一種枳提取物的體內外降糖用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬食品藥品領域，涉及天然來源的枳提取物在制備降糖功能食品、保健品 或防治藥物中的應用，尤其涉及枳提取物在人肝癌H印G2細胞和糖尿病C57BL/6小鼠模型 中降糖的應用。
【背景技術】
[0002] 糖尿病是以體內高血糖為特征的一種流行病。糖尿病分為兩種：1型糖尿病(胰島 素依賴)和2型糖尿病(非胰島素依賴)，遺傳和環境因素對于兩者都有影響。糖尿病的發展 通常伴隨其它代謝綜合征，例如肥胖、高血脂和炎癥等。在過去的幾十年間，糖尿病及其并 發癥的發生率顯著增加，根據世界衛生組織（WHO)的數據，全世界范圍內有3. 47億糖尿病 患者。2型糖尿病占糖尿病的90%，它的發生由于胰島素抵抗或者胰島素分泌受損，表現為 高血糖和葡萄糖不耐受。2013年，在中國有9840萬糖尿病病例（IDF)。因此，對于糖尿病 及其并發癥的預防和控制項目刻不容緩。
[0003] 枳tri/b7iate)，別名枳實、枸橘、橘紅等，屬落葉灌木或小喬木，在我 國多地均有栽培，廣泛用作綠蘺。枳果實可提有機酸；種子可榨油；葉、花及果皮可提芳香 油。枳殼是傳統的中藥材，可供藥用，能破氣消積等。然而，關于枳提取物在體內外是否具 有降糖活性，未見報道。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種枳提取物在制備降血糖藥物中的應用。所述枳提取物為 油胞層、白皮層、囊衣和汁胞的固相萃取（SPE)粉末。
[0005] 本發明的另一個目的是提供一種枳提取物在制備降糖功能食品、保健品中的應 用。所述枳提取物為油胞層、白皮層、囊衣和汁胞的固相萃取（SPE)粉末。
[0006] 所述枳提取物是通過將枳油胞層、白皮層、囊衣和汁胞提取物從其冷凍干燥粉末 開始，經過甲醇超聲提取、旋轉蒸發、過固相萃取柱、真空干燥得到。
[0007] 本發明發現在人肝癌HepG2細胞內（i/7 枳提取物可以顯著增加葡萄糖消 耗。
[0008] 本發明發現在高脂飲食誘導糖尿病C57BL/6小鼠體內（i/7hra)枳提取物可以顯 著降低糖尿病C57BL/6小鼠的空腹血糖，增加葡萄糖耐量，減少胰島素抵抗。
[0009] 本發明強調枳提取物這種天然產物在糖尿病防治中的最新發現。
[0010] 本發明提供一種枳提取物在制備降糖功能食品、保健品或防治藥物中的應用。 枳提取物能夠在人肝癌HepG2細胞內（i/7nYro)顯著增加葡萄糖消耗，能夠在糖尿病 C57BL/6小鼠體內（i/?hra)顯著降低空腹血糖，增加葡萄糖耐量，減少胰島素抵抗。可作 為功能食品、保健品或防治藥物用于糖代謝異常相關疾病的防治。
【附圖說明】
[0011] 圖1是以人肝癌HepG2細胞為模型，枳提取物對其葡萄糖消耗的影響。其中，二 甲亞砜（DMS0)為陰性對照，常用降糖藥二甲雙胍（MET)為陽性對照，枳油胞層、白皮層、囊 衣和汁胞SPE粉末各設置4個濃度(終濃度)梯度，分別為0. 2yg/mL、lyg/mL、5yg/mL 和25yg/mL，n=4。用SPSS軟件進行差異顯著性分析，進行t檢驗，05, 01， ***/X0. 001，與DMS0 組比較。
[0012] 圖2是以高脂飲食誘導糖尿病C57BL/6小鼠為飼喂對象，枳油胞層、白皮層、囊衣 和汁胞SPE粉末對其空腹血糖的影響。給藥13周，第8、10周測定其空腹血糖。低脂+清 水組為低脂飲食組，高脂+清水組為高脂飲食誘導糖尿病組，4個處理組劑量都為40mg/kg BW，n=6-10。用SPSS軟件進行差異顯著性分析，進行（檢驗，01，001，與高 脂+清水組比較。
[0013] 圖3-1是以高脂飲食誘導糖尿病C57BL/6小鼠為飼喂對象，枳油胞層、白皮層、囊 衣和汁胞SPE粉末對其葡萄糖耐量試驗（0GTT)的影響。給藥13周，第12周測定其葡萄糖 耐量。低脂+清水組為低脂飲食組，高脂+清水組為高脂飲食誘導糖尿病組，4個處理組劑 量都為 40mg/kgBW，n=6-10。
[0014] 圖3-2是以高脂飲食誘導糖尿病C57BL/6小鼠為飼喂對象，枳油胞層、白皮層、囊 衣和汁胞SPE粉末對其曲線下面積（AUC)的影響。給藥13周，第12周進行0GTT試驗，計 算其曲線下面積。低脂+清水組為低脂飲食組，高脂+清水組為高脂飲食誘導糖尿病組，4 個處理組劑量都為40mg/kgBW，n=6-10。用SPSS軟件進行差異顯著性分析，進行（檢驗， **/?<0. 01，***/X0. 001，與高脂+清水組比較。
[0015] 圖4是以高脂飲食誘導糖尿病C57BL/6小鼠為飼喂對象，枳油胞層、白皮層、囊衣 和汁胞SPE粉末對其胰島素抵抗評價指數（H0MA-IR)的影響。給藥13周，試驗結束后處死 小鼠取血清，測定其血清血糖和血清胰島素含量，計算胰島素抵抗評價指數。低脂+清水組 為低脂飲食組，高脂+清水組為高脂飲食誘導糖尿病組，4個處理組劑量都為40mg/kgBW， n=6-10。用SPSS軟件進行差異顯著性分析，進行t檢驗，05，***/X0. 001，與高脂+清 水組比較。
【具體實施方式】
[0016] 本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。
[0017] 實施例1枳提取物的制備 枳成熟果實(采自浙江省臺州市黃巖區）經過手工分離得到油胞層、白皮層、囊衣和汁 胞，液氮速凍后經過低溫真空干燥，磨樣后得到冷凍干燥粉末。分別稱取枳油胞層、白皮層、 囊衣和汁胞冷凍干燥粉末1g，用80%甲醇20mL(固液比1:20)超聲30min，頻率為60 kHz，功率為30W，提取液通過10000rpm離心得到澄清上清液，如此重復3次，合并上清液， 在旋轉蒸發儀上蒸去甲醇，得到枳提取物水溶液。
[0018] 水溶液用固相萃取（SPE)S印-Pak? C18柱進行純化（12cc/2g，Waters)，純化過 程包括活化、平衡、上樣、淋洗和洗脫五個步驟：S印-Pak? C18柱首先用20mL甲醇活化，再 用20mL去離子水平衡，然后水溶液上樣，待充分吸附后，小柱用40-80mL去離子水淋洗以 洗去果實中的糖酸等極性物質，真空抽干后用足量的甲醇(根據洗脫顏色判斷）充分洗脫， 洗脫液用真空干燥儀蒸干，分別得到粉末66. 7mg、64. 4mg、69. 9mg和34. 2mg，得到的粉 末即為枳油胞層、白皮層、囊衣和汁胞SPE粉末。
[0019] 實施例2枳提取物的HepG2葡萄糖消耗試驗 IfepG2細胞用含10 %胎牛血清的高糖型DMEM培養基于37 °C、5 %C02細胞培養箱中 孵育，隔天更換新鮮培養液，2-3天傳代1次。實驗時，HepG2細胞接種于96孔板，并設無細 胞空白對照孔。待細胞生長至70-80 %融合，棄去原培養基，用PBS緩沖液洗2遍，換上含 0. 2 %BSA的無血清1640培養基，分組加藥。設DMS0溶劑對照組，二甲雙胍（MET)對照組 (終濃度為1 mm〇l/L)和不同濃度枳提取物組(終濃度分別為0.2 yg/mL、1 yg/mL、5 yg/ mL和25yg/mL)。作用24小時后，用酶標儀檢測各孔0D值(檢測波長：505nm)，用葡萄 糖氧化酶法測定每孔培養液的葡萄糖含量。每孔培養液葡萄糖消耗量=無細胞空白孔培養 液葡萄糖含量一每孔培養液葡萄糖含量，每組設4個復孔。相同實驗重復4次。
[0020] 葡萄糖含量測定后，棄去板中培養基，細胞用10%三氯醋酸固定1小時，用雙蒸水 洗滌并干燥后，每孔加入1〇〇UL磺基羅丹明B(SRB)溶液（4mg/mL)，室溫染色20分鐘， 1%醋酸洗滌并干燥。每孔加入100UL10mmol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris)溶液使SRB溶 解。用酶標儀檢測各孔0D值(檢測波長：515nm)，用于反映細胞增殖狀況，以矯正細胞接種 數目及化合物毒性等綜合因素造成的實驗誤差。最后計算各組葡萄糖消耗量與溶劑對照組 比較的增加百分率。
[0021] 數據用平均值土標準誤U±SE)表示，使用SPSS軟件進行數據分析，進行（檢驗。 具體的佛手柑素葡萄糖消耗活性見附圖1。
[0022] 實施例3枳提取物的C57BL/6小鼠試驗 C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼喂的低脂飼料(含10%脂肪） 和高脂飼料(含45%脂肪)購自江蘇美迪森生物醫藥有限公司。所有小鼠在恒溫恒濕環境下 飼養，提供12h光照12h黑暗環境。每組10只小鼠，低脂+清水組為低脂飲食組，高脂+ 清水組為高脂飲食誘導糖尿病組，4個處理組劑量都為40mg/kgBW。所有小鼠可以自由攝 取食物和蒸餾水，處理組通過灌胃針灌胃的方式進行給藥，灌胃體積為20mL/kgBW，低脂 和高脂對照組灌胃蒸餾水。試驗為期13周，1周連續給藥6天，停藥1天。從第8周開始測 定空腹血糖，間隔1周測定1次，測定前小鼠禁食過夜，對小鼠尾靜脈剪尾取血，用強生One TouchUltraZSJ843ETT型血糖儀測定空腹血糖值。數據用平均值土標準誤（f±SE)表 示，使用SPSS軟件進行數據分析，進行（檢驗。具體的3周空腹血糖測定值見圖2。
[0023] 試驗進行的第12周測定0GTT。測0GTT之前，小鼠禁食過夜，給藥，1h后測0GTT。 采血作為0 min血糖值，然后給予20%葡萄糖（4 g/kgBW，灌藥體積為10mL/kgBW)灌 胃后，于30、60、90、120 min四個時間點分別尾靜脈采血，用強生OneTouchUltraZSJ 843ETT型血糖儀測定血糖值，繪制糖耐量曲線。曲線下面積計算公式為：AUC=(G0+G30)X1 5+(G30+G60)X15+(G60+G120)X30。數據用平均值土標準誤（f±SE)表示，使用SPSS軟件 進行數據分析，進行（檢驗。具體的C57BL/6小鼠糖耐量曲線和曲線下面積（AUC)分別見 附圖3-1和附圖3-2。
[0024] 試驗進行13周后處死小鼠，采集血清，使用羅氏Cobas8000生化儀測定血清血 糖，使用上海朗頓生物科技有限公司的ELISA試劑盒測定血清胰島素，按照胰島素抵抗評 價指數公式H0MA-IR=血清血糖X血清胰島素/22. 5計算，具體的胰島素抵抗評價指數見 附圖4。
【主權項】
1. 一種枳提取物在制備降糖藥物中的應用，其特征在于，所述枳提取物為油胞層、白皮 層、囊衣和汁胞的固相萃取粉末。2. -種枳提取物在制備降糖功能食品、保健品中的應用，其特征在于，所述枳油胞層、 白皮層、囊衣和汁胞的固相萃取粉末。3. 根據權利要求1或2所述的一種枳提取物的應用，其特征在于，所述枳提取物是通過 將枳油胞層、白皮層、囊衣和汁胞提取物從其冷凍干燥粉末開始，經過甲醇超聲提取、旋轉 蒸發、過固相萃取柱、真空干燥得到。
【專利摘要】本發明提供一種枳提取物在制備降糖功能食品、保健品或降糖藥物中的應用。枳油胞層、白皮層、囊衣和汁胞提取物能夠在人肝癌HepG2細胞內（in vitro）顯著增加葡萄糖消耗，能夠在糖尿病C57BL/6小鼠體內（in vivo）顯著降低空腹血糖，增加葡萄糖耐量，減少胰島素抵抗。可作為降糖功能食品、保健品，也可制備降糖藥物，用于糖代謝異常相關疾病的防治。
【IPC分類】A61P3/10, A23L1/29, A61K36/752
【公開號】CN104940363
【申請號】CN201510343441
【發明人】李鮮, 賈勝, 孫崇德, 陳昆松
【申請人】浙江大學
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年6月20日