷凍干燥之前和重配時，優(yōu)選將pH保持在5.5-6.5范圍內(nèi)以使溶液狀態(tài)自身降解作用最小。制劑的優(yōu)選的pH是大約5.6和大約6.4之間的pH。更優(yōu)選的是大約5.7和大約6.3之間的pH。更優(yōu)選的是大約5.8和大約6.2之間的pH。還更優(yōu)選的是大約5.9和大約6.1之間的pH。最優(yōu)選的pH是大約pH6.0。
為了保持有效的pH控制，aPC溶液應(yīng)該含有可藥用的緩沖劑。因此，冷凍-干燥時，制劑任選地和優(yōu)選地含有可藥用的緩沖劑。代表性緩沖劑體系包括Tris-乙酸鹽，檸檬酸鈉和磷酸鈉。更優(yōu)選的緩沖劑體系包括檸檬酸鈉和磷酸鈉，最優(yōu)選的緩沖劑是檸檬酸鈉。緩沖劑體系優(yōu)選的摩爾濃度是10mM-50mM。緩沖劑體系更優(yōu)選的摩爾濃度是10mM-20mM。最優(yōu)選的摩爾濃度是40mM。技術(shù)人員會認識到很多其它緩沖劑體系是可得到的，其也可以在本發(fā)明制劑中使用。
類似地，在冷凍干燥期間和重配之時，離子強度是保證溶液態(tài)穩(wěn)定性的關(guān)鍵變量。離子強度一般通過溶液的鹽濃度確定。一般使用可藥用的鹽來產(chǎn)生離子強度，包括但不限于氯化鉀(KCl)和氯化鈉(NaCl)。本發(fā)明中優(yōu)選的鹽是氯化鈉。冷凍-干燥期間，鹽濃度必須足夠高以在冷凍-干燥周期的冷凍步驟中引起鹽的結(jié)晶。優(yōu)選地，氯化鈉濃度大于150mM，更優(yōu)選地，冷凍溶液中氯化鈉濃度在150mM-1000mM之間。對于含有2.5mg/ml aPC的制劑，冷凍溶液中更優(yōu)選的氯化鈉濃度在150mM-650mM之間。冷凍溶液中還更優(yōu)選的氯化鈉濃度在250mM-450mM之間。冷凍溶液中還更優(yōu)選的氯化鈉濃度在300mM-400mM之間。對于含有2.5mg/ml aPC的制劑，冷凍溶液中最優(yōu)選的氯化鈉濃度是325mM。
類似地，對于含有5.0mg/ml aPC的制劑，冷凍溶液中更優(yōu)選的氯化鈉濃度在150mM-1000mM之間。冷凍溶液中還更優(yōu)選的氯化鈉濃度在250mM-750mM之間。冷凍溶液中還更優(yōu)選的氯化鈉濃度在400mM-700mM之間。對于含有5.0mg/ml aPC的制劑，冷凍溶液中最優(yōu)選的氯化鈉濃度是650mM。
aPC∶鹽∶填充劑(w∶w∶w)的比例是適合冷凍干燥過程的制劑中重要的因素。該比例根據(jù)aPC的濃度，選擇的鹽和濃度和選擇的填充劑和濃度而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本領(lǐng)域熟知的和例如實施例1中描述的技術(shù)容易確定優(yōu)選的aPC∶鹽∶填充劑比例。特別地，1份活性蛋白C與大約7-8份鹽與大約5-7份填充劑的重量比是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是1份活性蛋白C與大約7.5-8份鹽與大約5.5-6.5份填充劑的重量比。最優(yōu)選的是大約1份活性蛋白C與大約7.6份鹽與大約6份填充劑的重量比。
優(yōu)選的鹽是325mM(對于含有2.5mg/ml aPC的制劑)和650mM(對于含有5.0mg/ml aPC的制劑)的氯化鈉，與蔗糖(w∶w)的比例大約是1.3∶1該濃度足夠高以引起鹽在冷凍過程中結(jié)晶，最可能產(chǎn)生可以被凍干的aPC，蔗糖和檸檬酸鹽的非晶形混合物。因此，325mM和650mM優(yōu)選濃度時氯化鈉的離子強度在冷凍-干燥過程中給予制劑以穩(wěn)定性。
本發(fā)明進一步提供制備穩(wěn)定凍干制劑的方法，包括凍干含有活性蛋白C和選自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，蔗糖及其混合物的填充劑的溶液。本發(fā)明還提供制備穩(wěn)定凍干制劑的方法，包括凍干含有大約2.5mg/ml活性蛋白C，大約15mg/ml蔗糖，大約19mg/ml氯化鈉，和具有大于5.5但是小于6.5的pH的檸檬酸鈉緩沖劑的溶液。此外，本發(fā)明提供制備穩(wěn)定凍干制劑的方法，包括凍干含有大約5mg/ml活性蛋白C，大約30mg/ml蔗糖，大約38mg/ml氯化鈉，和具有大于5.5但是小于6.5的pH的檸檬酸鹽緩沖劑的溶液。
本發(fā)明提供單位劑量形式，包括裝有含有活性蛋白C和選自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，蔗糖及其混合物的填充劑的穩(wěn)定凍干制劑的單位劑量容器。此外，本發(fā)明提供治療涉及血管內(nèi)凝結(jié)的疾病狀態(tài)的方法，包括給予所述制劑。
aPC優(yōu)選腸胃外給藥以保證其以有效形式送遞到血液中，給藥方式是以合適劑量連續(xù)灌輸大約1至大約48小時。給予aPC的量是大約0.01mg/kg/hr至大約0.05mg/kg/hr。或者，aPC通過以下方式給藥作為大丸劑注射，經(jīng)大約5分鐘至大約30分鐘每小時注射一部分合適的劑量，接著以合適的劑量連續(xù)灌注大約23小時至大約47小時，這導(dǎo)致經(jīng)24小時至48小時給予合適的劑量。
下面的實施例將幫助描述怎樣實施本發(fā)明，并且將詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明范圍不僅由下面的實施例組成。
制備1制備人蛋白C重組人蛋白C(r-hPC)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)在人腎臟293細胞中產(chǎn)生，例如在Yan的美國專利4981952中提出的那些技術(shù)，該專利在這里全文引作參考。Bang等的美國專利4775624中公開了編碼人蛋白C的基因并要求專利保護，該專利在這里全文引作參考。用來在293細胞中表達人蛋白C的質(zhì)粒是質(zhì)粒pLPC，其在Bang等的美國專利4992373中公開，該專利在這里全文引作參考。質(zhì)粒pLPC的構(gòu)建也描述于歐洲專利申請No.0445939，和Grinnell等，1987，生物/技術(shù)(Bio/Technology)51189-1192，其全文也在這里引作參考。簡而言之，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細胞中，然后鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)化物，在沒有血清的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。發(fā)酵后，通過微量過濾獲得沒有細胞的培養(yǎng)基。
通過改進的Yan的美國專利4981952的技術(shù)從培養(yǎng)液中分離人蛋白C。在吸附陰離子交換樹脂(Fast-Flow Q，Pharmacia)之前澄清的培養(yǎng)基制成4mM EDTA溶液。用4倍柱體積的20mM Tris，200mM NaCl，pH7.4和2倍柱體積的20mM Tris，150mM NaCl，pH7.4洗滌后，用20mM Tris，150mM NaCl，10mM CaCl2，pH7.4洗脫結(jié)合的重組人蛋白C酶原。根據(jù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定洗脫后洗脫的蛋白質(zhì)純度大于95％。
蛋白質(zhì)的進一步純化如下制備氯化鈉中的3M蛋白質(zhì)溶液，接著吸附在20mM Tris，3M NaCl，10mM CaCl2，pH7.4中平衡過的疏水性相互作用樹脂(Toyopearl Phenyl 650M，TosoHaas)。用2倍柱體積無CaCl2的平衡緩沖液洗滌后，用20mM Tris，pH7.4洗脫重組人蛋白C。
通過去除殘留的鈣制備洗脫過的蛋白質(zhì)用于激活。重組人蛋白C流經(jīng)金屬親和性柱(Chelex-100，BioRad)去除鈣并且再次結(jié)合陰離子交換劑(Fast FlowQ，Pharmacia)。這兩個柱子順序排列并且在20mMTris，150mM NaCl，5mM EDTA，pH7.4中平衡。負載蛋白質(zhì)后，在其從系列中分離之前用1倍柱體積的相同緩沖液洗滌Chelex-100柱。在用0.4M NaCl，20mM Tris-乙酸鹽，pH6.5洗脫蛋白質(zhì)之前用3倍柱體積的平衡緩沖液洗滌陰離子交換柱。通過UV280nm測定重組人蛋白C和重組活性蛋白C溶液的蛋白質(zhì)濃度，消光系數(shù)分別是E0.1％＝1.81或1.85。
制備2重組人蛋白C的激活在50mM HEPES，pH7.5存在下，在4℃下，牛凝血酶偶聯(lián)至活化的CH-Sepharose4B(Pharmacia)上。偶聯(lián)反應(yīng)使用大約5000單位凝血酶/ml樹脂在已經(jīng)裝入柱子中的樹脂上進行。在將2-氨基-乙醇(MEA)加入到0.6ml/L循環(huán)溶液的濃度之前，凝血酶溶液循環(huán)通過柱子大約3小時。含有MEA的溶液循環(huán)另外10-12小時以保證完全封閉樹脂上未反應(yīng)的胺。封閉后，用10倍柱體積的1M NaCl， 20mM Tris，pH6.5洗滌偶聯(lián)凝血酶的樹脂，以去除所有沒有特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，并且在活化緩沖液中平衡之后在激活反應(yīng)中使用。
純化的r-hPC制備成5mM EDTA溶液(以螯合所有的殘余鈣)并且用20mM Tris，pH7.4或20mM Tris-乙酸鹽，pH6.5稀釋到2mg/ml的濃度。該材料流經(jīng)在37℃下用50mM氯化鈉和20mM Tris，pH7.4或20mMTris-乙酸鹽，pH6.5平衡過的凝血酶柱子。調(diào)節(jié)流速，使r-hPC和凝血酶樹脂之間接觸時間是大約20分鐘。收集洗脫液并且立即測定酰胺水解活性。如果該材料不具有與現(xiàn)有aPC標準相當?shù)谋然?酰胺水解)，則其再循環(huán)經(jīng)過凝血酶柱完成r-hPC激活。接著用如上所述的pH是7.4或6.5的20mM緩沖液以1∶1稀釋該材料來保持aPC低濃度，同時其等待下面的處理步驟。
從aPC材料中去除淋洗的凝血酶通過使aPC結(jié)合于在含有150mM氯化鈉的活化緩沖液(20mM Tris，pH7.4或20mM Tris-乙酸鹽，pH6.5)中平衡過的陰離子交換樹脂(Fast Flow Q，Pharmacia)上來完成。凝血酶在這些條件下不與陰離子交換樹脂相互作用，而是通過該柱子進入樣品用洗出物。一旦aPC負載到柱子上，用20mM平衡緩沖液進行2-6倍柱體積洗滌，然后使用0.4M NaCl，5mM Tris-乙酸鹽，pH6.5或20mM Tris，pH7.4分步洗脫來洗脫結(jié)合的aPC。用大體積洗脫柱子有利于更完全去除十二肽。從該柱子上洗脫下來的材料或者貯存在冷凍的溶液中(-20℃)或者作為凍干粉末。
活性蛋白C的抗凝劑活性通過測定激活部分組織促凝血酶原激酶時間(APTT)凝結(jié)測試中的凝結(jié)時間來測定。在蛋白質(zhì)濃度125-1000ng/ml范圍內(nèi)在稀釋緩沖液(1mg/ml放射免疫測試級別牛血清白蛋白[BSA]，20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，0.02％NaN3)中制備標準曲線，同時將樣品制備成在該濃度范圍內(nèi)的幾個稀釋度。向每一個樣品杯加入50μL冷的馬血漿和50μL重配的活化部分組織促凝血酶原激酶時間試劑(APTT試劑，Sigma)并且在37℃下溫育5分鐘。溫育后，向各個杯中加入50μL合適的樣品或標樣。稀釋緩沖液代替樣品或標樣使用來測定基礎(chǔ)凝結(jié)時間。向每一個樣品或標樣加入50μL 37℃30mMCaCl2后立即啟動纖維測量器(CoA Screener HemostasisAnalyzer，American Labor)的定時器。從標準曲線的線性回歸等式計算樣品中活性蛋白C的濃度。這里所報告的凝結(jié)時間是三次重復(fù)最小值的平均值，包括標準曲線樣品。
實施例1活性蛋白C制劑如制備1和2所述制備人活性蛋白C。為了在常規(guī)冷凍干燥器中處理而分析活性蛋白C制劑。使用冷凍干燥顯微術(shù)和差示掃描量熱器(DSC)來測定兩個參數(shù)，這兩個參數(shù)確定制劑是否可以在常規(guī)冷凍干燥器中處理。冷凍干燥顯微術(shù)可用于確定要凍干的冷凍溶液的萎陷溫度。DSC可用于確定冷凍溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg’)。萎陷和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度特別有助于預(yù)測可以在冷凍-干燥過程中安全使用的溫度上限。冷凍干燥顯微術(shù)的結(jié)果是對DSC獲得的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg’的補充。高于-40℃的萎陷溫度對于要在常規(guī)冷凍干燥器中處理的樣品最好。
表1aPC制劑基質(zhì)的冷凍干燥處理
aPC與蔗糖與氯化鈉(在10或20mM檸檬酸鹽緩沖液中)的比例是影響萎陷和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的重要制劑變量。在常規(guī)冷凍干燥器中處理，氯化鈉濃度一定要足夠高(優(yōu)選對于2.5mg/ml aPC是325mM和對于5mg/ml aPC制劑是650mM)以在冷凍干燥處理的冷凍部分期間引起氯化鈉結(jié)晶出來。aPC的制劑可以在常規(guī)冷凍干燥器中處理，產(chǎn)生按重量計由1份aPC，6份蔗糖和7.6份氯化鈉組成的凍干產(chǎn)物。
實施例2含有不同填充劑的產(chǎn)物制劑中aPC的穩(wěn)定性制備aPC的制劑來研究各種填充劑對分子穩(wěn)定性的影響。一共向不含有鹽的磷酸緩沖液中的aPC加入六種賦形劑。這些填充劑是甘氨酸，甘露糖醇，蔗糖，海藻糖，棉子糖和羥乙基淀粉(HES)。aPC在沒有鹽，沒有填充劑的磷酸鹽制劑(“對照”)中的穩(wěn)定性與在填充劑制劑中的相當。樣品在50℃，40℃和25℃貯存不同時間。來自這些樣品的分析數(shù)據(jù)與初始值(時間＝0)相比較。使用APTT勢能，大小排阻-高效液相色譜(SE-HPLC)，SDS-PAGE，和蛋白質(zhì)含量測定來評價制劑的物理和化學穩(wěn)定性。
通過將aPC溶解于磷酸鹽緩沖液中達到5mg/ml來制備aPC制劑。以6∶1(填充劑與aPC)的比例或者30mg/ml的濃度向aPC溶液的部分加入填充劑。樣品凍干成5mg aPC/瓶。
這些制劑在50℃下穩(wěn)定14和28天；40℃是28天，48天和6個月；25℃是6和12個月。對于各個時間點，作為分開的樣品獨立地分析兩小瓶各個制劑，并且來自這些樣品的數(shù)據(jù)與來自初始值(時間＝0)的數(shù)據(jù)相比較。分析包括aPC勢能(APTT)，SDS-PAGE，aPC單體的百分含量，和蛋白質(zhì)含量。

對于所有樣品經(jīng)歷一年穩(wěn)定期在pH，顏色，包裝特征和物理外觀上沒有明顯變化。當用APTT和SE-HPLC方法分析時，當與對照相比較時，HES和甘氨酸制劑具有較小物理穩(wěn)定性(通過聚集)和化學穩(wěn)定性(勢能)。甘露糖醇制劑提供比對照略好的物理和化學穩(wěn)定性，剩下蔗糖，海藻糖和棉子糖制劑，與對照相比，都表現(xiàn)出更優(yōu)越的物理和化學穩(wěn)定性。因此，甘露糖醇，蔗糖，海藻糖和棉子糖作為aPC制劑中的填充劑，當與沒有填充劑的aPC制劑或者甘氨酸或HES制劑相比較時，具有更高的化學和物理穩(wěn)定性。
實施例3重組人活性蛋白C的穩(wěn)定性將兩批重組人活性蛋白C(aPC)的凍干制劑在40℃/75％相對濕度下貯存一個月，然后分析可能的降解作用。在用無菌水重配和室溫下貯存72小時后再次檢測aPC的穩(wěn)定性。凍干的aPC產(chǎn)物每瓶由10mgaPC，60mg蔗糖，76mg氯化鈉和15.1mg檸檬酸鹽組成。當在40℃/75％相對濕度下貯存時，該制劑中的aPC在干燥狀態(tài)下穩(wěn)定至少一個月，當在室溫下貯存時在溶液中穩(wěn)定24小時。
使用每瓶10mg aPC，60mg蔗糖，76mg氯化鈉和15.1mg檸檬酸鹽的相同單位配方制備兩批。兩批凍干的aPC在40℃/75％相對濕度下貯存一個月，并且使用APTT勢能測定，用于aPC肽定量的離子配對HPLC和用于蛋白質(zhì)變體形式定量的質(zhì)譜監(jiān)測aPC的穩(wěn)定性。一批還用無菌水重配成1mg/ml aPC，并且置于室溫下。使用APTT和質(zhì)譜方法在0，1，4，8，24，48和72小時監(jiān)測溶液中aPC的穩(wěn)定性。
在40℃/75％相對濕度下在干燥狀態(tài)中貯存一個月后沒有aPC活性的損失和不明顯量的分子結(jié)構(gòu)降解。該制劑中的aPC在重配后在1mg/ml穩(wěn)定達24小時。
權(quán)利要求
1.一種含有活性蛋白C和選自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，和蔗糖，及其混合物的填充劑的穩(wěn)定凍干制劑。
2.權(quán)利要求1的制劑，其中填充劑是蔗糖，海藻糖或棉子糖。
3.權(quán)利要求2的制劑，其中填充劑是蔗糖或棉子糖。
4.權(quán)利要求3的制劑，其中填充劑是蔗糖。
5.權(quán)利要求1的制劑，其進一步含有可藥用的鹽。
6.權(quán)利要求5的制劑，其中重量比是大約1份活性蛋白C，大約7-8份鹽和大約5-7份填充劑。
7.權(quán)利要求6的制劑，其中重量比是大約1份活性蛋白C，大約7.2-7.8份鹽和大約5.5-6.5份填充劑。
8.權(quán)利要求7的制劑，其中重量比是大約1份活性蛋白C，大約7.6份鹽和大約6份填充劑。
9.權(quán)利要求8的制劑，其中鹽是氯化鈉。
10.權(quán)利要求9的制劑，其中填充劑是蔗糖。
11.權(quán)利要求1的制劑，其進一步含有可藥用的緩沖劑。
12.權(quán)利要求11的制劑，其中所述緩沖劑選自Tris-乙酸鹽，檸檬酸鈉，或磷酸鈉。
13.權(quán)利要求12的可藥用的緩沖劑，其中所述緩沖劑是檸檬酸鈉。
14.一種含有大約2.5mg/ml活性蛋白C，大約15mg/ml蔗糖，和大約20mg/ml氯化鈉的穩(wěn)定凍干制劑。
15.一種含有大約5mg/ml活性蛋白C，大約30mg/ml蔗糖，和大約38mg/ml氯化鈉的穩(wěn)定凍干制劑。
16.一種制備權(quán)利要求1的制劑的方法，包括凍干含有活性蛋白C和選自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，和蔗糖，及其混合物的填充劑的溶液。
17.權(quán)利要求16的方法，其中填充劑是蔗糖，海藻糖或棉子糖。
18.權(quán)利要求17的方法，其中填充劑是蔗糖或棉子糖。
19.權(quán)利要求18的制劑，其中填充劑是蔗糖。
20.權(quán)利要求16的方法，其進一步含有可藥用的鹽。
21.權(quán)利要求20的方法，其中重量比是大約1份活性蛋白C，大約7-8份鹽和大約5-7份填充劑。
22.權(quán)利要求21的方法，其中重量比是大約1份活性蛋白C，大約7.2-7.8份鹽和大約5.5-6.5份填充劑。
23.權(quán)利要求22的方法，其中重量比是大約1份活性蛋白C，大約7.6份鹽和大約6份填充劑。
24.權(quán)利要求16的方法，其中溶液的pH是在5.5-6.5之間。
25.權(quán)利要求24的方法，其中pH是大約5.8-6.2。
26.權(quán)利要求25的方法，其中pH是大約6.0。
27.一種制備穩(wěn)定凍干制劑的方法，包括凍干含有大約2.5mg/ml活性蛋白C，大約15mg/ml蔗糖，大約20mg/ml氯化鈉和檸檬酸鹽緩沖劑的溶液，所述溶液具有大于5.8但是小于6.2的pH。
28.一種制備穩(wěn)定凍干制劑的方法，包括凍干含有大約5mg/ml活性蛋白C，大約30mg/ml蔗糖，大約38mg/ml氯化鈉和檸檬酸鹽緩沖劑的溶液，所述溶液具有大于5.8但是小于6.2的pH。
29.包括含有權(quán)利要求1的制劑的一個單位劑量容器的單位劑量形式。
30.包括含有權(quán)利要求8的制劑的一個單位劑量容器的單位劑量形式。
31.治療涉及血管內(nèi)凝結(jié)的獲得性疾病狀態(tài)的方法，包括對需要它的患者給予權(quán)利要求1的制劑。
32.治療涉及血管內(nèi)凝結(jié)的獲得性疾病狀態(tài)的方法，包括對需要它的患者給藥權(quán)利要求14的制劑。
33.治療涉及血管內(nèi)凝結(jié)的獲得性疾病狀態(tài)的方法，包括對需要它的患者給予權(quán)利要求15的制劑。
34.權(quán)利要求1至12中任一項的穩(wěn)定凍干制劑作為治療涉及血管內(nèi)凝結(jié)的疾病狀態(tài)的藥物的用途。
35.權(quán)利要求1至12中任一項的穩(wěn)定凍干制劑作為治療血栓形成性中風的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及活性蛋白C的藥物制劑,其還含有蔗糖,氯化鈉和pH在大約5.5和大約6.5之間的檸檬酸鈉緩沖液。本發(fā)明活性蛋白C制劑比活性蛋白C的其它制劑更穩(wěn)定,并且長時間放置降解產(chǎn)物更少。
文檔編號A61K31/715GK1254284SQ98804567
公開日2000年5月24日 申請日期1998年4月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月28日
發(fā)明者A·D·卡爾森, T·A·舍利加 申請人:伊萊利利公司