專利名稱：美容用皮膚調理組合物的制作方法
技術領域：
本發明領域通過將含有水楊氧基α-羧酸的美容用組合物局部施用到皮膚上以調理人體皮膚的美容方法及組合物。
本發明背景各種可改善皮膚外表的美容用產品越來越受到消費者的喜愛。通常消費者尋求緩和或推遲老化或光致老化皮膚的跡象，如細小的條紋和皺紋、干燥和下垂的皮膚。除了抗老化之外，消費者也通常尋求其它的益處。一種常見的、不受歡迎的皮膚狀況是“油性皮膚”，此狀況是由于皮膚上存在過量的皮脂所致。皮脂是通過皮脂細胞(sebocyte)(皮膚中皮脂腺的細胞)所產生然后分泌到皮膚表面的皮膚油性物。油性皮膚與發亮的、不合需要的外表及不愉快的觸覺有關。油性皮膚影響著各種年齡組。因而，無論從生產商還是從消費者的觀點出發都急需能同時提供抗老化又能控制皮脂的各種美容用活性物。
美國專利2,116,347(Grether等人)描述了水楊氧基羧酸酯用于外部治療風濕病。Grether的化合物與此處所用的水楊氧基α-羧酸的不同之處至少在于專利2,116,347的化合物含有一個替代末端羧基的酯基。因此Grether的化合物含有兩個酯鍵，而包括在本發明中的化合物則僅含有一個酯鍵。
PCT申請WO 93/10755報道將水楊酸用作一種有效的抗皺紋劑。Leveque等人的美國專利5,262,407報道將環酰化的水楊酸用來治療皮膚老化。在日本專利4036238(Takasago Perfumery KK)中已經報道過環酰化的水楊酸用于治療尋常痤瘡。Van Scott和Yu在一系列的專利(例如參見美國專利5,091,171)中描述了α-含氧酸的各種抗老化功能，包括去除細小的條紋及皺紋。歐洲專利申請0676194(RousselUclaf)公開了采用美容用組合物用于解決皮膚老化的問題，這些組合物含有α-含氧酸(如乳酸)或其酯和水楊酸或其酯。公開于EP0676194中的水楊酸酯為非環狀酯化的烷基酯，也即水楊酸通過一個酯鍵共價鍵合到烷基鏈上。
沒有一個上述先有技術公開包括在本發明中的水楊氧基α-羧酸。水楊氧基α-羧酸為水楊酸通過一個酯鍵共價鍵合到帶有一個酸性官能度的基團上。作為本發明的一部分，我們發現當分別使用α-羥基羧酸(如乳酸)或水楊酸時不能顯著降低皮脂的分泌，而用于本發明中的水楊氧基α-羧酸則可使皮脂分泌有明顯的降低。此外，比起使用水楊酸和α-羥基羧酸的物理混合物來講，使用水楊氧基α-羧酸更具有優點。水楊氧基α-羧酸更易于配制，因比起單一分子的水楊氧基α-羧酸來α-羥基羧酸和水楊酸分別具有更多的不相容性。
本發明概要因此，本發明的第一方面包括一種皮膚調理組合物，它包含(a)0.0001-20％(重量)下式I的水楊氧基α-羧酸
其中R為氫或含有1-16個碳原子的烷基基團，M為氫或選自堿金屬或堿土金屬的金屬陽離子；和(b)美容上可接受的載體。
本發明也包括通過將一種在美容上可接受的載體中包含水楊氧基α-羧酸的組合物施用到皮膚上從而控制或防止出現油性皮膚狀況(尤其在面部區域)的美容方法。
本發明還包括通過將本發明的組合物施用到皮膚上從而減少、防止或控制皮脂細胞分泌皮脂的美容方法。
本發明還包括通過將本發明的組合物施用到皮膚上從而促進經皮膚中的成纖維細胞進行的膠原蛋白和糖胺聚糖的合成的美容方法。
本發明還包括通過將本發明的組合物施用到皮膚上從而使皮膚顏色變淡(lightening)或去除老年斑的美容方法。
本發明還包括通過將本發明的組合物施用到皮膚上從而治療或推遲chronoaged、光致老化、干燥、條紋或皺紋的皮膚，使皮膚不受有害的UVA和UVB光線的傷害(防曬)，提高角質層的牢固性及柔韌性，并通常提高皮膚的質量的美容方法。
本發明的方法和組合物提供了對來自皮脂細胞的皮脂分泌的控制，改善的油性控制和改善的皮膚感覺，防止出現發亮及粘著現象，同時還提供抗老化的功能，減少出現皺紋和老化的皮膚、改善皮膚顏色、治療光致老化的皮膚、改善皮膚的光亮度和透明度及光潔度，以及總體健康及年輕的皮膚外表。本發明詳述水楊氧基α-羧酸具有以下通式I
其中R為氫或含有1-16個碳原子的烷基基團，M為氫或選自堿金屬或堿土金屬的金屬陽離子。此處我們將式I的化合物統稱為“酸”，雖然也包括各種鹽。
優選的化合物具有含有1-2個碳原子的R＝烷基鏈，M＝氫、鈉或鉀。
在最優選的化合物中，R＝CH3，和M＝氫或鈉或鉀(也可將此化合物稱為“水楊氧基α-丙酸”)。
通過包括以下各種步驟的方法可制備式I的化合物(a)用水楊酸鹽(堿金屬或堿土金屬鹽，由于水楊酸鈉易得，故優選鈉)使下式II的化合物酰化
其中X為鹵原子，R1為任何可通過氫化作用除去的保護基(在該步驟的下一步)，得到下式III的化合物
(b)使式III的化合物進行氫化作用，得到式I的化合物。
水楊酸鹽具有下式IV
其中M1為堿金屬或堿土金屬。
該過程的第一步(步驟(a))是一個酰化反應，在本領域技術人員所公知的條件下進行。通常式II化合物與水楊酸鹽(式IV)的摩爾比為1∶1-1∶2、優選比率為1∶1。反應通常在非質子傳遞極性溶劑(如丙酮、丁酮、乙酸乙酯，最優選為丁酮，因它具有較高的沸點，因而使反應進行得更快)中進行。優選反應在催化劑(如碘化物堿土金屬鹽，最優選為碘化鉀)的存在下進行。反應在50-100℃、最優選在70-80℃的溫度下進行。在式II的化合物中，X為任何鹵原子，優選為溴，因溴是一種較好的親電子試劑，并且α-溴羧酸(制備式II的原料化合物之一)更容易購得。R1為任何可通過氫化作用除去的保護基，優選選自芐基、取代的芐基，如用甲氧基取代的芐基、芐氧基甲基、苯甲酰甲基和二苯基甲烷。
在該過程的第二步中使式III的化合物進行氫化作用，獲得本發明的式I化合物。氫化反應的條件對于本領域技術人員而言是眾所周知的。優選反應在50-200psi、最優選在50-100psi和40-80℃、優選50-70℃下進行。反應在鈀炭催化劑的存在下進行。本發明方法得到本發明式I的化合物。副產物(取決于保護基R1)可在大氣壓或減壓下通過蒸發作用得以去除。本發明式I化合物的收率通常為25-65％(重量)。
式II的化合物可以各種方式進行制備，這取決于保護基R1。因此，式II的化合物可通過以下步驟進行制備(i)采用選自芐醇或甲氧基取代的芐醇的化合物對α-鹵代羧酸進行酯化以獲得式II的化合物，其中R1為芐基或取代的芐基；(ii)采用芐基氯代甲基醚對α-鹵代羧酸進行酯化以獲得式II的化合物，其中R1為芐氧基甲基；(iii)采用苯甲酰甲基溴對α-鹵代羧酸進行酯化以獲得式II的化合物，其中R1為苯甲酰甲基；和(iv)采用二苯基甲醇對α-鹵代羧酸進行酯化以獲得式II的化合物，其中R1為二苯基甲烷。
優選的式II化合物具有R1＝芐基。因此，優選在二環己基碳二亞胺(DCC)的存在下采用芐醇對α-鹵代羧酸、優選為α-溴代羧酸(因溴是最佳的離去基團)進行酯化。該反應優選在惰性氣體氣氛(氮氣或氬氣)中、在非極性非質子傳遞溶劑(如鹵化的溶劑，烴溶劑即氯仿、甲基氯、四氯化碳，各種醚即乙醚、二甲苯、己烷、庚烷)中進行。α-溴代羧酸與芐醇與DCC的摩爾比為2∶1∶2-1∶1∶1、優選為1∶1∶1。優選反應在催化劑(如二甲基氨基吡啶)的存在下進行。反應優選在10-25℃、最優選在20-25℃的溫度下進行。反應優選在環境壓力下進行。
將水楊氧基α-羧酸以0.0001-20％的量摻入到本發明的組合物中，為了以最小的代價得到最大的效果，優選其量為0.01-12％、最優選為0.1-8％。美容上可接受的載體根據本發明的組合物也包括對于組合物中的水楊氧基α-羧酸而言起稀釋劑、分散劑或載體作用的美容上可接受的載體，以使當將組合物施用到皮膚時便利于其分布。
非水或除了水之外的載體可包括液態或固態潤膚劑、溶劑、濕潤劑、增稠劑和粉末。一種特別優選的非水載體為聚二甲基硅氧烷和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本發明的硅氧烷可以是那些在25℃下粘度為約10-10,000,000毫米2/秒(厘泊)的硅氧烷。特別合乎需要的是低粘度硅氧烷和高粘度硅氧烷的混合物。這些硅氧烷可從GeneralElectric Company中以Vicasil、SE和SF的商標以及從Dow CorningCompany以200和550系列購得。可用于本發明組合物中的硅氧烷的量為組合物的5-95％(重量)、優選為25-90％(重量)。
美容上可接受的載體的量通常為組合物的5-99.9％(重量)、優選為25-80％(重量)，并且可在沒有其它美容用添加劑的情況下形成組合物的其余部分。優選所述載體至少有80％(重量)的水。優選水的量至少為本發明組合物的50％(重量)、最優選為本發明組合物的60-80％(重量)。優選的組合物為含有至少60％、優選至少80％水的水包油乳狀液。任選的皮膚功能材料和美容用添加劑雖然水楊氧基α-羧酸具有防曬的官能度(因它是水楊酸鹽衍生物)，但本發明的組合物優選包括另外的防曬成分以進一步降低皮膚暴露于有害的UV射線。
防曬成分包括那些通常用于阻擋紫外光的物質。說明性的化合物為PABA的衍生物、肉桂酸酯和水楊酸酯的衍生物(而不是水楊氧基α-羧酸)。例如，可用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮(也即我們所知的羥基甲氧基二苯甲酮)。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮分別可以Parsol MCX和Benzophenone-3的商標購得。在乳狀液中所用的防曬成分的具體數量取決于所需避開太陽UV輻射的程度。
也可包括另外的皮膚變淡成分，如煙酰胺、曲酸、熊果苷、維生素C，其量為0.0001-20％。
油性材料可與潤膚劑一起存在以提供一種油包水的乳狀液或水包油的乳狀液，大部分取決于所用潤膚劑的平均親水親油平衡(HLB)。這些潤膚劑的量可為總組合物的約0.5％(重量)-約50％(重量)、優選為約5％-30％(重量)。可將潤膚劑按通用的化學分類分為酯、脂肪酸和醇、多元醇和烴。
酯可以是一酯或二酯。脂肪酸二酯的可接受例子包括己二酸二丁酯、癸二酸二乙酯、diisopropyl dimerate和琥珀酸二辛酯。可接受的支鏈脂肪酸酯包括2-乙基-己基肉豆蔻酸酯、硬脂酸異丙酯和棕櫚酸異硬脂基酯。可接受的三元酸酯包括三亞油酸三異丙酯和檸檬酸三月桂酯。可接受的直鏈脂肪酸酯包括棕櫚酸月桂酯、乳酸肉豆蔻酯、oleyl eurcate和油酸硬脂酯。優選的酯包括可可-辛酸酯/癸酸酯(可可-辛酸酯和可可-癸酸酯的摻合物)、丙二醇肉豆蔻醚乙酸酯、己二酸二異丙酯和辛酸鯨蠟酯。
適宜的脂肪醇和脂肪酸包括具有10-20個碳原子的那些化合物。特別優選的是例如鯨蠟醇和酸、肉豆蔻醇和酸、棕櫚醇和酸以及十八烷醇和酸。
在多元醇當中可作為潤膚劑的為直鏈和支鏈烷基聚羥基化合物。例如優選丙二醇、山梨醇和甘油。同時可用的是聚合多元醇，如聚丙二醇和聚乙二醇。也特別優選丁二醇和丙二醇作為滲透促進劑。
可作為潤膚劑的烴的例子為那些烴鏈具有12-30個碳原子的烴。具體的例子包括礦物油、礦脂、角鯊烷和異構烷烴。
在本發明美容用組合物內的另一類功能成分為增稠劑。增稠劑的量通常為組合物的0.1-20％(重量)、優選為約0.5-10％(重量)。增稠劑的例子為可購自B.F.Goodrich Company的商標為Carbopol的交聯聚丙烯酸酯物質。可用的膠如黃原膠、角叉膠、明膠、刺梧桐樹膠、果膠和刺槐豆膠。在某些情況下可通過起硅氧烷或潤膚劑作用的物質來完成該增稠功能。例如，超過10厘泊的硅氧烷膠和各種酯如硬脂酸甘油酯具有雙重功能。
可將粉末摻入到本發明的美容用組合物中。這些粉末包括白堊、滑石粉、高嶺土、淀粉、綠土粘土、化學改性的硅酸鎂鋁、有機改性的蒙脫石粘土、水合硅酸鋁、熏過的(fumed)二氧化硅、琥珀酸鋁淀粉辛烯酯及其各種混合物。
可將其它添加劑次要的組分摻入到本發明美容組合物中。這些成分可包括著色劑、遮光劑和香料。這些其它添加劑次要組分的量可為組合物的0.001-20％(重量)。產品用途、形式及包裝在使用中，將少量組合物(如1-100毫升)從適宜的容器或涂敷器中倒出，施用到皮膚裸露區域上，然后如有必要，采用手或手指或適宜的裝置將其涂敷到和/或擦進皮膚中。
可將本發明的美容皮膚調理組合物配制成洗劑、霜劑或凝膠劑。可將組合物包裝于適宜的容器內以適合其粘度及消費者的使用。例如，可將洗劑或霜劑包裝于瓶子或滾球涂敷器內，或拋射劑驅動的氣溶膠裝置或裝有適宜于用手指操作的泵的容器內。當組合物為霜劑時，可簡單地將其貯存于不變形的瓶子或擠壓容器如管或帶蓋的大口瓶中。也可如美國專利5,063,507(明膠膠囊內的硅氧烷基無水組合物)所述將組合物置于在膠囊中(此處通過引用并入本文)。因此，本發明也提供一種如此處所定義的含有美容上可接受的組合物的密閉容器。
以下各具體實施例進一步對本發明進行說明。實施例1本實施例說明一種包括在本發明組合物中的化合物—水楊氧基α-丙酸的合成。方法和材料用Bruker AC200型分光光度計記錄質子核磁共振光譜。將化學位移以百萬分之幾表示，以四甲基硅烷作為內標物。自旋多重性表示如下s(單線)，d(雙重線)，t(三重線)，q(四重線)，m(多重線)和br(寬線)。在指定位置中氘化的NMR溶劑含有99.0-99.8％氘，購自Cambridge Isotopic Laboratories。
紅外光譜用NaCl池的Nicolet Impact 410型分光計記錄。使用Quick IR軟件對數據進行處理。峰位置以cm-1表示為vs(很強)、s(強)、m(中等)、w(弱)或br(寬的)。
采用具有由Hewlett-Packard ChemStation軟件控制的HP7673注射器的Hewlett-Packard 5890系列II氣相層析儀進行氣相層析(GC)。所用Hewlett-Packard HP-1柱為25米×0.22毫米，具有0.33微米交聯甲基硅氧烷的涂層。各參數如下注射溫度＝250℃，初始爐溫＝50℃，起始時間＝5分鐘，速率＝25℃/分，最終爐溫＝250℃。對樣品分析其三甲基甲硅烷基醚/酯。氣相層析/質譜在與Finnigan MAT ITD 800離子阱檢測器連接的Hewlett-Packard 5890系列II氣相層析儀上進行。25米×0.32毫米的HP-5柱具有0.52微米的5％交聯苯基甲基硅氧烷的涂層。
差示掃描量熱實驗在具有2910 cell base和2100熱分析儀的Dupont DSC上進行。將約1毫克的樣品準確稱量進鋁盤上然后進行密封。在30℃達到平衡后以5℃/分的速率對樣品進行加熱。
所有的溶劑均為試劑級，并且即到即用。所有的試劑均購自Aldrich或Sigma Chemical Companies，并且即到即用。步驟12-溴丙酸芐酯的合成在5-10℃下將20.0克(0.13摩爾)的2-溴丙酸與14.1克(0.13摩爾)的芐醇在無水二氯甲烷中進行攪拌，然后加入0.16克(1.3e-3摩爾)的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。在將二環己基碳二亞胺(DCC)(26.7克，0.13摩爾)在無水的二氯甲烷中的溶液滴加入之前將溫度提高到～15℃。溶液以使反應溫度不超過35℃的速率加入。在酰亞胺完全加入后，將反應在25℃下進行數小數，或直到紅外光譜分析顯示在1730cm-1處不存在羧酸伸展(stretch)為止。反應完成后，將反應混合物在真空下進行過濾以除去二環己脲(DCU)副產物，濾液用水萃取一次，用5％的乙酸溶液萃取一次(以除去DMAP)，然后再用水萃取。有機層經無水硫酸鎂進行干燥，然后進行過濾并在減壓下進行濃縮。產量為25克(72％)的2-溴丙酸芐酯和2-氯丙酸芐酯的混合物。
IR(純品)1746cm-1(s)1H NMR(200兆赫茲，CdCl3)d 7.3(s，5H)，5.2(s，2H)，4.4(qt，1H)，1.8(d，3H)GC(保留時間)11.4分鐘步驟2丙酰基水楊酸芐酯的合成將25克(0.092摩爾)上述混合物溶解于100毫升2-丁酮中。將沉淀的二環己脲(副產物)過濾除去，再將200毫升另外的丁酮加入到濾液中。將溶液轉移到反應容器中，然后加入0.15克(9.2e-4摩爾)的碘化鉀催化劑和14.8克(0.092摩爾)的水楊酸鈉。將反應溶液加熱至回流，并通過氣相層析監測反應的完成。數小時后需加入另外0.5當量的催化劑以促使反應進行完成。反應完成后將反應混合物冷卻，并在真空下進行過濾以除去溴化鈉副產物。在減壓下除去丁酮，然后將產物溶解于二氯甲烷中，用水萃取一次，用飽和碳酸氫鈉溶液萃取一次，最后用水進行萃取。分離出有機層，并經無水硫酸鎂干燥，然后進行過濾并在減壓下進行濃縮。產量為26克(82％)90％的丙酰基水楊酸芐酯。
1H NMR(200兆赫茲，CdCl3)d 10.4(s，1H)，7.9(d，1H)，7.4(t，1H)，7.3(s，5H)，6.9(m，2H)，5.4(qt，1H)，5.3(s，2H)，1.8(d，3H)GC(保留時間)16.6分鐘DSC開始溫度(℃)164m/z(GC/MS)301[M+H]+步驟3水楊氧基α-丙酸的合成將6克(0.018摩爾)90％的丙酰基水楊酸芐酯溶解于400毫升的無水2-丙醇中。將溶液送入高壓釜中并冷卻至10-15℃，然后用氮氣進行吹掃以除去空氣/氧氣。然后緩慢加入1.0克(9.0e-4摩爾)10％活性鈀炭催化劑。很重要的一點是將容器內的氧氣減少至最低限度以防止2-丙醇發生著火。催化劑投加完畢后將容器密閉，用氫氣加壓至40-50psi，然后加熱至60℃達5小時。然后將反應混合物冷卻至20℃，過濾除去催化劑，并重新加入另外1.0克10％的鈀催化劑。將反應混合物重新加熱至60℃達5小時，然后進行冷卻及過濾。隨后在減壓下濃縮濾液以除去2-丙醇和甲苯副產物。產量為2.6克(65％)95％的水楊氧基α-丙酸。
1H NMR(200兆赫茲，CdCl3)d 10.4(s，1H)，7.9(d，1H)，7.4(t，1H)，6.9(m，2H)，5.4(qt，1H)，1.8(d，3H)GC(保留時間)13.2分鐘DSC開始溫度(℃)133m/z(GC/MS)210[M]+實施例2該實施例測量通過采用各種測試化合物處理后成纖維細胞產生前膠原的情況。
膠原蛋白是一種主要的皮膚蛋白。其合成隨著老化或光破壞而減少。膠原蛋白的降解或破壞增加了皮膚的拉伸強度，導致出現皺紋及松弛。許多有關人的研究顯示，I型膠原蛋白隨光破壞嚴重程度的增加而減少(參見Kligman，A.，JAMA，(1969)，210，第2377-2380頁；Lavker，R.，J.Inv Derm.，(1979)，73，79-66；Smith J.等人，J.Inv.Derm.，(1962)，39，第347-350頁；和Shuster，S.等人，Br.J.Dermatol.，(1975)，93，第639-643頁)；并且人們已經報道過皺紋的組織結構與裸露于太陽的皮膚中膠原蛋白水平的減少具有某些關聯(參見Chen，S.；Kiss，I.，J.Inv.Derm.，(1992)，98，第248-254頁)。Voorhees及其同事通過顯示通過采用tretinoin進行局部治療來修復光破壞人皮膚中的I型膠原蛋白支持了這些發現(參見Christopher，E.等人，TheNew Eng.Jou.of Medicine(1993)，329，第530-535頁)。前膠原是膠原蛋白的前體。測試化合物施用后所產生的前膠原產生的增加是膠原蛋白水平增加的標志。對于狹線印跡的前膠原I著色方法新生兒的人體表皮成纖維細胞購自Clonetics Corp.，San Diego，CA。所有用于細胞培養的材料均購自Life Technologies，NY，并且按第5-10段的說明進行使用。細胞以約10,000/孔的密度在含有DMEM(Dulbecco氏改良Eagle氏培養基)，由2mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清補充的高葡萄糖以及抗生素和抗真菌劑溶液的培養基的96-孔培養板的48個內孔中進行接種。然后使細胞生長至匯合2天。匯合后除去培養基，細胞用不含血清的DMEM進行洗滌，并且每一孔加入200微升不含血清的DMEM的測試化合物溶液。在總共6個孔中重復每個劑量。使用如下表1中所示濃度的測試化合物。對照不含測試化合物。24小時后移出測試化合物溶液或對照溶液，將細胞中重新加入100微升的不含血清的DMEM中的測試化合物的溶液。使用如下表1中所示濃度的測試化合物。24小時后移出測試化合物溶液或對照溶液，并在4℃下放置過周末，蛋白酶抑制劑(來自Sigma的抑蛋白酶肽)的濃度為抑蛋白酶肽與水之比為1∶200。然后將測試化合物溶液用DMEM稀釋(約20微升樣品在200微升DMEM中)。
將硝基纖維素膜和3片濾紙浸泡于TRIS緩沖鹽水中(TBS，pH7.3)。安裝BioRad狹線印跡裝置(Biorad Labs，CA)，將濾紙置于底部，膜在上部，擰緊。每孔加入100毫升TBS。使用真空通過膜將各孔吸干。攪拌測試化合物溶液或對照物，然后每孔上樣100微升，并進行重力干燥。在該方法的這一步驟中來自測試溶液中的前膠原結合于膜上。將膜從裝置中取出，切掉多余部分，然后在底部右角刻上痕跡以便定向。將膜置于封閉溶液中于4℃下搖動過夜。然后將膜在室溫下與1.5毫升在TBS中的鼠抗人前膠原氨基末端Ab(Chemicon MAB1912)和0.1％BSA(抗體與緩沖液/BSA之比為1∶100)在密封袋中搖動培養1.5小時。將膜移出，在TBS/0.1％Tween中洗滌3次達5分鐘。然后將膜在室溫下在2毫升TBS中的生物素化的抗鼠過氧化物酶軛合的Ab(Vector Labs)和0.1％BSA(抗體與緩沖液/BSA之比為1∶1000)在密封袋中一起搖動孵育1小時。
將膜在TBS/0.1％Tween中洗滌3次達5分鐘。將3毫升的PBS與各30微升來自Vectasetain Kit的溶液A和B一起孵育30分鐘。將膜放置于密封袋中的所得溶液中搖動30分鐘。然后移出膜，并在TBS/0.1％Tween中洗滌2次達5分鐘。然后采用以下溶液對膜進行染色12.5毫克3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma)3.125(大約)毫升DMF(N，N-二甲基甲酰胺，來自Sigma)，21.5毫升0.2M NaOAc緩沖液，pH 5.2，12.5毫升H2O2。
繼續對膜進行著染色直到產生顏色為止，在自來水中洗滌2次達10分鐘使反應停止。采用color copier制備印跡的透明度。采用激光光密度計(來自Pharmacia KLB的Ultroscan XL)對color copy進行掃描。以用測試化合物處理后的細胞的光密度計讀數與對照物的讀數之比計算褶皺的增加。
將所得結果總結于表1中。
表1
SP＝水楊氧基α-丙酸水楊酸和乳酸每一個都增加成纖維細胞產生前膠原I(數據未示出)。
從表1的數據中可看出，將濃度為1、2和5mM的水楊氧基α-丙酸加入到成纖維細胞培養物中導致前膠原I產生的增加(與對照相比光密度計讀數更高顯示)。我們相信濃度為10mM的水楊氧基α-丙酸對成纖維細胞的培養物具有破壞作用。實施例3該實施例測量通過采用各種測試化合物處理后成纖維細胞產生糖胺聚糖的情況。糖胺聚糖(GAGs)為多糖家族的一員，可將它們(透明質酸(HA)除外)連接到蛋白核上形成蛋白聚糖。真皮中的主要GAGs為HA和硫酸皮膚素，以及少量的軟骨素-4-硫酸鹽和軟骨素-6-硫酸鹽。由角化細胞和表皮成纖維細胞所制得的GAGs是細胞外基質的主要組分，雖然它們僅構成皮膚干重的0.2％。GAGs在皮膚中進行水合作用(HA可以保持其自身質量1000倍的水)并保持基膜的完整性，調節細胞相互作用及營養轉運，還包括在膠原蛋白(以及可能包括在彈性纖維的)形成過程中。已經顯示皮膚中的GAGs(特別是HA)的比例隨老化而減少(參見Perlish等人的“The Role ofGlycosaminoglycans in Aging of the Skin”)。作為抗老化活性基準的視黃酸已經證實能體內增加表皮多刺和顆粒狀層及老化后皮膚的乳突狀皮膚的GAG含量(參見Kligman等人的“Effects of topical tretinoinon non-sun-exposed protected skin of the elderly”，J.Am Acad Dermatol1993；2925-33)。用于測量GAGs的方法新生兒的人體表皮成纖維細胞購自Clonetics Corp.，San Diego，CA。所有用于細胞培養的材料購自Life Technologies，NY，并且按第5-10段的說明進行使用。將細胞以約10,000/孔的密度在含有DMEM(Dulbecco氏改良Eagle氏培養基)、由2mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清補充的高葡萄糖以及抗生素和抗真菌劑的培養基的96孔培養板的48個內孔中進行接種。然后使細胞生長至匯合2天。匯合后每孔在不含血清的DMEM中進行漂洗，并且各孔加入750微升不含血清的DMEM中的測試化合物(三個復份)。使用在下表2中所示的濃度的測試化合物。對照不含任何測試化合物。24小時后吸出培養基，然后重復此處理步驟。在第二個24小時期間后，收集含有可溶GAGs的培養基并冷凍直至進行分析為止。
將帶正電的Zeta Probe膜浸泡在滅菌水中，并置于Dot-BlotApparatus(兩者都來自Bio-Rad Labs，Hercules，CA)。將100微升水加入到每一個孔中并采用真空抽吸。融化后將100微升測試溶液樣品或標準物(來自牛氣管，Sigma，St.Louis，MO的透明質酸或硫酸軟骨素)施用到膜上并進行重力過濾(約1.5-2小時)。GAGs現結合于膜上。將膜在3％w/v不含脂肪酸的牛血清白蛋白(Sigma)水溶液中封閉1小時。制備愛茜藍染料(ICN Biochemicals，Cleveland，OH)在3％乙酸中的0.5％w/v染料溶液，其pH約為2.3。將膜用蒸餾水中洗滌兩次，然后在旋轉振搖器的染料溶液中染色15分鐘。倒掉染料，然后將膜在3％的乙酸中脫色兩次(每次15分鐘)。使膜在水中漂洗，并放置干燥過夜。采用Bio-Rad Image Analysis Densitometer來對每一個印跡的顏色強度進行定量。以用測試化合物處理后的細胞的光密度計讀數與對照的讀數之比計算褶皺的增加。
將所得結果總結于表2中。
表2
SP＝水楊氧基α-丙酸乳酸能增加GAGs的產生，但水楊酸則不能(數據未示出)。
從表2的數據中可看出，將濃度為1mM的水楊氧基α-丙酸加入到成纖維細胞培養液中導致GAGs的產生增加(與對照相比其光密度計讀數更高)。在本分析中觀察到與對照相比最大的褶皺增加約為2(采用轉化生長因子β)。實施例4該實施例報道通過各種測試化合物抑制皮脂的體外分析。
體外脂肪細胞脂肪生成測定將人皮脂腺從一男性(60歲)的鼻中取出，并采用浸入組織培養技術進行培養(Bajor等人，J.Invest.Dermatol.1021994，第564頁)。這些脂肪細胞積累了具有成人皮脂特征的胞內類脂滴。乳酸和水楊酸均購自Sigma。
將收獲和傳代的脂肪細胞加入到48孔組織培養板的每一個孔中，并在37℃以及存在7.5％的CO2下孵育10天。實驗當天，移出生長培養基并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)對脂肪細胞洗滌三次。往每一個孔加入0.5毫升的新鮮PBS和5毫升測試試劑，使最終濃度為0.001-0.2％。對每一種樣品做三個復孔。對照由PBS、用于增溶水楊氧基α-丙酸的二甲基亞砜(DMSO)以及一種擁有類似雌激素活性的化合物苯酚紅(苯酚紅減少皮脂的產生并用作確認脂肪細胞分析的完整性的對照)所組成。所有的培養液在37℃/7.5％CO2孵育30分鐘。通過將100毫升14C標記的乙酸(Amersham，鈉鹽，比活性為56mCi/毫摩爾)加入到10毫升50mM的乙酸鈉緩沖液中制備放射性標記。然后將50毫升加入到含有脂肪細胞和測試試劑的每一個孔中。將培養液放回到培養箱中4小時。此后用新鮮PBS將脂肪細胞漂洗三次以除去未結合的活性物及放射性的標記。采用Beckman閃爍計數器計算保留在培養后的脂肪細胞的放射性標記。將結果表示為與對照相比較(DMSO)的減少％。
將獲得的結果總結于下表3中。
表3
SP＝水楊氧基α-丙酸從表3中的結果可看出，0.10％及較高濃度的水楊氧基α-丙酸一致地抑制脂肪細胞皮脂的分泌。在四個實驗中的三個，水楊氧基α-丙酸甚至在濃度低于0.01％時仍然有效。比起相同濃度的水楊氧基α-丙酸來，乳酸在0.1％時基本不太有效。水楊酸無效。實施例5該實施例報道由水楊氧基α-丙酸所具有的使皮膚變淡的潛能的體外分析。
B16細胞購自ATCC(Rockville，MD)。分匯合B16細胞在96孔微量滴定板中以5000細胞/孔的密度進行接種，并在含有10％胎牛血清、1％青霉素/鏈霉素(沒有苯酚紅)的DMEM(Life Technologies，NY)中在37℃及5％CO2下培養過夜。24小時后用新鮮的含有處理物的新鮮培養基代替。將細胞培養72小時，其時在對照處理中已能看到黑素。接著將含有黑素的培養基從每一個孔中轉移到一個清潔的96孔培養板中，并通過采用微量滴定板分光光度計在530納米處讀取吸光度來定量。
為了確保對黑素的抑制不僅僅是由于殺死細胞所致，我們通過中性紅染料攝取來評估細胞的生存力。在移出培養基后將200微升預熱的含有25微克/毫升中性紅染料的培養基加入到每一個孔中并孵育3小時。用PBS洗滌細胞兩次。通過加入100微升50H2O∶49乙醇∶1乙酸萃取染料然后在室溫下緩慢搖動20分鐘。通過在530納米處讀取吸光度對染料進行定量。只有存活的細胞才能吸附染料，因此吸光度直接與處理后存活細胞的數目成比例。
對于每一種處理，計算四次重復讀數的平均值并表示為對未處理對照物的平均值的百分數。使用studentt檢驗法確定統計學意義(只有對于處理后顯示大于50％存活率的情況才加以報道)。
將所獲得的結果總結于表4中。由于黑素被表示為未處理對照物的％，因而該值越小，則活性越佳(當中性紅數值接近100時)。
表4<
<p>SP＝水楊氧基α-丙酸從表4中的結果可以看出，1mM及更高濃度的水楊氧基α-丙酸顯著地抑制了黑素，因而表明水楊氧基α-丙酸是一種存活皮膚變淡活性物。實施例6實施例6說明根據本發明的局部組合物。這些組合物可以常規的方式進行加工。它們適用于美容用途。具體而言，這些組合物適宜施用到起皺紋的、粗糙的、易剝落的、老化的和/或UV-損壞的皮膚和/或油性皮膚以改良其外觀及感覺，以及施用于健康皮膚以防止或延緩其退化。水包油乳狀液
水包油乳狀液
油包水乳狀液
權利要求
1.一種皮膚調理組合物，它包含(a)0.0001-20％(重量)的下式I的水楊氧基α-羧酸
其中R為氫或含有1-16個碳原子的烷基基團，M為氫或選自堿金屬或堿土金屬的金屬陽離子；和(b)美容上可接受的載體。
2.權利要求1的組合物，其中水楊氧基α-羧酸中的R為CH3。
3.權利要求1或2的組合物，其中水楊氧基α-羧酸中的M為氫或鈉。
4.一種控制油性皮膚的美容方法，該方法包括將根據權利要求1-3中任一項的組合物施用到皮膚上。
5.一種減少、防止或控制脂肪細胞(sebocyte)分泌皮脂的美容方法，該方法包括將根據權利要求1-3中任一項的組合物施用到皮膚上。
6.一種刺激皮膚中成纖維細胞合成膠原蛋白和糖胺聚糖的美容方法，該方法包括將權利要求1-3中任一項的組合物施用到皮膚上。
7.一種治療老化、光致老化、干燥、條紋或皺紋皮膚的美容方法，該方法包括將根據權利要求1-3中任一項的組合物施用到皮膚上。
8.一種使皮膚免受有害UVA和UVB光傷害的美容方法，該方法包括將根據權利要求1-3中任一項的組合物施用到皮膚上。
9.一種使皮膚變淡(lightening)的美容方法，該方法包括將根據權利要求1-3中任一項的組合物施用到皮膚上。
全文摘要
含有水楊氧基α－羧酸的美容用皮膚調理組合物。本發明組合物提供了對脂肪細胞分泌皮脂的控制、改善的油性控制和改善的皮膚感覺、防止出現發亮及粘著現象,同時還提供抗老化的功能,從而減少出現皺紋和老化的皮膚、改善皮膚顏色、治療光致老化的皮膚、改善皮膚的光亮度和透明度及光潔度,以及總體健康及年輕的皮膚外表。
文檔編號A61K8/30GK1261787SQ98806896
公開日2000年8月2日 申請日期1998年4月21日 優先權日1997年5月9日
發明者A·A·格雷羅, J·M·科里 申請人:尤尼利弗公司