專利名稱：提高人胰島素前體融合蛋白酶切轉換成b30缺蘇氨酸人胰島素產率的方法
技術領域：
本發明涉及胰島素前體的酶切轉換方法，尤其涉及一種提高重組人胰島素前體融合蛋白酶切轉換成B鏈第30位缺蘇氨酸人胰島素(desB30)產物產率的方法，屬于重組胰島素或胰島素類似物的制備領域。
背景技術：
糖尿病是一種常見的由遺傳和環境因素相互作用而引起的代謝內分泌疾病，嚴重危害著人類健康。胰島素是最有效的糖尿病治療藥物之一，胰島素制品現已占到了整個糖尿病用藥30%以上的市場份額。胰島素是最早發現和研究的蛋白質，作為藥用蛋白已有90多年的歷史，其性質和 結構已十分清楚。胰島素是促進合成代謝、調節血糖穩定的主要激素，它對代謝作用的總趨向是促進營養物質以不同形式保存起來，因此人們常將其稱為“貯存激素”。胰島素就像一把鑰匙，開啟葡萄糖進入細胞的大門，促進全身組織對葡萄糖的攝取和利用，并抑制糖原的分解和糖原異生，因此，胰島素具有明顯的降低血糖的作用，是最為有效的糖尿病治療藥物。地特胰島素是一種中性的、可溶的、長效胰島素。它是原型胰島素去除了 B鏈第30位蘇基酸，通過在B29位賴氨酸側鏈氨基酰化結合一個14碳的直鏈脂肪酸而生成。酰化結合的脂肪酸可穩定胰島素分子的六聚體形式，使得地特胰島素從皮下注射部位的擴散和解聚吸收速度十分緩慢，可明顯延長作用時間。當地特胰島素進入血液循環后，約98%的組分又與血漿白蛋白可逆性結合，可在循環系統中穩定存在，在控制血糖的同時能較大程度避免血糖波動而減少低血糖的風險。另外，患者長時間使用體重增加的幾率也大為降低。胰島素分子在高于生理濃度(I(T8-I(TltW)VL)時具有強烈的自身聚合能力，所以胰島素在溶液多以二聚體或六聚體的形式存在。在形成胰島素二聚體時，B鏈第28位的脯氨酸與另一胰島素分子的B20至B23的U形轉角正好具有互補的相互作用，使得胰島素分子與分子之間以反平行式的方式形成穩定的、非共價鍵結合的β_折疊的二聚體。在溶液中有二價金屬離子和苯酚等試劑的情況下，依靠靜電、氫鍵和范德華力的相互作用，二聚體可進一步形成相對穩定的六聚體或多聚體。因為胰島素前體融合蛋白具有與胰島素十分相近的二級結構和高級結構，所以溶液中的胰島素前體融合蛋白絕大部分是以二聚體或六聚體的形式存在。現在上市的基因工程重組人胰島素主要有2種生產方法，分別為禮來公司的大腸桿菌表達工藝與諾和諾德公司的釀酒酵母表達工藝。前一種方法得到的胰島素前體需要經過收率較低的復性操作和價格較貴的胰蛋白酶及羧肽酶的雙酶切工藝；后一種方法需要將表達的前體進行成本很高的酶切轉肽反應，酶切及轉肽的效率直接決定生產的成本。另外，兩種方法都需要高效液相色譜進行精細純化，生產成本和復雜程度遠高于像干擾素等普通的基因工程產品。
巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是目前應用最廣泛的外源蛋白表達系統之一。該表達系統同時兼有原核表達系統和真核表達系統的優點，培養操作容易，生長快速，表達量高，能對外源真核基因進行正確翻譯和翻譯后的加工與修飾，可對多種外源蛋白進行分泌表達，產物易于提純。另外，畢赤酵母又具有分泌效率高，產物不會過度糖基化，蛋白抗原性低，表達菌株因重組質粒融合到菌體基因組中不易丟失等優點，因此近十年來受到廣大研究者的青睞。利用畢赤酵母進行胰島素前體的表達一直是近年來生物制藥一個熱點。畢赤酵母分泌表達外源蛋白時，通常將目的蛋白融合在α-交配因子信號肽的后面。為提高目的蛋白的表達量并增加信號肽酶的酶切活性，在胰島素前體的N-末端融合了一段ΕΕΑΕΑΕΑΕΡΚ的間隔肽序列。如圖I所示，間隔肽后是人的單鏈胰島素前體，包括人胰島素的B鏈(Β1-Β29)前29個氨基酸，及人胰島素A鏈(Α1-Α21) 21個氨基酸，兩者間通過小C肽AAK將B鏈的第29位LysineB29與A鏈的第一位GlycineA1相連。在α -交配因子信號引導肽的作用下，胰島素前體能有效分泌、折疊和二硫鍵的正確配對，表達量達到3. Og/L以上。畢赤酵母表達的胰島素前體是一個單鏈的融合蛋白，經胰蛋白酶三次酶切后方可 得到最終的產物一B鏈缺少第30位蘇氨酸的人胰島素(desB30)，然后經進一步轉化生成人胰島素或地特胰島素。酶切過程分別發生在圖I胰蛋白酶酶切所示的三個位點上。實驗發現，酶切過程始終有部分的酶切中間體不能有效的全部轉換成目的產物desB30。胰島素前體融合蛋白直接酶切轉肽時因需要多位點酶切，總體酶切效率不高。因此，改善胰島素前體融合蛋白酶切效率，提高重組人胰島素前體融合蛋白轉換為胰島素前體(desB30)的產物產率，直接涉及到以desB30為原料的重組人胰島素或地特胰島素的生產效率及成本的高低，是亟待需要解決的問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種提高人胰島素前體融合蛋白酶切轉換成B鏈第30位缺少蘇氨酸人胰島素產物產率的方法。本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的一種提高人胰島素前體融合蛋白酶切轉換成B鏈第30位缺少蘇氨酸的人胰島素前體desB30產物產率的方法，包括以下步驟(I)將基因工程制備的人胰島素前體融合蛋白表達產物依次采用離子交換和反相層析的方法進行純化；(2)收集反相層析的洗脫液，向洗脫液中直接加入Tris或NH4HCO3得到混合溶液；向混合溶液中加入胰蛋白酶在室溫條件下進行酶切。其中，所述的“人胰島素前體融合蛋白表達產物”可以是采用酵母表達的人胰島素前體融合蛋白表達產物，更優選為采用畢赤酵母菌株分泌表達的人胰島素前體。采用畢赤酵母菌株分泌表達胰島素前體為本領域的常規技術，已為多種文獻所報道(Xie T,LiuQj Xie F，Liu H，Zhang Y. Secretory expression of insulin precursor in Pichiapastoris and simple procedure for producing recombinant human insulin.PrepBiochem Biotechnolj 2008, 38 (3) : 308-317 ;李軍等，表達人胰島素前體的畢赤酵母菌株的構建.北京化工大學學報.2004，第31卷第2期.21-23 ;郝賀龍等，人胰島素B27K-DTr I前體在畢赤酵母中表達條件的優化.食品與藥品.2011年第13卷第09期.305-308)。其中，所述的離子交換方法優選為CM-Sepharose FF離子交換層析；所述的反相層析優選為層析柱的填料為018-10μιη -100 Α，反相層析柱規格250mmX21. 2mm ;所述反相層析的方法優選為A相為O. 1%TFA ddH20, B相為100%CH3CN ；流速20ml/min，20%B相平衡反相柱至基線穩定，將離子交換層析的收集液經微孔濾膜過濾后上樣，20%B相再平衡，洗脫梯度為30min內B相由20%上升至40%，梯度約為30%B相時，收集胰島素前體融合蛋白洗脫峰。為了達到更好的技術效果，步驟(2)中向洗脫液中加入Tris或NH4HCO3至其在混合溶液中的終濃度為30-100mmol/L，優選為50mmol/L ;調混合溶液的pH值為7. 5-8. 5，優選為8. O。步驟(2)中為了達到更好的酶切效果，按w/w計，按照胰蛋白酶與胰島素前體融合 蛋白I :200的比例加入胰蛋白酶；所述的室溫優選為20_30°C，更優選為25°C ；步驟(2)中所述的酶切時間優選為2-4小時，更優選為3小時。本發明首先對不同酶切時間的產物進行質譜鑒定確定了胰島素前體融合蛋白三個酶切位點的酶切順序，在確定胰島素前體融合蛋白三個酶切位點的酶切順序的同時，發現胰島素前體融合蛋白在酶切生成desB30時不能完全轉化，總有約20%左右的雙鏈胰島素前體不能有效切除連接肽生成目的產物。為了提高胰島素前體融合蛋白的酶切效率，本發明分別在4°C、25°C和37°C對酶切溫度進行了優化，在胰蛋白酶與胰島素前體融合蛋白(w/w)的比例分別為I :25、1 :50,1 :100,1 :200和I :400的條件下進行了酶量優化，但酶切轉化率仍接近于80%，未發現酶切轉換率有明顯的提高。畢赤酵母表達胰島素前體時，在分泌途徑中通過形成二聚體或多聚體的方式降低分子濃度來增加表達量。在聚體中Site 2酶切位點處于聚體的內部，因空間位阻的影響造成了胰蛋白酶不能完全去除連接肽。胰島素二聚體的生成是兩分子的B鏈末端形成了具有互補相互作用的反向β折疊，主要依靠靜電、疏水相互作用、氫鍵和范德華力來維持相對穩定的構象。在改變溶液的pH、疏水性等條件后，胰島素前體融合蛋白在溶液中將難以形成二聚體，酶切轉化率應有明顯的提高。若將胰島素前體融合蛋白溶液PH值調到低于2或超過9，胰島素前體融合蛋白分子會因自身電荷的相互排斥作用，很難形成聚體，但這樣的環境卻不是胰蛋白酶酶切的最佳條件，也不利于胰島素前體融合蛋白的穩定。本發明發現，通過在酶切的溶液中添加適當濃度的有機溶劑來降低溶液的極性，增加溶液的疏水性，能有效抑制胰島素前體融合蛋白生成二聚體或多聚體。為了提高人胰島素前體融合蛋白轉換B鏈第30位缺少蘇氨酸的人胰島素產物產率，本發明結合對胰島素前體融合蛋白的純化工藝，利用反相層析對胰島素前體融合蛋白的離子交換層析(CM)收集液進行再次純化。本發明發現，反相純化不僅達到了去除部分色素提高胰島素前體融合蛋白純度的目的，還將胰島素前體融合蛋白置換到適宜的有機溶劑的環境中，顯著降低了胰島素前體融合蛋白在溶液中聚體的產生，使得胰島素前體融合蛋白酶切生成desB30的酶切效率能夠出乎意料的提高15%以上(酶切的效率由81. 2%提高到96. 8%)，這對于以desB30為原料轉肽生成原型胰島素或者地特胰島素，能較大幅度的降低生產成本。


圖I胰島素前體融合蛋白一級結構示意圖及存在的三個胰蛋白酶酶切位點。圖2胰島素前體融合蛋白酶切過程中各產物的變化規律圖。圖3胰島素前體融合蛋白在水相中和低濃度有機相中酶切完成后的HPLC對比圖。圖4胰島素前體融合蛋白和雙鏈胰島素前體在兩種不同溶液中的圓二色譜對比圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍之內。試驗材料及儀器表達重組人胰島素前體融合蛋白(EEAEAEAEPK-B1-29-AAK-A1-21)的畢赤酵母基因工程菌及人胰島素前體融合蛋白的發酵上清按照文獻進行構建、篩選和發酵表達(XieTj Liu Qj Xie F，Liu H，Zhang Y. Secretory expression of insulin precursor in Pichiapastoris and simple procedure for producing recombinant human insulin. PrepBiochem Biotechnolj2008,38(3):308-317)。胰蛋白酶(Trypsin)購自Sigma ;三輕甲基氨基甲焼(Tris)、二硫蘇糖醇(DTT)購自 Amresco ;乙臆(CH3CN, HPLC 級)、三氟乙酸(TFA)購自 J&K Chemical ；CM-SepharoseFF. Sephadex G-25購自GE ;其它為國產分析純試劑。分析型色譜柱(250mmX4. 6mm)為C I8-5pm-100A和半制備型色譜柱(250mmX21. 2mm)填料為(18-10μ η-100Α,購自Kromasil。分析型高效液相儀為安捷倫1100，制備型高效液相儀為大連伊利特Ρ270。試驗例I重組人胰島素前體融合蛋白的水相酶切試驗I、試驗方法人胰島素前體融合蛋白的發酵上清采用CM-S印harose FF離子交換層析純化得到胰島素前體融合蛋白溶液，再將其用Sephadex G25凝膠過濾的方法進行純化。經過Sephadex G 25純化后的樣品，用50mmol/L、pH 8. O的Tris緩沖液配制成2. Omg/ml的溶液。按胰蛋白酶胰島素前體融合蛋白為I :200(w/w)的比例，加入胰蛋白酶，混勻。分別在酶切 O. Oh (加酶混勻后立即取樣)、0. 25h、0. 5h、l. Oh,2. Oh,3. Oh,4. Oh,8. Oh 及 24. Oh 取樣。不同酶切時間樣品取樣后立刻加入2倍體積的I. OmoI/L乙酸終止酶反應，并標記酶切時間。樣品進行高效液相色譜(HPLC)檢測。酶切轉化率為HPLC圖譜中各酶切產物峰面積/ (未酶切胰島素前體融合蛋白峰面積+各酶切產物峰面積之和)。胰島素前體融合蛋白的濃度測定采用HPLC方法，用純度超過98%的胰島素前體融合蛋白制作標準曲線。2、試驗結果根據酶切樣品HPLC圖譜可以計算各產物的酶切轉化率。從圖2可以看出，胰島素前體融合蛋白的三個酶切位點的酶切速率有明顯的區別。酶切的第一步(圖I中Site I位置)速率很快，不到30min大部分融合蛋白被酶切，得到單鏈胰島素前體；酶切的第二步(圖I中Site 3位置)速度相對于第一步要慢，大部分的單鏈胰島素切成雙鏈酶切時間超過2. Oh。酶切第三步(圖I中Site 2位置)相對要更慢一些，至酶切反應進行到4. Oh時，仍有近20%的雙鏈胰島素前體未能切除連接肽生成最終產物desB30。即使酶切時間的進一步延長至24h，desB30的效率也未見明顯增加，目的產物desB30的酶切轉換率約為80%。在確定胰島素前體融合蛋白三個酶切位點的酶切順序的同時，發現胰島素前體融合蛋白在水相酶切生成desB30時不能完全轉化，總有約20%左右的雙鏈胰島素前體不能有效切除連接肽生成目的產物(圖2)。
試驗例2胰島素前體融合蛋白的反相純化和酶切試驗I、試驗方法將人胰島素前體融合蛋白的發酵上清經CM-Sepharose FF離子交換純化(同試驗例I)得到的胰島素前體融合蛋白溶液，再將其經反相柱250mmX21. 2mm(C 8-1 Ομιτι-100 A )進行反相層析；反相層析的條件如下A相為O. 1%TFA ddH20, B相為100%CH3CN。流速20ml/min，20%B相平衡反相柱至基線穩定；將經CM-S印harose FF離子交換純化得到的胰島素前體融合蛋白溶液經O. 45 μ m的微孔濾膜過濾后上樣，20%B相再平衡，洗脫梯度為0_30min內B相由20%上升至40% ;梯度約30%B相時，收集反相收集液。經反相層析后的目的蛋白溶液澄清透明，純度提高到98%以上。反相收集液中加入Tris或NH4HCO3至其終濃度為30-100mmol/L (優選為50mmol/L)，調pH為7. 5-8. 5 (優選的，調pH為8.0)，按胰蛋白酶與胰島素前體融合蛋白l:200(w/w)的比例，加入胰蛋白酶，25°C酶切。不同酶切時間取樣，HPLC檢測酶切轉化率。2、試驗結果通過對不同酶切時間的產物分析，發現酶切順序與在50mmol/LTris水相溶液中進行的酶切相一致，但酶切至3. Oh時，胰島素前體融合蛋白的酶切轉化率即達到96. 8%，比在試驗例I中的水相溶液中的酶切高出15%以上(圖3)。酶切后的樣品ESI-MS檢測分子量為5707. 8，與desB30的理論分子量相一致，說明在含有低濃度乙腈的溶液中進行酶切，并未發生一些未知的酶切反應。圖4為胰島素前體融合蛋白和雙鏈胰島素前體各自分別用50mmol/L Tris (pH8. O)和50mmol/L Tris (pH 8. O)+30%CH3CN配制成O. lmg/ml的溶液進行圓二色譜檢測的對比圖。從圖4中可以看出，同一種胰島素前體融合蛋白在由水溶液到含有部分有機溶液的環境中，圓二色譜發生了較大變化。特別是雙鏈胰島素前體CD譜更為明顯，在含有低濃度的乙腈的溶液中，經計算雙鏈胰島素前體反向折疊所占的比例從8. 7%下降到2.6%。胰島素及其類似物只有在生成聚體后才會形成反相β_折疊，所以反向β_折疊含量的下降表明在低有機相的溶液中聚體的含量有了明顯的降低，從而減輕了在Site 3位置酶切時空間位阻造成的影響，因此提高了胰島素前體融合蛋白酶切轉換成desB30的轉換效率。
權利要求
1.一種提高人胰島素前體融合蛋白酶切轉換成B鏈第30位缺蘇氨酸人胰島素產物產率的方法，包括以下步驟 (1)將人胰島素前體融合蛋白表達產物依次采用離子交換和反相層析的方法進行純化； (2)收集反相層析的洗脫液，直接向洗脫液中加入Tris或NH4HCO3得到混合溶液；向混合溶液中加入胰蛋白酶在室溫條件下進行酶切。
2.按照權利要求I所述的方法，其特征在于所述的離子交換方法為CM-SepharoseFF離子交換層析。
3.按照權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的反相層析為層析柱的填料為Cl 8-1 O μπ _1 00 Α,反相層析柱的規格為 250mmX21. 2mm。
4.按照權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的收集反相層析的方法為A相為O.1%TFA ddH20, B相為100%CH3CN ；20%B相平衡反相柱至基線穩定；將離子交換層析的收集液經微孔濾膜過濾后上樣，20%B相再平衡，洗脫梯度為30min內B相由20%上升至40%，梯度為30%B相時，收集反相層析的洗脫液。
5.按照權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)中向反相收集液中加入Tris或NH4HCO3至其在混合溶液中的終濃度為30-100mmol/L ;調混合溶液的pH值為7. 5-8. 5后向混合溶液中加入胰蛋白酶在室溫條件下進行酶切。
6.按照權利要求5所述的方法，其特征在于步驟(2)中向反相收集液中加入Tris或NH4HCO3至其在混合溶液中的終濃度為50mmol/L ;調混合溶液的pH值為8. O后向混合溶液中加入胰蛋白酶在室溫條件下進行酶切。
7.按照權利要求I所述的方法，其特征在于按w/w計，步驟(2)中胰蛋白酶與胰島素前體融合蛋白的比例為I :200。
8.按照權利要求I所述的方法，其特征在于所述的室溫為20-30°C;優選為25°C。
9.按照權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的酶切時間為2-4小時。
10.按照權利要求9所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的酶切時間為3小時。
全文摘要
本發明公開了一種提高人胰島素前體融合蛋白酶切轉換成B30缺蘇氨酸人胰島素(desB30)產率的方法，包括(1)將人胰島素前體融合蛋白表達產物依次采用離子交換和反相層析的方法進行純化；(2)收集反相層析的洗脫液，加入Tris或NH4HCO3，再加入胰蛋白酶進行酶切轉換。本發明利用反相層析對胰島素前體融合蛋白的離子交換收集液進行再次純化，達到了去除色素提高胰島素前體融合蛋白純度的目的，又將胰島素前體融合蛋白置換到適宜的有機溶劑的環境中，顯著降低了其在水相中產生聚體的現象，酶切轉換效率相應的提高了15%以上，這對于以desB30為原料轉肽生成原型胰島素或者地特胰島素，可以較大幅度的降低生產成本。
文檔編號C12P21/06GK102816819SQ20121028742
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月13日 優先權日2012年8月13日
發明者周祥山, 張元興, 尤金花, 秦玉峰, 劉海峰, 解福生, 龐甲佩, 郝向慧, 史兆松 申請人:山東阿華生物藥業有限公司, 華東理工大學, 山東東阿阿膠股份有限公司