專利名稱：一種提取異養小球藻中性油脂的方法
技術領域：
本發明屬于可再生能源領域，特別涉及一種提取異養小球藻中性油脂的方法。具體說是將未經過干燥脫水的小球藻通過球磨機的機械破碎和超聲波的輔助傳質作用，在弱極性有機溶劑的浸潤中，破碎小球藻細胞壁，提取其中的油脂成分，最后經過中性有機溶劑的萃取精煉，得到的中性油脂，然后經轉酯化反應可以用于制備生物柴油。
背景技術：
面對世界范圍內石化燃料的逐步枯竭，尋找可再生的新一代能源正在成為全世界關注的重點。其中，微藻生物柴油被看作是最有競爭力的能夠徹底替代石化燃料并且不影響糧食和其他農產品生產的可再生液體生物燃料。與眾多能源植物相比，利用微藻生產液體生物燃料，具備大量吸收二氧化碳，緩解全球的溫室效應，生物油脂產量高，培養過程不占用耕地等諸多優點，但目前卻沒有成功的大規模產業化的范例，市場上也未見藻類生物柴油的供給，其主要原因是產生成本問題。清華大學微藻生物能源實驗室吳慶余課題組以優選的淡水綠藻Cholorella protothecoides 0710為藻種，對其進行代謝改造和培養優化，使其產生大量中性油脂， 用以制備生物柴油，該發明已發表多篇論文(l)Xu，H.，Miao, X.L，ffu, Q. Y. (2006)High quality biodiesel production from a microalga Chlorella protothecoides by heterotrophic growth in fermenters. Journal of Biotechnology,126 (4),499-507. (2) Xiong, W. , Li, X. , Xiang, J. , ffu, Q. Y. (2008)High-density fermentation of microalga Chlorella protothecoides in bioreactor for microbio—diesel production. Applied Microbiology and Biotechnology,78(1),29-36. (3)Xiong, W. ,Gao, C. F. ,Yan,D., ffu, C., ffu, Q. Y. (2010)Double C02 fixation in photosynthesis-fermentation model enhances algal lipid synthesis for biodiesel production. Bioresource Technology,101(7), 2287-2293.已申請專利CN101230364A “一種利用異養小球藻高密度發酵生產生物柴油的方法”CN101280328 “一種從自養到異養兩步培養小球藻生產生物柴油的方法”。為了降低小球藻生物柴油的總體生產成本，本課題組從生產的各個環節入手，進行工藝改進和優化。目前限制微藻生物柴油的低成本生產的瓶頸之一，是缺乏經濟高效規模化提取藻細胞油脂的方法。小球藻呈圓球形，細胞直徑在2 μ m左右，其細胞壁較普通微生物的細胞壁厚，整個細胞結構非常穩定和堅固，對破壁技術要求較高，加之小球藻為水生物種，水的存在也不利用中性油脂的提取。小球藻油脂的提油方法主要有干藻提油法和濕藻提油法。將收獲回來的濕藻先經過干燥處理，脫去水分。在干燥之后，用親脂溶劑萃取濃縮的生物質物質從而得到藻油。因此，提油技術的改進，對提高能量利用率，降低生產成本， 至關重要。由于干燥小球藻的過程能耗很高，且需要較長時間，所以出現了利用濕藻來提取其中油脂的方法，即濕藻提取法。需要指出的是，這里所說的濕藻是指經過初步的沉降和離心處理，但是沒有經過熱烘干的藻，含水量大約為61. 9士3.1% (水分重量/總重量)。目前，在微藻能源領域內，沒有可以用于工業化生產的濕藻油脂提取方法。本發明提供了一種大量提取小球藻油脂的方法，縮短了生產周期，簡化了工藝流程，能夠滿足工業化應用的要求。

發明內容
本發明的目的在于提供一種提取異養小球藻中性油脂的方法，其特征在于，利用球磨機的機械剪切力和超聲波的輔助傳質，借助弱極性有機溶劑的浸潤，破碎干燥小球藻 (干藻粉)細胞壁和未干燥脫水的小球藻(濕藻)細胞壁，使細胞中的油脂釋放到有機溶劑中，之后回收有機溶劑，蒸餾精制后得到中性油脂，用以制備生物柴油。以異養發酵培養的大量高油脂含量的小球藻為操作對象，具體步驟如下(1)離心收獲異養小球藻細胞；(2)在弱極性有機溶劑中對異養小球藻細胞進行球磨；(3)分離磨介球；(4)在弱極性有機溶劑中超聲波破碎異養小球藻細胞壁；(5)離心去除細胞碎片；(6)蒸發去除研磨溶劑；(7)加入抽提溶劑精煉。所述離心收獲異養小球藻細胞是對含有小球藻細胞的培養基進行離心，其異養小球藻細胞來自于異養高密度發酵的C. rotothecoides0710藻株，其質量比含油量為 20% -61%之間，其細胞干重為15-108g/L之間；所述進行離心的離心力RCF = 6000g, 4分鐘；除去多余液體，使濕藻細胞生物質的含水量介于60% -70% (藻細胞干燥至恒重的重量藻細胞干燥前的重量)；其中濕藻含水量測定方法如下取少量濕藻，測量重量 ml, -50°C冷凍干燥48小時直到恒重，得到干燥的藻粉，測定重量m2，最終得到濕藻的含水量。其含水量ω計算公式m = ml~m2 X 100%
ml經過多次實驗測定，絕大多數大容量工業化離心機都能夠對液體發酵培養的小球藻進行初步脫水，除去大部分的液體培養基，得到的濕藻質量比含水量約為61. 9士3. 1%, 然后采用但不限于冷凍真空干燥和熱烘干干燥藻細胞至恒量，對濕藻進一步干燥脫水，得到質量比含水量小于的干藻粉。所述異養小球藻細胞球磨，將藻粉、研磨溶劑和磨介球放入尼龍球磨罐中，按藻粉 (g)研磨溶劑(ml)磨介球(g)球磨罐容積(ml) = 30 30 (200-400) 500混合，在行星式球磨機上以100rpm-200rpm速度常溫球磨；其中，尼龍材質球磨罐為可密封的，研磨溶劑均為分析純的乙醇、異丙醇或正己烷；磨介球為直徑5mm-10mm的氧化鋯球；在異養小球藻細胞球磨處理時處理干藻細胞優選球磨2小時，處理濕藻時優選球磨12小時。所述用于洗脫的溶劑均選用分析純的氯仿、異丙醇和正己烷，研磨溶劑量洗脫溶劑量按體積比選1 10;洗脫時用2mm孔徑的篩網過濾分離磨介球。所述超聲波破碎藻/溶劑混合物，將球磨罐中的破碎藻細胞和異丙醇混合物按以下條件進行超聲功率600W，頻率20KHz，工作時間3秒，休息時間3秒，超聲總時間40分鐘。所述離心去除細胞碎片，選離心力RCF = 6000g，4分鐘，使細胞碎片全部沉淀，將上層萃取有小球藻油脂溶劑保留。所述蒸發去除研磨溶劑，65°C減壓蒸餾，完全蒸發并回收異丙醇，最后得到粗制小球藻中性油脂。
所述加入抽提溶劑精煉，加入正己烷抽提油脂(抽提溶劑量ml 研磨溶劑量ml =1 1)。靜置直到多糖、蛋白質等不溶物完全析出。分液后取上層抽提溶劑，60°C蒸發正己烷后得到粗制的小球藻中性油脂。
本發明的有意效果是它是在本實驗室已有的研究成果和專利技術基礎上，為滿足工業化生產小球藻油脂的應用要求而開發的細胞破碎和油脂提取的方法。本方法利用了工業上經常使用的球磨機和超聲波細胞破碎儀，在弱極性溶劑中快速提取小球藻油脂，同時適用于干燥和濕潤的兩類細胞，提取效率分別達到了 99. 27%和89. 61% (以索式油脂提取法提取到的油脂量為小球藻中性油脂標準含量)。同時用此方法得到的粗制中性油脂，99% 以上的成分可以轉化為生物柴油。設備和工藝具備放大的可行性，可以滿足工業化應用要求，是一條經濟、高效提取藻類油脂的途徑。


圖1不同研磨溶劑，對中性油脂提取率的影響
圖2不同洗滌溶劑，對中性油脂提取率的影響
圖3電子掃描顯微鏡下觀察到的細胞破碎情況，其中，A、C是未進行球磨的小球藻細胞，B、D是提取油脂后的小球藻細胞碎片；A、B是2000倍放大，C、D是15000倍放大。
具體實施方式
本發明提供了一種提取異養小球藻中性油脂的方法，利用球磨機的機械剪切力和超聲波的輔助傳質，借助弱極性有機溶劑的浸潤，破碎小球藻細胞壁，以異養發酵培養的大量高油脂含量的小球藻為操作對象，分干藻和濕藻兩條路線分別進行，它是在已有的研究成果和專利技術基礎上，利用球磨機的機械剪切力和超聲波的輔助傳質，借助弱極性有機溶劑的浸潤，破碎小球藻細胞壁的工藝，能從大量高含油量的小球藻細胞中提取用于制備生物柴油的中性油脂，以滿足工業化應用要求。下面舉實施例對本發明予以進一步說明。
實施例1
異養小球藻選用C. protothecoides 0710 (清華大學生命科學學院微藻生物能源實驗室申請的“一種利用異養小球藻高密度發酵生產生物柴油的方法CN101230364A”)，通過高密度異養發酵技術使其富含大量中性油脂。藻細胞密度高于sogr1的發酵液以離心力 6000g離心4分鐘，使異養小球藻細胞充分沉淀，去除上清液，加入少量清水，震蕩使細胞重懸，再以離心力6000g離心4分鐘，使異養小球藻細胞充分沉淀，去除上清液，再重復一次上述操作，達到充分去除培養液、洗滌藻細胞的目的。取濕藻30.00g，-50°C冷凍干燥48小時直到恒重，得到干燥的藻粉重10. 23g，得到濕藻的含水量為65. 9wt%。
取IOg干藻粉和IOg 二氧化硅混合，放入高速粉碎機中充分研磨，進行索式油脂提取(參見國家標準NY/T 4-1982)，得到5. 089g藻油，則含油量為50. 89wt%，以此作為小球藻細胞內的中性油脂標準含量。
實施例2
將濕藻_50°C冷凍干燥48小時至恒重，得到干燥的藻粉(含水量< )。在行星式球磨機上進行干藻粉球磨將30g干藻粉、分別和30ml研磨溶劑(乙醇、異丙醇或正己烷)混合，再分別加入200g、400g (直徑5mm-10mm)的氧化鋯磨介球，放入容積500ml的球磨罐中，適當混勻后，安裝在行星式球磨機上進行對比實驗，以IOOrpm轉速分別球磨0. 5、1、 2、4、6小時。加入300ml抽提溶劑(氯仿、異丙醇或正己烷)到球磨罐中，用2mm孔徑的濾網過濾分離磨介球，得到藻碎片/溶劑混合物。將藻碎片/研磨溶劑混合物以6000g離心力離心4分鐘，保留上層液體，65°C減壓蒸餾，直至溶劑完全去除。加入30ml正己烷抽提油脂。靜置直到多糖、蛋白質等不溶物完全析出。分液后取上層液體，蒸發溶劑后得到粗油。 通過對比提取率，最后優選2小時為最佳球磨時間，異丙醇為最佳研磨溶劑，200g磨介球為最適裝載量，得粗油15. 161g。油脂提取率=15. 161g/(30X50. 89% ) = 99. 27%
實施例3
未經干燥處理的濕藻，球磨優化如下將30g濕藻(含水量為61. 9士3. )，分別和30ml研磨溶劑(乙醇、異丙醇或正己烷)混合，再分別加入200g、400g (直徑5mm-10mm) 的磨介球到容積500ml的球磨罐中，適當混勻后，安裝在行星式球磨機上進行對比實驗，以 IOOrpm轉速分別球磨6、12、M小時。加入300ml抽提溶劑(氯仿、異丙醇或正己烷)到球磨罐中，用2mm孔徑的濾網過濾分離磨介球，得到藻碎片/溶劑混合物。將此混合物按照以下條件進行超聲波破碎功率600W，頻率20KHz，工作時間3秒，間隔時間3秒，總時間40分鐘。隨后將藻碎片/研磨溶劑混合物以6000g離心力離心4分鐘，保留上層溶劑，65°C減壓蒸餾，直至溶劑完全蒸發。加入30ml正己烷抽提油脂。靜置直到多糖、蛋白質等不溶物完全析出。分液后取上層液體，蒸發溶劑后得到粗油。通過對比提取率，最后優選12小時為最佳球磨時間，異丙醇為最佳研磨溶劑，200g磨介球為最適裝載量，得粗油4. 665g。油脂提取率=4. 665g/(30gX (1-65. 9% ) X50. 89% ) = 89. 61%
實施例4
10倍體系放大實驗中處理干藻粉的具體流程如下將300g干藻粉(含水量 < 和300ml異丙醇(因球磨后溫度較高，正己烷易揮發，綜合考慮提取率和回收率， 優選異丙醇)混合，再加入2kg不同直徑(5mm-10mm)的磨介球放入容積5L的球磨罐中， 適當混勻后，安裝在行星式球磨機上進行球磨，以200rpm轉速分別球磨2小時。加入3L 異丙醇到球磨罐中，用2mm孔徑的濾網過濾分離磨介球，得到藻碎片/溶劑混合物。接下來按照小型優化實驗的操作進行粗油的提取，最后得粗油130. lg。油脂提取率=130. Ig/ (300gX50. 89% ) = 85. 2%
實施例5
10倍體系放大實驗在臥式球磨機中進行，處理濕藻的具體流程如下將300g濕藻(含水量為61.9 士 3.1%)和300ml異丙醇(因球磨后溫度較高，正己烷易揮發，綜合考慮提取率和回收率，優選異丙醇)混合，再加入2kg不同直徑(5mm-10mm)的磨介球放入容積5L的球磨罐中，適當混勻后，安裝在行星式球磨機上進行球磨，以200rpm轉速分別球磨12小時。加入3L異丙醇(因超聲時溫度較高，正己烷易揮發，綜合考慮提取率和回收率，優選異丙醇)到球磨罐中，用2mm孔徑的濾網過濾分離磨介球，得到藻碎片/溶劑混合物。之后采用循環式超聲波破碎儀對混合物進行超聲破碎，超聲條件如下功率 600W，頻率20KHz，工作時間3秒，間隔時間3秒，總時間40分鐘，循環流速IL分鐘Λ接下來按照小型優化實驗的操作進行粗油的提取，最后得粗油37. 6g。油脂提取率=37. 6g/ (300gX (1-65. 9% ) X50. 89% ) = 72. 3%
實施例6
取球磨處理前的小球藻細胞和提取油脂后的小球藻細胞碎片，分別用(ν/ν) 50%, 75%、90%和100%的乙醇進行梯度脫水，每種濃度處理1小時，最后靜置使乙醇自然揮發。 將脫水后的樣品置于導電膠上，噴鍍一層薄金制片，放入掃描電子顯微鏡進行觀察。觀測如圖2所示，其中A、C是未進行球磨的小球藻細胞，B、D是提取油脂后的小球藻細胞碎片；Α、 B是2000倍放大，C、D是15000倍放大。
實施例7
用氣相色譜法分析提取的粗油中可轉化為生物柴油的組份比例。先配制酯化反應液甲醇 CH3OH, 97% (ν/ν) ；^cH2SO4, 3% (ν/ν)；癸酸 CH3 (CH2) 8C00H2，反應在防爆酯化管內進行，取10 15mg精制的小球藻油脂(主要成分甘油三酯)，作為標準；取 20 30mg的待測粗油，作為分析樣品，記下分組數據。分別精確加入2ml酯化液和2ml 氯仿，密封酯化管，100°c加熱4小時。靜置至室溫，加入2ml蒸餾水后再次密封，充分震蕩后靜置分層，待測。用取樣針取分層液下層溶劑1 μ 1，加入氣相色譜(美國agilent， HP-119091Z-413HP-130m,0. 32mm, 0. 25um_60 至 325/；350)升溫程序從 80°C開始，以每分鐘 30°C升溫到120°C，然后以每分鐘20°C的速度將溫度上升到300°C。注射口溫度100°C。得到峰圖后，各組分相對百分含量采用峰面積積分法計算，其成分如表1所示。
表1不同方法提取的細胞粗油轉化為生物柴油的組成成分與含量
權利要求
1.一種提取異養小球藻中性油脂的方法，其特征在于，利用球磨機的機械剪切力和超聲波的輔助傳質，借助弱極性有機溶劑的浸潤，破碎干燥小球藻細胞壁和濕藻細胞壁，提取其中的中性油脂；以異養發酵培養的大量高油脂含量的小球藻為操作對象，具體步驟為 ⑴離心收獲異養小球藻細胞；⑵對異養小球藻細胞進行球磨破碎；⑶分離磨介球；⑷ 在弱極性有機溶劑中超聲波破碎異養小球藻細胞壁；(5)離心去除細胞碎片；(6)蒸發去除研磨溶劑；(7)加入抽提溶劑精煉。
2.根據權利要求1所述提取異養小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述離心收獲異養小球藻細胞是對含有小球藻細胞的培養基進行離心，其異養小球藻細胞來自于異養高密度發酵的Chlorella. Protothecoides 0710藻株，其含油量為20wt % -6Iwt %，其細胞干重在15-108g/L之間；所述進行離心的離心力RCF = 6000g，4分鐘；除去多余液體，使藻細胞生物質質量比含水量介于60% -70%之間。
3.根據權利要求1所述提取異養小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述異養小球藻細胞球磨，將干藻粉、研磨溶劑和磨介球放入尼龍球磨罐中，按藻粉(g)研磨溶劑 (ml)磨介球(g)球磨罐容積(ml) = 30 30 (200-400) 500混合，在行星式球磨機上以100rpm-200rpm速度常溫球磨；其中，尼龍材質球磨罐為可密封的，研磨溶劑均為分析純的乙醇、異丙醇或正己烷；磨介球為直徑5mm-10mm的氧化鋯球；在對異養小球藻細胞進行球磨處理時處理干藻粉細胞優選球磨2小時，處理濕藻時優選球磨12小時。
4.根據權利要求1所述提取異養小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述用于洗脫的溶劑選用分析純的氯仿、異丙醇或正己烷；研磨溶劑量洗脫溶劑量按體積比選1 10 ； 洗脫時用2mm孔徑的篩網過濾分離氧化鋯磨介球。
5.根據權利要求1所述提取異養小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述在弱極性有機溶劑中超聲波破碎異養小球藻細胞壁是將球磨罐中的破碎藻細胞和異丙醇混合物按以下條件進行超聲功率600W，頻率20KHz，工作時間3秒，休息時間3秒，超聲總時間40分鐘。
6.根據權利要求1所述提取異養小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述離心去除細胞碎片，選離心力RCF = 6000g，4分鐘，使細胞碎片全部沉淀，將上層萃取有小球藻油脂溶劑保留。
7.根據權利要求1所述提取異養小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述步驟(6)蒸發去除研磨溶劑為65°C減壓蒸餾，完全蒸發并回收異丙醇，最后得到粗制小球藻中性油脂。
8.根據權利要求1所述提取異養小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述步驟(7)加入抽提溶劑精煉為加入正己烷抽提油脂，抽提溶劑量(ml)研磨溶劑量(ml)=l 1，靜置直到多糖及蛋白質完全析出，分液后取上層抽提溶劑，60°C蒸發正己烷后得到粗制的小球藻中性油脂。
9.根據權利要求1所述提取異養小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述濕藻細胞生物質含水量=濕藻細胞干燥至恒重的重量濕藻細胞干燥前的重量。
10.根據權利要求1所述提取異養小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述濕藻的含水量測定為取少量濕藻，測量重量ml，-50°c冷凍干燥48小時直到恒重，得到干藻粉，測定重量m2，最終得到濕藻的含水量；其含水量ω計算公式經過多次測定，大容量離心機能夠對異養發酵得到的小球藻進行初步脫水，去除絕大部分的液體培養基，得到質量比含水量61. 9士3. 1 %的濕藻細胞，然后采用冷凍真空干燥或熱烘干的干藻粉細胞至恒量，使其進一步干燥脫水，得到質量比含水量小于1 %的干藻粉。
全文摘要
本發明公開了屬于可再生能源領域的一種提取異養小球藻中性油脂的方法。該方法是以生物反應器中發酵培養的大量異養小球藻為原料，通過球磨機的機械破碎和超聲波的輔助傳質作用，在弱極性有機溶劑的浸潤中，破碎干燥小球藻細胞壁和未干燥脫水的小球藻細胞壁，最后經過中性有機溶劑提煉，得到粗制小球藻中性油脂。對于完全干燥的藻細胞，中性油脂的提取率達到了99.27％，而對于含水的藻細胞，中性油脂的提取率達到了89.61％，用此方法得到的中性油脂，可以直接用以制備生物柴油，縮短了小球藻中性油脂提取的時間，具備工業化生產的潛力，為大規模生產生物柴油提供大量的原料油脂，是快速和簡便的小球藻中性油脂提取途徑。
文檔編號C11B1/10GK102559376SQ201210030370
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者劉敏盛, 盧悅, 吳慶余, 戴俊彪 申請人:新奧科技發展有限公司, 清華大學