專利名稱：：從磷蝦制備富含ω-3的海洋磷脂的方法
技術領域：
：本發明涉及從新鮮磷蝦(freshkrill)制備基本上全部脂質級分(substantiallytotallipidfraction)的方法，以及從其它脂質分離磷脂的方法。本發明也涉及制備高質量磷奸粉(krillmeal)的方法。
背景技術：
：海洋磷脂用于醫藥產品，保健食品和人類營養品，還用于魚類飼養和用作增加海洋物種(如鱈魚、大比目魚和大菱鲆)的魚幼體(fishlarval)和魚苗(fishfry)的存活率的方法。來自海洋生物體的磷脂包含Q-3脂肪酸。認為結合至海洋磷的脂脂肪酸具有尤其有用的性質。產品(如魚精和魚卯)是海洋磷脂的傳統原料。然而，這些原料的可用量有限，且所述原料的價格很高。磷蟲下是小的奸類動物，其含有相對高含量的磷脂。在磷蝦目(五w;^aW^)中，存在80種以上的物種，其中南極磷蝦是其中之一。目前最可能商業使用的是南才及五w//zoww'asM/er6a。SM/er6a具有2-6cm長。另一種南才及石奔奸物種為五.c，to〃o^p/z/os。Mega/7j;c印/za"esworveg/ca、77^朋oewa/wermz、和rrasc/z//是北極磷奸的實例。新鮮磷奸含有高達約10%的脂質，其中約50。/。為磷脂(^^/^us/ara/w^)。來自磷蝦的磷脂包含非常高含量的Q-3脂肪酸，其中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的含量為40%以上。來自南極磷蝦的兩種主要物種的脂質的大致成分見于表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>而且，南極磷奸與傳統魚油相比具有更低含量的環境污染物。磷蝦具有含酶(包括在約o'c非常活潑的脂肪酶)的消化系統。磷蝦死后脂肪酶保持活性，水解部分的磷奸脂質。其不希望的作用是磷奸油通常含有百分之幾的游離脂肪酸。如果在加工前磷奸被切成較小的部分，本領域:忮術人員會立即意識到這會增加水解的程度。因此，需要找到一種方法，其能夠使用整個的新鮮磷蝦，或來自磷蝦的整個身體部分，從而該方法會提供具有改善的質量且脂質水解程度降低的產品。該質量改善會影響全部的^粦蝦脂質，包括磷脂、甘油三酯和蝦青素酯(astaxanthinester)。在很大程度上磷蝦脂質位于動物的頭中。因此使用新鮮磷蝦的方法也非常適合立即處理來自去掉頭部皮的磷蝦(可在捕魚船上產生的產物)的副產物。Beaudion等人的美國專利6,800,299公開了一種通過在低溫使用有機溶劑(如丙酮和乙醇)連續提取從磷奸中提取總脂質級分的方法。該方法涉及使用大量不友好的有機溶劑提取。K.Yamaguchi等人(/.力gn'c.FoodC/7e肌1986，34，904-907)表明<吏用二氧化碳(最常用于超臨界提取的溶劑)的超臨界流體提取冷凍干燥的南極磷蝦，導致產物主要由非極性脂質(主要為甘油三酯)組成，且沒有磷脂。Yamaguchi等人報導磷奸粉中的油被氧化或聚合而變質，這限制了僅能使用超臨界C02進行提取。Y.Tanaka和T.Ohkubo(/O/eo.SW.(2003)，52,295-301)引用了Yamaguci等人的工作，并結合至他們自己的從大馬哈魚魚卵提取脂質的工作中。在最近的出版物中(Y.Tanaka等人(2004),/O/肌5W,53,417-424)，相同的作者嘗試通過使用乙醇和C02混合物提取磷脂而解決該問題。通過使用含有5%乙醇的co2，磷脂并沒有從冷凍干燥的大馬哈魚魚卯中被移出，而通過加入10%乙醇，移出30%的磷脂，且通過加入30%乙醇時，移出80%以上的磷脂。冷凍干燥是一種昂貴且耗能的方法，且不適合處理非常大量的來自商業^^蝦漁業的原料。Tanaka等人嘗試通過改變提取溫度而優化該方法，并且發現低溫得到最好的結果。對于C02，選擇33。C(剛好高于臨界溫度的溫度)得到最好的結果。與這些發現相反，我們驚奇地發現了一種從新鮮磷蝦中提取基本上全部脂質級分的方法，而不需要復雜且昂貴的預處理，如大量冷凍干燥。脂質級分包含甘油三酯、蝦青素和磷脂。在加工前，我們不必使原料干燥或脫油。與Tanaka等人相反，我們發現短時間的加熱海產品原料對于提取產率是有利的。也表明磷蟲下的預處理(如短時加熱至中等溫度或與固體干燥劑如分子篩接觸)能夠使單獨使用乙醇洗滌有效地從新鮮磷蝦中移出磷脂。發明概述本發明的主要目的是提供一種從新鮮磷蝦制備基本上全部脂質級分而不使用有機溶劑(如丙酮)的方法。暴露于超臨界壓力下的流體將防止氧化的發生，且認為二氧化碳/乙醇組合使磷奸脂質的任何酶水解失活。因為本發明的方法要求原料處理的最小化，并且也非常適合用于新鮮磷蝦(例如漁船帶來的)，所以認為與常;t見方法制備的脂質相比，本發明的產物基本上不含有水解和/或氧化的脂質。這也意味著與常規方法相比磷蝦脂質抗氧化劑的污染更少。任選的預處理(包括短時加熱新鮮磷蟲下)也將使脂質的酶分解失活，從而確保產物中游離脂肪酸的水平非常低。本發明的另一個目的是提供一種從其它海洋原料(魚性腺、CWa"^物種或高質量磷蝦粉(krillmeal))制備基本上全部脂質級分的方法。本發明的另一個目的是提供富含長鏈多不飽和Q-3脂肪酸的基本上全部脂質級分。這些和其它目的通過所附權利要求中限定的方法和脂質級分而實現。本發明提供了一種從新鮮磷蝦中提取基本上全部脂質級分的方法，包括下述步驟a)降低磷奸原料的水含量；和b)分離脂質級分。任選地，上述方法進一步包括下述步驟a-l)在超臨界壓力下，用含有乙醇、曱醇、丙醇或異丙醇的C02提取來自步驟a)的水含量降低的磷奸物質。該步驟a-l)直接在步驟a)后進行。在本發明優選的實施方案中，4是供了一種從新鮮石舞蝦中提取基本上全部脂質級分的方法，其包括下述步驟a)降低磷奸原料的水含量；a-l)用含乙醇的C02提取來自步驟a)的水含量降低的磷奸物質，該提6取在超臨界壓力下進行；和b)從乙醇中分離脂質級分。在本發明的優選實施方案中，步驟a)包括用重量比為1:0.5至1:5的乙醇、曱醇、丙醇和/或異丙醇洗滌磷蝦原料。優選地，洗滌前將磷蝦原津+加熱至60-100。C，更有選至70-100°C,且最優選至80-95°C。而且，洗滌前4尤選將磷奸原料加熱約l-40分鐘，更優選約1-15分鐘，且最優選約l-5分4中。在本發明的另一個優選實施方案中，步驟a)包括使磷蝦原料與分子篩或其它形式的膜(如吸水膜(waterabsorbingmemberane))接觸，以移除水。優選地，步驟a-l)中乙醇、曱醇、丙醇和/或異丙醇的量為5-20%重量，更優選為10-15%重量。除了制備含磷蝦總脂質的產物，本發明還可用于從其它脂質分離磷脂。根據本發明，為了將通過超臨界壓力下提取獲得的總脂質分離為不同的脂質類型，使用純二氧化碳提取所述總脂質能夠從富含Q-3的磷脂中移除非極性脂質。用含少于5%乙醇或曱醇的二氧化碳提取總脂質是另一種選擇。由于在有價值的Q-3脂肪酸中磷脂比其它脂質類型多得多，這使得本發明可用于制備高濃度的Q-3脂肪酸。而市售魚油含有11-33%的總Q-3脂肪酸問altason,B和Haraldsson，GG(2006)Fishoilsandlipidsfrommarinesources,In:Moc/妙/"g丄z)^t/seFoot/(FDGunstone，ed),WoodheadPublishingLtd,Cambridge,pp.56-79),磷蝦的磷脂水平高的多(Ellingsen,TE(1982)Biokjemiskestudieroverantarktiskkrill，PhDthesis,Norgestekniskehoyskole,Trondheim.EnglishsummaryinPublicationno.52oftheNorwegianAntarcticResearchExpeditions(1976/77和1978/79))，也參見表1。富含Q-3的磷脂可以其本身使用，提供多種有利的由于含Q-3的磷脂產生的生物學作用。或者，磷脂可以被酯交換或水解以得到酯(通常為乙基酯)或游離脂肪酸或其它適合進一步濃縮Q-3脂肪酸的衍生物。例如，磷蝦磷脂的乙基酯作為制備才尋合歐洲藥典專^侖(EuropeanPharmacopoeiamonographs)1250(Q-3-酉交乙酯90)、2062-3-酸乙酯60)和1352(Q-3隱酸甘油三自旨)的濃縮產品的中間產物是有價值的。同時，剩余的脂質(蝦青素、抗氧化劑、甘油三酯、蠟酉旨)可以其本身用于多種用途，包括水產飼料，或該脂質類型可^皮進一步分離。因此，本發明的另一個目的是提供一種如上所述的從其它脂質中分離磷脂的方法。本發明的另一個目的是制備高質量磷蝦粉。因為在本方法的最初步-驟移出了脂質，因此該餐將基本上不含氧化的和聚合的脂質。這將使該餐非常適合用于避免氧化應激是非常重要的應用中，即用于水產飼養，尤其是海洋魚類的起始飼料。因此，本發明的磷奸粉非常適合飼養魚幼體和魚苗，以及魚和曱殼類動物。而且，本發明的磷蝦粉可用作高質量殼聚糖產品的來源。發明詳述本方法可以在多種加工條件下進行，其中一些示例如下。下述"新鮮"磷奸定義為捕獲后立即被處理或捕獲后在足夠短的時間被處理以避免質量變質(如脂質的水解或氧化)的磷蝦，或捕獲后立即冷凍的磷蟲下。新鮮磷奸可以為整個的磷蝦或來自新鮮磷蝦的副產物(即去皮后)。新鮮磷蟲下也可以為捕獲后短時間內冷凍的磷蝦或來自磷蝦的副產物。而且"磷奸"也包括磷奸粉。圖1所示的為用作提取原料的w;eAa圖。圖2所示的為如下面實施例7所述的提取后的物質。實施例'實施例1:冷凍干燥的磷蝦的處理將冷凍干燥的磷奸在超臨界壓力下用C02提取。得到90g/kg的產物。分析表明提取物包括總和僅為5.4%的EPA+DHA,表明不含明顯量的富含Q-3的磷脂。用含10%乙醇的C02第二次提取得到100g/kg的提取物(從起始樣品重量計算)。"PNMR表明產物含磷脂。提取物含總和為33.5%的EPA+DHA。在兩個步驟中，^是取條件均為300巴，50°C。因此，能夠基本上將富含Q-3的磷脂與磷蝦脂質的較少富含Q-3的成分分離。在第二個實驗中，將冷凍干燥的磷蝦用與上述相同的壓力和溫度提取兩次，首先用167份(重量)的純C02，然后用167份(重量)含10%乙醇的C02。合并的提取物(280g/kg原料)通過13C和31PNMR分析。分析表明產物含甘油三酯和磷脂作為主要成分。與以前的提取相似，暗紅色表示提取物含蝦青素。我們并不認為實施例1的方法已經用于冷凍干燥的磷蝦。該方法并不能從Y.Tanaka等人(2004)/O/eo<Sc/.53，W7-424中預期得到。現有技術中含10%乙醇的C02僅提取了30%的磷脂；要提取80%的磷脂，不得不^f吏用20%乙醇。根據具體實施例方式實施例2在約0°C,將新鮮的五.^per^(200g)用乙醇(l:l,200g)洗滌。乙醇提取物(1.5%)含有無機鹽(主要為NaCl)和一些有機物質。將乙醇洗滌的磷奸用含10%乙醇的C02提取。得到12g提取物(基于起始磷壞的6%)。分析(TLC和NMR)表明提取物含有磷脂、甘油三酯和奸青素。本領域技術人員會認識到在超臨界壓力下二氧化碳能夠作為對于乙醇的溶劑。因此，改變co2的溶劑能力的替代方法是使用壓力/溫度條件，使得乙醇直接從含乙醇的磷蝦原料中溶出，而不用必須加入C02的預處理。這也用于下述實施例。實施例3在約(TC，將新鮮的￡.(200g)用乙醇(1:3，600g)洗滌。乙醇提取物(7.2%)含有磷脂、甘油三酯和蝦青素，和一些無機鹽。提取物含有26.3%(EPA+DHA)，表明磷脂的相對含量很高。將乙醇洗滌的磷奸用含有10%乙醇的C02提取。得到2.2%的提取物(基于起始的磷奸)。分析(TLC和NMR)表明提取物含有磷脂、甘油三酯和奸青素。然而，因為提取物僅含8.1。/。(EPA+DHA)，因此磷脂含量很低。實施例4將新鮮的swp^^a用與上述相同的2步方法處理，除了在洗滌步驟中乙醇的量增加到4:1。相對于原料乙醇提取物為7.2%，而超臨界流體提取物為2,6%。實施例5使新鮮的^/^Aa(200g)與分子篩(A3，280g)接觸以從磷蝦原料去除水分。用含10%乙醇的C02提取得到5.2%的提取物(從磷蝦的起始重量計算)。分析表明提取物含有甘油三酯、磷脂和蝦青素。被提取的整個磷蝦完全為白色，除了黑色的眼睛外。實施例5表明去除水分的作用。選擇分子篩作為乙醇的替代。這些實施例不是為了限制用于去除水分的可能試劑。分子篩和其它干燥劑作為凍干處死的替代物是溫和的和經濟的。實施例6如實施例2,將新鮮的(200g)用乙醇(l:l)洗滌，不同之處在于原料已經在80。C預處理了5分鐘。得到7.3%的乙醇提取物。使用含10%乙醇的C02的超臨界流體提取得到2.6%額外的提取物(從新鮮原料計算)。總提取物為9.9%，且分析(TLC,NMR)表明提取物富含磷脂，且還含有甘油三酯和奸青素。剩余的整個磷奸完全為白色，除了黑色的眼睛外。實施例7將新鮮的Ewpe^a(12kg)加熱至80°C，保持幾分鐘，然后用乙醇(26kg)提取。得到0.82kg(7。/。)乙醇提取物。脂質類型分析(HPLC;柱AlltimaHP硅膠3(mi;檢測器DEDLSedere;溶劑氯仿/曱醇)表明磷脂的含量為58%。GC分析(面積％)表明EPA含量為24.0%，且DHA含量為11.4%,EPA+DHA的總和=35.4%。剩余的磷蝦在280巴和50。C下用含乙醇(15kg)的C02(156kg)提取。得到0.24kg(2%)提取物。剩余磷壞為白色，除了黑色的眼睛外。脂質類型的分析表明磷脂含量為19%。提取物含有8.9%EPA和4.8%DHA(總計13.7%)。剩余磷蝦物質的提取(Folch方法)表明脂質含量僅為0.08kg(相對于起始磷蝦重量的0,7%)。這意味著基本上所有脂質已經被提取。實施例8將新鮮的五.s甲^Z^(12kg)用乙醇(33kg)提取，而不用加熱處理。得到0.29kg(2.4%)的提取物。如上所述的脂質類型的分析表明磷脂含量為28.5%。結果表明與沒有進行加熱的相同處理相比，熱處理增加了脂質的產率。原料熱處理后，1份(重量)乙醇得到與不用熱處理的4份乙醇相同的結果。而且，與沒有熱處理的乙醇處理相比，熱處理使得乙醇提取物更加富含磷脂和Q-3脂肪酸。本發明的加熱時間不應限制在實施例的范圍內。本領域^^支術人員會i人識到對于監測大量生物原料的精確加熱時間是很難的。因此，加熱時間可根據將被加工特定時間的磷奸的量而變化。同樣，預加熱使用的溫度不限于實施例中給出的溫度。實驗表明預加熱至95。C與預加熱至80。C相比步驟a)中的脂質產率更高。而且，對于大量磷蝦，很難在所有磷蝦物質中精確地獲得相同的溫度。熱處理得到額外的結果，其使得高度活潑的磷奸消化酶失活，降低了可能的脂質水解。實施例9圖1所示的為用作提取原料的E^pe/^a的圖。圖2表示如實施例7提取后的物質。其它實施例在提取后給出了非常相似的物質。將提取后的磷蝦干燥，且其可容易地制成粉末，甚至通過手指手工碾壓。該脫脂粉末含有蛋白質，以及殼聚糖和來自磷蝦的其它非脂質成分。該粉末聞起來與干魚卵相似。由于該粉末基本上不含脂質，因此其將得到基本上沒有氧化的多不飽和脂肪酸的粉。這與通過傳統方法制備的磷奸粉相比具有很大不同，在傳統方法中基本上所有的磷脂級分將保留在餐中，而增加氧化的和聚合的物質。因此，當用于水產伺養時，與傳統磷壞粉或魚餐相比，根據本方法制備的磷蝦粉的氧化應激低很多。該磷蝦粉也將非常適合祠養曱殼類動物(包括龍蝦)，和飼養野生捕獲的帝王蟹(KingCrabs,Para/油ocfescom&c/za"c")以提高蟹肉的質量和數量。由于該餐基本上不含聚合的脂質，所以其對于制備高質量殼聚糖也是有利的，且適合用于需要高質量餐的其它加工。由于磷奸脂質氧化非常迅速，且在常用溶劑中變得溶解性較差，所以本領域技術人員會認識到類似的高質量磷蝦粉不可能通過使傳統磷奸粉脫脂(例如使用有機溶劑)而得到。ii本領域技術人員會認識到上述方法也可以用于非磷蝦的其它原料，例如從魚性腺或從Ca/"m^物種中分離富含Q-3的磷脂。一些磷蝦物種富含蠟酯(例如co^to〃w7/z/as),且該情況也出現在Ca/am物種中。本領域技術人員會認識到過上述加工，蠟酯將濃縮至非極性脂質級分中。而且，本領域技術人員會認識到上述方法步驟的組合可以用于分離磷奸的極性(即磷脂)和非極性脂質。也可能根據上述實施例之一進行夠提取磷蝦的總脂質，然后對該中間產物進行二次提取以分離各脂質類型。例如，用純二氧化碳提取將從富含Q-3的磷脂移出非極性脂質。在另一個實施方案中，本發明的方法用于提取磷蝦粉，其條件是該磷蝦粉采用足夠溫和的方法制備以避免磷奸脂質的變質。本領域技術人員會認識到上述方法能夠用于提取其它海洋原料，例如魚性腺和Ca/a"w物種。與已知的磷奸油產品(通過常規方法制備)相比，源自本發明方法的脂質級分或脂質產物具有一些質量相關的其它優點，所述已知的磷蝦產品例如從曰本磷壞源(非特定的物種)提取的來自NeptuneBiotechnologies&Bioresources的石岸蟲下油具有下述組分總磷脂酯化的奸青素維生素A維生素E維生素D總Q-3EPADHA^40.0%土l.Omg/g^1.0IU/g^0.005IU/g^0.1IU/g^30.0%^15.0%>9,0%本發明的脂質產物和級分與常規方法制備的脂質相比，基本上不含水解和/或氧化的脂質，與常規方法相比，磷壞脂質抗氧化劑的變質更少，含有非常低含量的游離脂肪酸，和/或基本上不含有機溶劑。"氧化的"脂質是指初級氧化產物(通常作為過氧化物值測量)，二級氧化產物(通常為羰基產物，一般分析茴香胺值)，和三級氧化產物(寡聚物和聚合物)。因此，本發明包括通過本發明的方法之一制備的商業脂質或磷蝦油產口c。產品如(例如食品補充劑(supplenent)，Superba(AkerBioMarine,Norway))可通過本發明的方法制備。本領域技術人員會認識到相對于由統磷奸粉的傳統提取制備的產品，通過本發明方法制備的產品的質量得到了改善。而且，通過本發明的方法得到的脂質組合物的實例見于下表中，該組合物也包括在本文中。表2脂質組合物磷脂>30-40%重量EPA>5-15%重量DHA>5-15%重量根據本發明，提取物可根據磷脂的含量進行濃縮。一些典型的脂質組合物示于表3-5中，且它們也包括在本文中。表3脂質組合物磷脂^50%重量EPA二15%DHA^10%如實施例7所示，表3中所示的脂質組合物也可以通過僅使用本發明的步驟a)提取得到。13表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本發明不應限制在所示實施方案和實施例中。權利要求1.一種從新鮮磷蝦中提取基本上全部脂質級分的方法，包括下述步驟a)降低磷蝦原料的水含量；和b)分離脂質級分。2.權利要求1的方法，其中步驟a)包括用重量比為1:0.5至1:5的乙醇、曱醇、丙醇或異丙醇洗滌磷壞原料；和步驟b)包括從醇中分離脂質級分。3.權利要求1或2的方法，其中步驟a)包括用乙醇洗滌磷奸原料；和步驟b)包括從乙醇中分離脂質級分。4.權利要求1-3中任一項的方法，進一步包括下述處理步驟a-l)在超臨界壓力下用含乙醇、曱醇、丙醇或異丙醇的C02提取來自步驟a)的水含量降低的磷奸物質。5.上述權利要求中任一項的方法，其中在洗滌前將磷蝦原料加熱至60-100°C。6.權利要求5的方法，其中在洗滌前將磷蝦原料加熱至70-100。C。7.權利要求5或6的方法，其中在洗滌前將磷蝦原料加熱至80-95。C。8.權利要求5-7中任一項的方法，其中在洗滌前將磷蝦原料加熱約1-40分鐘。9.權利要求8的方法，其中在洗滌前將磷蝦原料加熱約l-15分鐘。10.權利要求8或9的方法，其中在洗涂前將磷奸原料加熱約1-5分鐘。11.權利要求l的方法，其中步驟a)包括使磷蝦原料與分子篩接觸。12.權利要求l的方法，其中步驟a)包括使磷奸物質與吸水膜接觸。13.權利要求1的方法，其中步驟a-l)中乙醇、甲醇、丙醇或異丙醇的量為5-20%重量。14.權利要求13的方法，其中步驟a-l)中乙醇、曱醇、丙醇或異丙醇的量為10-15%重量。15.基本上全部脂質級分，其包含通過權利要求1-14的方法可得到的甘油三酯、蝦青素和磷脂。16.權利要求15的脂質級分，其基本上不含氧化的脂質。17.權利要求15或16的總脂質級分，其用作藥物和/或食品補充劑。18.—種從其它脂質分離磷脂的方法，包括用純二氧化碳，或含少于5%乙醇、曱醇、丙醇或異丙醇的二氧化碳提取權利要求1-14的方法得到的總脂質級分。19.磷脂級分，其可通過權利要求18的方法得到。20.權利要求19的磷脂，其中所述磷脂進一步被酯交換或水解。21.權利要求19的磷脂，其中Q-3脂肪酸的含量為至少40%重量。22.—種制備磷蝦粉的方法，包括根據權利要求1-14的方法提取基本上全部脂質級分；和分離剩余的磷蝦原料。23.磷蝦粉，其可通過權利要求22的方法得到，其中該餐基本上不含氧化的多不飽和脂肪酸和其它脂質。24.權利要求23的磷奸粉在動物飼養中的用途。25.權利要求23的磷蝦粉在水產飼養中的用途。26.權利要求23的磷奸粉在飼養海洋魚類包括魚幼體和魚苗中的用途。27.權利要求26的磚蝦粉的用途，其用于飼養曱殼類動物。28.權利要求23的磷蝦粉在制備高質量殼聚糖中的用途。全文摘要本發明涉及從新鮮磷蝦制備基本上全部脂質級分的方法，從其它脂質分離磷脂的方法，以及制備磷蝦粉的方法。文檔編號C11B1/10GK101652462SQ200780049968公開日2010年2月17日申請日期2007年11月15日優先權日2006年11月16日發明者哈拉爾德·布賴維克申請人:普羅諾瓦生物醫藥挪威公司