專利名稱：輔酶Q₁₀的美白、祛斑功能及其在化妝品中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及美容和化妝品領域，特別是涉及包含輔酶Qltl的美容學和/或皮膚病學組合物，以及輔酶Qltl作為皮膚的美白、祛斑功能的功效添加劑的用途。本發明還提供了用于降低皮膚異常色素沉著的藥品添加劑。本發明還涉及細胞生物學領域，尤其是利用黑色素細胞進行美白實驗的領域。
背景技術：
輔酶Qltl (CoQltl)又名泛醌10，是一種脂溶性醌，其結構類似于維生素K，因其母核六位上的側鏈——聚異戊烯基的聚合度為10而得名，是一種醌環類化合物。CoQltl廣泛被熟悉的功能如下:(1)細胞線粒體電子傳遞鏈的遞氫體，在能量轉化過程中具有重要作用，而線粒體是細胞的“能量工廠” (Brandt U 和 Okun JG.，Biochemistry 1997 ；36:11234-11240 ；Okun JG, Lummen P 和 Brandt U.，J Biol Chem.1999 ；274:2625-2630.) ； (2)脂溶性抗氧化劑，保護細胞膜和重要的細胞器，減少氧化應激損傷。該物質在動植物、微生物細胞內廣泛存在。人體輔酶Qltl的含量主要取決于食物補充和體內合成。據報道，體內輔酶Qltl含量隨年齡增長而下降，20歲時達到高峰，77歲的老人比20歲年輕人心肌中的輔酶Qltl減少了58%。近年來，CoQltl在醫學上廣泛用于心血管系統疾病，在營養保健品及食品中廣泛被添加其中。隨著護膚品功效物質的大量需求，人們對CoQltl在皮膚生物學方面的功能也進行了大量的研究。目前已經報道的相關CoQltl功能有抗氧化，抗衰老以及抗炎癥反應。CoQ1q、維生素E和抗壞血酸(維生素C)是目前被發現皮膚中存在的抗氧化劑(Y.Shindo,E.Witt,D.Han, ff.Epstein 和 L.Packer, Journal of Investigative Dermatology 1994 ; 102:122-124.)。已經證明，CoQltl能夠有效地降低UVA介導的人角質細胞氧應激，其作用機制是通過巰基的耗竭，特定磷酸激酶的激活和預防DNA的氧化損傷(U.Hoppe, J.Bergemann,W.和 Diembeck，J.等，BioFactors.1999 ；9:371-378.)。而且，CoQltl 可以通過抑制成纖維細胞基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的產生而減少臉部皺紋的形成(Inui, M.，Ooe, M.和 Fujii, K.等，Biofactors.2008 ；32:237-243.);能夠增加人真皮層的成纖維細胞數量，促進基底膜IV和νπ型膠原的表達，以及減少眼部皺紋的深度(Muta-Takada K, Terada T 和 Yamanishi H 等，Biofactors.2009 ;35 (5):435-41.)。這些研究表明，CoQltl具有抗皮膚老化的生物學功能。另外，CoQltl又被報道能夠降低由UVR和IL-1介導的炎癥因子IL-6和PGE-2的產生，指出了可能具有抗炎反應的作用(Fuller，B.，Smith, D.和 Howerton, A.等，J.Cosmet.Dermatol.2006 ；5:30-38.)。
盡管CoQltl已作為化妝品的功效添加劑用于改善皮膚的各種功能，但是CoQltl是否能夠直接抑制黑色素合成的美白作用目前仍未被指出。眾所周知，黑色素沉著是皮膚顏色和著色的主要原因。黑色素是由位于表皮與真皮之間的黑色素細胞產生并存在于其內的黑色素生成顆粒(黑素體)中，生成的黑色素通過滲透作用向相鄰上皮細胞擴散。該黑色素細胞內黑色素生成的生化反應推測如下述那樣發生。黑色素的生成過程:作為必需氨基酸的酪氨酸(tyrosine)在酪氨酸酶(tyrosinase)的作用下形成多巴醌,其在酶或者非酶的氧化作用下，經紅色色素和無色色素變化為黑色的黑色素。其中酪氨酸酶是黑色素合成中的限速酶，也是人們研發抑制黑色素生成的主要作用靶點。一直以來期待開發出具有安全性或減少皮膚刺激的美白劑。而作為體內存在的抗氧化劑，CoQltl在黑色素合成過程中發揮的作用還不清楚。因此，本發明的目的是提供一種美容學和/或皮膚病學組合物，用于淡化皮膚生成的色素沉著，并且安全可靠。

發明內容
本發明人為了達到上述目的進行了深入研究，意外地發現CoQltl在黑色素合成過程中的新功能。本發明通過一系列實驗證明CoQltl具有抑制黑色素細胞黑色素合成及酪氨酸酶活性的作用，顯示出對色素沉著的淡化有著優異的效果。將CoQltl添加入化妝品中可使化妝品具有美白、祛斑功效，也能夠作為降低皮膚異常色素沉著的藥品添加劑。色斑是面部容易看到的黑色素沉著的代表，在臨床上它是一種色素沉著性皮膚病。常見的色素沉著性皮膚病如雀斑(遺傳性)、黃褐斑(內分泌性)、曬斑(炎癥性)、瑞爾黑變病(代謝性)等。因其影響美觀，越來越多的患者迫切要求治療，因而產生大量的美白祛斑產品，其中以安全，刺激性小，副作用小的產品倍受歡迎。而CoQltl是一種體內正常存在的、天然的物質，其美白功能的發現將會帶來廣泛的市場應用前景。目前在篩選美白祛斑劑中通常采用一些客觀的、經典的方法，即在細胞水平檢測黑素細胞增殖率、黑色素含量、酪氨酸酶活性、及通過顯微鏡觀察黑素細胞型態等(張建友，方艷燕，吳曉琴，張英；精細化工，2008，25 (I)，72-76)。在細胞選擇上通常采用小鼠B16細胞株，B16細胞的黑色素合成功能與人正常的皮膚黑色素細胞基本一致，在人體原代皮膚黑色素細胞培養非常困難的情況下，國內外化妝品生產企業的科研部門在篩選美白劑的過程中，廣泛采用該細胞株 作為美白化學物功效測定的受試細胞。黑色素含量測定是美白化學物功能評價的最重要檢測指標。到目前為止，一直采用生物化學-分光光度法測定黑素細胞中的黑色素含量，此方法經典穩定。從國外文獻來看，評價美白化妝品的功效主要以檢測施加美白化妝品有效成分后，是否抑制酪氨酸酶活性為主要手段，而酪氨酸酶活性檢測方法有放射性同位素法、免疫學法和生化酶學法，其中以生化酶學法較為簡單成熟。酶的材料來源可以從蘑菇中得到的酪氨酸酶，也可以從B16黑色瘤細胞或動物皮膚中得到。細胞毒性的測定通常采用MTT方法，由于MTT方法在細胞操作中的繁瑣性，經技術改進后，目前經常使用CCK-8檢測試劑盒進行細胞增殖和毒性的測定。本發明就是采用上述常用和經典的方法進行CoQltl美白祛斑功效的評估。在本發明中，通過如下步驟測定表明CoQltl是否具有抑制黑色素細胞黑色素合成及酪氨酸酶活性的作用:1.CoQ1。用乙醇或DMSO溶解。2.研究采用的細胞選用小鼠黑色素瘤細胞株B16。3.B16黑色素細胞用低血清培養基(1%、2%、3%或5%特優胎牛血清(Hyclone，Australia)的DMEM(Gibco，USA)培養基)，調整細胞濃度為4-10X IO4/孔，接種于24孔細胞培養板中，在37°C、5%二氧化碳培養箱中培養24h后加入步驟I所述的CoQltl溶液，CoQltl終濃度為0.5 μ M、I μ M或2 μ M。4.步驟3所述細胞在終濃度為0.5μΜ、1μΜ或2μΜ CoQltl的低血清培養基中、37°C、5% 二氧化碳培養箱中培養72h后，再用CCK-8試劑盒(Dojindo Laboratorise,Japan)檢測每孔細胞數量，進行細胞毒性檢測。5.步驟3所述細胞在終濃度為0.5μΜ、1μΜ或2yMCoQ1(l的低血清培養基中、37°C、5%二氧化碳培養箱中培養72h后，再用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，中國)檢測每孔細胞的總蛋白含量。6.用步驟4所述細胞進行黑色素含量檢測:
除去培養液，PBS沖洗后用0.25%的胰酶消化細胞，250 μ L/孔，細胞脫壁后加入250 μ L/孔的添加10%特優胎牛血清的DMEM培養基終止消化。 混勻細胞，轉移至1.5mL離心管中，13，800g離心lOmin。完全去除上清液，開蓋倒置離心管，室溫放置2h左右直至培養基完全干燥。 加入 150 μ L/ 孔的 IN NaOH，85°C金屬浴 15min。 冷卻至室溫后，混勻，轉移至96孔板中，酶標儀檢測，吸收波長為405nm。7.用步驟3處理后的細胞進行酪氨酸酶活性檢測: 用PBS洗細胞，之后加入I % triton, 200 μ L/孔，室溫處理20min。.1% triton處理細胞后，將細胞裂解液轉移至96孔板中，IOOyL/孔。加入100 μ L 0.1% DOPA/ 孑L。.96孔板放入酶標儀中，490nm檢測波長，30min檢測一次，檢測3h。8.步驟2所述細胞在終濃度為0.5μΜ、1μΜ或2μΜ CoQ10的低血清培養基中培養72h后進行DOPA染色 去除培養基，用PBS洗細胞，500 μ LX 3遍。 每孔加入500 μ L 10%甲醛溶液固定細胞5-10分鐘。 去除甲醛溶液，用PBS洗細胞，ImLX 3遍，每孔加入500 μ L 0.1% DOPA溶液，37°C孵育4-5小時。中間可更換DOPA溶液1_2次。 用PBS洗細胞，ImLX3遍。用倒置顯微鏡拍照保存。因此，本發明的目標在于用于局部應用的組合物，其在美容學和/或皮膚病學上可接受的介質中包含輔酶Q1(l。所述輔酶Qltl以游離的形式或者以美容學和/或皮膚病學上可接受的形式存在，所述美容學和/或皮膚病學上可接受的形式如近年來開發出的各種水溶性輔酶Qltl,包括但不限于通過脂質體技術，包合技術，自乳化技術，納米粒技術，固體分散技術，微乳技術等產生的水溶性輔酶Q1(1。并且其存在量使得它具有使皮膚美白、祛斑的活性和降低皮膚異常色素沉著的活性。根據本發明，所述組合物可以以適合于局部使用的任何形式存在，尤其是以水包油的簡單乳劑或者水包油包水或油包水包油的多重乳劑、凝膠劑、溶液、軟膏的形式或者以小球的分散體的形式存在。這些組合物根據美容學領域中的常用方法來進行制備。作為輔助劑的例子，可以尤其提及表面活性劑、膠凝劑、防腐劑、香料、填充劑、著色劑、增稠劑、乳化劑、濕潤劑、香料、染料、色素和其他活性物質。
本發明的目標還在于根據本發明的組合物用于保護皮膚以對抗與黑色素增加相關的癥狀的用途。本發明的目標還在于根據本發明的組合物用于使皮膚增加美白、祛斑和/或降低皮膚異常色素沉著的用途。本發明還涉及皮膚的美容處理方法，其特征在于，所述方法在于在皮膚上應用根據本發明的組合物；和輔酶Qltl在美容學和/或皮膚病學組合物中作為皮膚增加美白、祛斑的功效添加劑和降低皮膚異常色素沉著的藥品添加劑的用途。下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。


圖1.顯示CoQltl對B16細胞黑色素合成、酪氨酸酶活性及DOPA染色的影響。B16細胞用不同濃度的CoQltl(0.5μΜ、1μΜ*2μΜ)及陽性對照維生素C的鈉鹽(0.5mM)處理72h。(a)CCK-8檢測相對細胞數量，即細胞毒性檢測。(b)酶標儀檢測黑色素含量，結果用細胞數量測定的酶標儀吸光光度值進行校正。(c)細胞裂解后加入D0PA，酪氨酸酶可將DOPA氧化為褐色的物質，用酶標儀進行檢測，結果用細胞總蛋白量進行校正。(d)細胞固定后用DOPA進行染色，倒置顯微鏡觀察并拍照，比例尺:100μπι。結果以溶劑處理組為對照，以平均值+SD表示。與對照相比，*ρ < 0.05廣P < 0.01。 實施例實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例1.黑色素檢測Β16黑色素細胞用低血清培養基調整細胞濃度為4 X IO4/孔，接種于24孔板中。過夜培養后換用加入不同濃度(:001(|(0.5111、1111或2111)的低血清培養基。以最高CoQltl濃度時的乙醇含量為標準，各孔間補足乙醇的量，即各孔間乙醇含量相同，只有CoQltl濃度不同。CoQltl作用72h后，除去培養液，用PBS洗一次，加入200yL含10% CCK-8檢測試劑的低血清培養基，37°C，5% 二氧化碳培養箱孵育50min左右，再將孵育后的培養液轉入96孔板中檢測，檢測波長450nm。CCK-8檢測結果表明，三個濃度CoQltl處理組對細胞數量均無影響，即無細胞毒性；而作為對照的維生素C鈉鹽(Vc-Na)，雖然是公認的美白劑，但在其發揮作用的濃度下對細胞具有一定毒性。結果參見附圖1(a)。進行CCK-8檢測后的細胞，用PBS沖洗，再加PBS孵育細胞Ih左右，以完全溶出CCK-8檢測試劑，再進行黑色素檢測。檢測方法如下: 用0.25 %的胰酶消化細胞，200 μ L/孔，細胞脫壁后加入300 μ L/孔的添加10 %特優胎牛血清的DMEM培養基終止消化。 混勻細胞，轉移至1.5mL離心管中，13800g離心lOmin。完全去除上清液，開蓋倒置離心管，放置2h左右直至培養基完全干燥。 加入 150 μ L/ 孔的 IN NaOH，85°C金屬浴 15min。
冷卻至室溫后，混勻，轉移至96孔板中，酶標儀檢測，吸收波長為405nm。檢測得到的黑色素含量用CCK-8檢測的結果進行校正，得到單位數量細胞中黑色素含量。結果顯示加入CoQltl后，黑色素合成下降，且與CoQltl濃度呈劑量依賴關系。結果參見附圖1(b)。實施例2.酪氨酸酶活性檢測B16黑色素細胞用低血清培養基調整細胞濃度為4X104/孔，接種于24孔板中。37°C、5%二氧化碳培養箱過夜培養后換用加入不同濃度CoQltl的低血清培養基。以最高CoQltl濃度時的乙醇含量為標準，各孔間補足乙醇的量，即各孔間乙醇含量相同，只有CoQltl濃度不同。酪氨酸酶檢測方法如下: 用PBS洗細胞，之后加入I % triton, 120 μ L/孔，室溫處理20min。.I % triton處理細胞后，將細胞裂解液轉移至96孔板中，80 μ L/孔，即每24孔板處理孔對應2個96孔板的孔。加入80 μ L 0.1% DOPA/孔。.96孔板放入酶標儀中，490nm檢測波長，30min檢測一次，檢測3h。用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測酪氨酸酶剩余的細胞裂解液中總蛋白的含量，每孔需20 μ L裂解液。酪氨酸酶活性檢測結果用總蛋白含量進行校正，得到單位細胞數量中酪氨酸酶活性。結果顯示加入CoQltl后，酪氨酸酶活性合成下降，且與CoQltl濃度呈劑量依賴關系，參見附圖1(c)。實施例3.DOPA染色將實施例1中所述的Β16黑色素細胞加入不同濃度CoQltl (0.5 μ Μ，I μ Μ，2 μ Μ)的低血清培養基、在37°C、5%二氧化碳培養箱中培養72h后進行如下步驟: 去除培養基，用PBS洗細胞，500 μ LX 3遍。 每孔加入500 μ L 10%甲醛溶液固定細胞5-10分鐘。 去除甲醛溶液，用PBS洗細胞，ImLX 3遍，每孔加入500 μ L 0.1% DOPA溶液，37°C孵育4-5小時。中間可更換DOPA溶液1_2次。 用PBS洗細胞，ImLX3遍。用 倒置顯微鏡拍照保存。DOPA染色結果顯示，與未加CoQltl的對照相比，CoQltl處理組(0.5 μ M、I μ M或2 μ M)部分Β16細胞中黑色素的含量明顯降低，細胞如被漂白了一樣；而且隨著CoQltl處理濃度的增加，大多數細胞中的黑色逐漸變淡，具有劑量依賴性。結果參見圖1(d)。
權利要求
1.關于局部應用的組合物，其在美容學和/或皮膚病學上可接受的介質中包含輔酶Q10,所述輔酶Qltl以游離的形式或者以美容學和/或皮膚病學上可接受的形式存在，并且其存在量使得它具有使皮膚美白、祛斑的活性和降低皮膚異常色素沉著的活性。
2.根據權利要求1的組合物，所述美容學和/或皮膚病學上可接受的形式是水溶性輔酶Qltl,包括但不限于通過脂質體技術，包合技術，自乳化技術，納米粒技術，固體分散技術，微乳技術產生的水溶性輔酶Qltl。
3.根據前述權利要 求中任一項的組合物，其特征在于，它以乳劑、凝膠劑、溶液、軟膏的形式或者以小球的分散體的形式存在。
4.根據前述權利要求中任一項的組合物，其特征在于，它還包含親水性或親脂性的輔助劑。
5.根據權利要求4的組合物，其特征在于，所述輔助劑選自膠凝劑、防腐劑、香料、填充劑、著色劑、增稠劑、乳化劑、濕潤劑、香料、染料、色素和其他活性物質。
6.根據前述權利要求中任一項的組合物用于保護皮膚以對抗與黑色素增加相關的癥狀的用途。
7.根據前述權利要求中任一項的組合物用于使皮膚增加美白、祛斑和/或降低皮膚異常色素沉著的用途。
8.膚的美容處理方法，其特征在于，所述方法在于在皮膚上應用根據權利要求1至5中任一項的組合物。
9.酶Qltl在美容學和/或皮膚病學組合物中作為皮膚增加美白、祛斑的功效添加劑或降低皮膚異常色素沉著的藥品添加劑的用途。
全文摘要
本發明提供了輔酶Q10的美白、祛斑功能及其在化妝品中的用途。本發明實驗證實了CoQ10能夠抑制B16細胞黑色素的合成，以及抑制酪氨酸酶的活性。因此，CoQ10除了可以作為抗氧化和抗衰老劑添加到化妝品中，也可作為美白成分應用于化妝品中(包括美白爽膚水、面霜、面膜等)，或作為藥品用于治療色素過度沉著異常。
文檔編號A61Q19/02GK103083198SQ20111034457
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月27日 優先權日2011年10月27日
發明者趙仁濱, 張美姿, 黨磊 申請人:北京天辰空間生物醫藥研發有限公司