專利名稱：內切葡聚糖酶nce5及其含有內切葡聚糖酶nce5的纖維素酶制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種內切葡聚糖酶，一種含有該內切葡聚糖酶的纖維素酶制劑和一種利用該纖維素酶制劑處理含纖維素織物的方法。
目前，來源于木腐真菌木霉屬和腐質霉屬的纖維素酶制劑被用于賦予被染色的粗斜紋布含纖維素織物以磨洗的外觀和改善其手感。這些纖維素酶制劑是多種纖維素酶組分的混合物。為了對所述含纖維素織物發揮所需的作用必須使用大量的纖維素酶制劑，由此造成的困難阻礙了纖維素酶制劑的實際應用。
纖維素酶制劑的這種缺點有待通過使用含有一種大量的內切葡聚糖酶的制劑而得到克服。例如，國際公布WO89/09259，WO91/17243，WO98/03640和WO94/21801公開了具有很高內切葡聚糖酶活性的纖維素酶制劑。具體地是，WO91/17243公開了一種來源于腐質霉屬的純化的43kD內切葡聚糖酶組分(EGV)的牛仔褲磨蝕活性比常規已知的由多種纖維素酶組分組成的混合物形式的纖維素酶制劑的牛仔褲磨蝕活性高約100倍。還有，WO98/03640公開了一種來源于腐質霉屬的內切葡聚糖酶組分NCE4的牛仔褲磨蝕活性和lyocell絨毛去除活性比常規已知的由多種纖維素酶組分組成的混合物形式的纖維素酶制劑的牛仔褲磨蝕活性和lyocell絨毛去除活性分別高25倍和100倍。
為了賦予被染色的粗斜紋布含纖維素織物以磨洗的外觀并改善其手感利用纖維素酶進行了這種處理，但是在這種情況下，在處理過程中往往出現一些問題如部分靛藍染料在衣服上再沉積或再染色，即逆染色。
有一種試圖降低逆染色程度的方法，其中通過添加一種試劑如表面活性劑而將靛藍染料分散在纖維素酶處理溶液中。然而，這種方法存在的問題是需要投入添加化學品的成本并且也給環境增加了排放廢水的負擔。
因此，人們已經把注意力集中在提供一種活性高而逆染色程度低的纖維素酶上，該纖維素酶將被用于處理被染色的粗斜紋布含纖維素織物。
本發明的公開目前，本發明人已經分離出一種新型的分解纖維素織物活性高的來源于霉菌Humicola insolens的內切葡聚糖酶NCE5和它的基因并且證實了這種酶具有一個對來源于腐質霉屬的酶來說沒有先例的結構并且能夠水解纖維素織物，也就是說這種酶具有約25kDa的小分子量而且其結構中不存在纖維素結合域(CBD)。
還證實了，在采用通過利用Humicola insolens作為宿主表達酶NCE5所獲得的制劑處理被染色的粗斜紋布含纖維素織物時，所述酶具有類似于NCE4的高活性，而令人驚奇的是所述酶的逆染色程度低于NCE4。
因此，本發明打算提供一種在處理被染色的粗斜紋布含纖維素織物的過程中逆染色程度低的纖維素酶及其基因。
本發明還打算提供一種具有優良特性的纖維素酶制劑。
另外，本發明打算提供一種利用所述酶處理含纖維素織物的有效和成本低的方法。
本申請包括申請號為2000-150463的日本專利申請的說明書和/或附圖中公開的部分或全部內容，該日本專利申請是本申請的優先權文件。
實施本發明的最佳實施方案以下詳細描述本發明。纖維素酶本發明提供的內切葡聚糖酶NCE5的有利特性在于在處理被染色的粗斜紋布含纖維素織物的過程中逆染色的程度低于NCE4。因此，本發明的酶，可以降低處理被染色的粗斜紋布含纖維素織物的過程中化學品如表面活性劑的添加量，結果可以降低成本并且能夠減輕給環境造成的負擔。
該酶是一種新型蛋白質，其與由S.Takashima等報道的灰色腐質霉的egl4序列(S.Takashima等，生物技術雜志(Journal ofBiotechnology)，67，85-97(1999))具有同源性。該酶的特征在于具有約25kDa的小分子量而且其結構中不存在纖維素結合域(CBD)。在原始狀態下，從腐質霉屬中分離出的具有高的纖維素織物分解活性的所有的酶都含有纖維素結合域(CDB)(例如，WO91/17243已經公開了一種來源于腐質霉屬的純化的43kD內切葡聚糖酶成分(EGV)，以及WO98/03640已經公開了一種腐質霉屬來源的內切葡聚糖酶成分(NCE4))。然而，不含CBD而纖維素分解活性高的腐質霉屬來源的酶還不為自然界所知。
作為一種來源于腐質霉屬以外的其它霉菌的酶中不含CBD的內切葡聚糖酶，JP-W-8-507695(本文中使用的術語“JP-W”是指一種“已經公開的未審日本國際專利申請”)公開了從Trichodermalongibrachiatum中分離的EGIII具有一個從5.5至6.0的最適pH作為其CMC酶活性(Remazol亮藍羰甲基纖維素分析試驗)以及甚至在中性至堿性范圍內的活性也比通常已知的木霉屬來源的纖維素酶的活性高。另一方面，本發明的酶的CMC酶活性具有一個從5.0至9.0的最適pH并且在更強的堿性范圍內的活性比EGIII的活性高。
該酶是一種含有部分SEQ ID NO1所示的氨基酸序列或從第19位至第223位的序列的蛋白質。根據本發明，術語“部分SEQ ID NO1所示序列”是指，例如一段可以作為探針的長度，更明確地說仍然保留了纖維素酶活性，具體地是內切葡聚糖酶活性的部分序列。
一種在上述蛋白質的N-端側還含有部分或全部的SEQ ID NO1所示的第1位至第18位的氨基酸序列的蛋白質也被包括在本發明中。在這一點上，由于SEQ ID NO1所示序列中的第1位至第18位的氨基酸序列被認為是信號肽，所以部分序列是指除了其保持信號肽活性的部分序列外，由于在被所述類型的表達宿主加工的位點上發生變化而仍然保留在N-端的一段序列。
上述蛋白質的一種修飾蛋白質也被包括在本發明中。根據本發明，所述修飾蛋白質是指一種上述蛋白質的氨基酸序列中發生了至少一個，優選地1至幾個氨基酸的修飾如添加、插入、刪除、缺失或取代的、而仍然保留了纖維素酶活性，尤其是內切葡聚糖酶活性的蛋白質。
可以從霉菌，明確地說從一種屬于腐質霉屬的微生物(例如Humicola insolens)中獲得。
根據本發明，提供了一種編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列或其一種修飾蛋白質的核苷酸序列。一旦給出了一種蛋白質的氨基酸序列，就很容易確定出編碼該蛋白質的DNA序列，因而可以選擇出編碼SEQ IDNO1所示氨基酸序列或其一種修飾蛋白質的不同核苷酸序列。
本發明的核苷酸序列既可以是天然來源的也可以是一種完全合成的產物，或者也可以是一種通過利用部分天然來源而合成的產物。獲得本發明核苷酸序列的方法的典型例子包括一種這樣的方法，在該方法中，通過采用一種遺傳工程領域中通常使用的技術，例如采用一種基于部分氨基酸序列的信息制備的一種合適的DNA探針從Humicolainsolens的cDNA文庫中篩選所述核苷酸序列。
編碼本發明的內切葡聚糖酶NCE5的氨基酸序列的典型序列具有部分或全部的SEQ ID NO2所示核苷酸序列。SEQ ID NO2所示核苷酸序列具有一個起始于第一位至第3位的ATG和終止于第670位至第672位的TAA的可讀框。并且，第55位至第57位的核苷酸序列對應于由205個殘基組成的成熟蛋白質的N-端氨基酸。
內切葡聚糖酶的活性內切葡聚糖酶活性是指“CMC酶活性”，也就是一種通常水解羧甲基纖維素的活性。一個單位的“CMC酶活性”被定義為形成相當于1μmol葡萄糖的還原糖所需要的酶量，該酶量是通過包括以下步驟的方法測定的將待測蛋白質與CMC溶液一起溫育一段固定的時間，然后測定被釋放出的還原糖。另外，“CMC酶活性”也可以通過一種以其中加入了待測蛋白質的CMC溶液的粘度變化作為標準的方法來測定。
在本發明中，按照Neena Din等的方法(Neena Din等，生物技術(Biotechnology)，9(1991)，1096-1099)，以脫脂棉原纖維-釋放活性作為標準來測定內切葡聚糖酶活性。也就是說，當待測蛋白質、不銹鋼珠和脫脂棉被加到50mM的磷酸鹽緩沖液(pH7)中時，從脫脂棉中釋放出來的原纖維在Launder Meter(L-12，Daiei Kagaku Seiki MFG.，日本)中于55℃下反應120分鐘，然后在600nm的吸光度下測定從脫脂棉中釋放出來的原纖維的量。表達載體和被轉化的微生物本發明還提供了一種能夠在一種宿主微生物中復制編碼SEQ IDNO1所示氨基酸序列或其一種修飾蛋白質的核苷酸序列(以下只描述為“本發明的DNA序列”)并且含有一種由此所編碼的蛋白質能夠被表達的DNA序列的表達載體。本發明的表達載體能夠在一種自我復制載體如質粒的基礎上進行構建，所述質粒以一種獨立的形式存在于染色體外并且其復制不依賴于染色體的復制。而且，本發明的表達載體可以是一種當被引入宿主微生物時被整合進宿主微生物的基因組中并且與被整合在其中的染色體一起進行復制的載體。關于構建本發明的載體的過程和方法，可以采用遺傳工程領域中通常使用的方法。
為了通過將本發明的表達載體實際引進一種宿主微生物中來表達具有所需活性的蛋白質，理想的是所述載體不僅含有本發明的DNA序列而且還含有其它元件如一種控制表達的DNA序列和一種用于篩選微生物的基因標記。作為控制表達的DNA序列，其中包括一個啟動子、一個終止子和一個編碼一種信號肽的DNA序列。對所述的啟動子沒有特別的限制，條件只是該啟動子在一種宿主微生物中具有轉錄活性，并且可以用來作為控制編碼一種與宿主微生物的蛋白質相同或不同的蛋白質的基因表達的DNA序列。并且，對所述信號肽也沒有特別的限制，條件只是該信號肽能夠有助于宿主微生物中的蛋白質分泌，而且可以從一種DNA序列中得到。該DNA序列來源于編碼一種與宿主微生物的蛋白質相同或不同的蛋白質的基因。另外，本發明的基因標記可按照轉化體的篩選方法任意地進行選擇，例如可以使用一種編碼藥物抗性的基因或一種補充輔源營養的基因。
另外，根據本發明，提供了一種被所述表達載體轉化的微生物。對該宿主載體系統沒有特別的限制，例如，可以使用一種利用了大腸桿菌、一種放線菌、一種酵母菌或一種霉菌的系統和一種利用了大腸桿菌、一種放線菌、一種酵母菌或一種霉菌的與其它蛋白質融合的蛋白質表達系統。
而且，可以采用本領域中通常使用的技術來實現用這種表達載體對一種微生物的轉化。
另外，利用合適的培養基對所得到的轉化體進行培養，然后可以通過從該培養混合物中分離來獲得本發明的蛋白質。因此，根據本發明的另一個實施方案，提供了一種制備本發明新型蛋白質的方法。轉化體的培養及培養條件基本上與所使用的微生物的培養及培養條件相同。轉化體培養結束后，利用本領域中通常使用的方法回收目的蛋白質。
并且，根據本發明的一個優選的實施方案，提供了一種能夠表達由本發明的DNA序列編碼的內切葡聚糖酶的酵母細胞。本發明酵母細胞的實例包括屬于糖酵母屬、漢遜氏酵母屬或畢赤氏酵母屬的微生物，例如啤酒糖酵母。
本發明的宿主霉菌可以是一種屬于腐質霉屬、曲霉屬、木霉屬、鐮孢屬或支頂孢屬的霉菌。其優選的實例包括Humicola insolens、黑曲霉或米曲霉、綠色木霉、尖孢鐮孢和纖維素溶解支頂孢(Acremoniumcellulolyticus)。微生物的保藏Humicola insolens MN200-1已被保藏在國家先進工業科學技術研究所，一個經濟、貿易和工業部下屬的獨立管理機構，AIST TsukubaCentral6，Higashi1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，日本，保藏號為FERMBP-5977(原始保藏物FERM P-15736，原始保藏日期1996年7月15日)。被含有本發明的纖維素酶基因的質粒pNCE5Bam轉化的大腸桿菌菌株JM109(參照實施例4)已于2000年4月18日被保藏在國家先進工業科學技術研究所，一個經濟、貿易和工業部下屬的獨立管理機構，AISTTsukuba Central 6，Higashi 1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，日本，保藏號為FERM BP-7138。
被質粒pEGD01轉化的一株大腸桿菌菌株(大腸桿菌/pEGD01)已被保藏在國家先進工業科學技術研究所，一個經濟、貿易和工業部下屬的獨立管理機構，AIST Tsukuba Central 6，Higashi 1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，日本，保藏號為FERM BP-5973(原始保藏物FERM P-15729，原始保藏日期1996年7月12日)。纖維素酶/纖維素酶制劑的用途本發明的另一個實施方案還提供了一種含有一種本發明的內切葡聚糖酶及其修飾肽的纖維素酶制劑。本發明的纖維素酶制劑除了含有本發明的內切葡聚糖酶及其修飾肽外，還可以含有其它類型的纖維素酶如纖維素生物水解酶、β-葡糖苷酶和除本發明的內切葡聚糖酶以外的內切葡聚糖酶，并且可以通過進一步將所述的纖維素酶制劑與通常使用的組分如一種填料(例如乳糖、氯化鈉和山梨醇)、表面活性劑和防腐劑進行混合來制備。還可以將本發明的纖維素酶制劑制成任何適宜的形狀如粉末或液體形式。
本發明還提供了一種使有色的含纖維素織物的顏色澄明的方法，該方法包括一個采用一種內切葡聚糖酶或一種纖維素酶制劑處理有色的含纖維素織物的步驟，以及一種使有色的含纖維素織物發生局部顏色改變的方法，即一種為有色的含纖維素織物提供磨洗外觀的方法，該方法包括一個采用本發明的內切葡聚糖酶或纖維素酶制劑處理有色的含纖維素織物的步驟。
本發明的這類方法可以通過在洗滌過程中處理含纖維素織物來實施。然而，在某些情況下，織物的處理可以通過在浸泡或漂洗過程中向浸泡了或要浸泡的所述織物的水中添加本發明的內切葡聚糖酶或纖維素酶制劑來實施。
本發明進一步提供了一種降低含纖維素織物的起毛率或減少這種織物中的絨毛的方法；或者一種降低含纖維素織物變得硬挺的速率或降低這種織物硬挺度的方法。這些方法中的每一種方法都包括一個采用本發明的內切葡聚糖酶或纖維素酶制劑處理含纖維素織物的步驟。
考慮其它各種條件的同時可以適當地決定諸如接觸溫度或內切葡聚糖酶的使用量這樣的條件。例如，對于為了改善其手感和外觀而對含纖維素織物進行失重處理的情況來說，所述織物可以在約50至60℃的溫度下利用蛋白濃度為1至100mg/L的內切葡聚糖酶進行處理。并且，當有色的含纖維素織物需要進行局部顏色改變時，所述織物可以在約50至60℃的溫度下利用蛋白濃度為2至50mg/L的內切葡聚糖酶進行處理。
還有，當降低含纖維素織物的起毛率或減少這種織物中的絨毛時，所述織物可以在約50至60℃的溫度下利用蛋白濃度為0.05至10mg/L的內切葡聚糖酶進行處理。
并且，通過在洗滌劑組合物中使用本發明的內切葡聚糖酶或纖維素酶制劑，可以提高顆粒狀污垢的去除、使顏色澄明、去毛、消除起球和降低硬挺度的性能。本發明所指的洗滌劑組合物可含有一種表面活性劑(一種陰離子、非離子、陽離子、兩性或兼性離子劑或其一種混合物)。
本發明的洗滌劑組合物還可含有本領域中已知的其它洗滌劑組分，如助洗劑、漂白劑、漂白活性劑、緩蝕劑、螯合劑、污斑離解聚合物、香料、其它的酶(如蛋白酶、脂酶或淀粉酶)、酶穩定劑、配方助劑、光學增艷劑和泡沫促進劑。陰離子表面活性劑的典型實例包括線性烷基苯磺酸鹽(LAS)、烷基硫酸鹽(AS)、α-烯屬磺酸鹽(AOS)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽(AES)和天然脂肪酸的堿金屬鹽。非離子表面活性劑的實例包括聚氧乙烯烷基醚(AE)、烷基聚乙二醇醚、壬基酚聚乙二醇醚、蔗糖和葡萄糖的脂肪酸酯以及聚乙氧基化烷基葡糖苷的酯。
已經發現脫墨可以通過使本發明的內切葡聚糖酶或纖維素酶制劑與廢紙反應來進行。因此，由廢紙制造循環利用紙的方法可以通過采用本發明的內切葡聚糖酶進行處理得到明顯的改進。一般稱為廢紙的所有紙都可以被用作將被本發明利用的廢紙，而且它們的實例包括通過混合機械漿和化學漿生產的報紙，雜志和一級至二級的印刷紙、由化學漿組成的不含木質的廢紙和廢印刷紙如涂布紙。
還有，本文使用的術語“脫墨劑”是指一種通常用于使廢紙脫墨的試劑，其實例包括一種堿性化合物如NaOH和Na2CO3，硅酸鈉、過氧化氫和磷酸鹽，以及陰離子和非離子表面活性劑、凈化劑如油酸和輔助劑如pH穩定劑、螯合劑和分散劑。
并且，根據本發明，可以認為采用本發明的內切葡聚糖酶處理紙漿使其打漿度得到可能的明顯改善而不會大大降低紙的強度。因此，本發明提供了一種改善紙漿的打漿度的方法，該方法包括一個采用本發明的內切葡聚糖酶或纖維素酶制劑處理紙漿的步驟。可以通過本發明處理的紙漿的實例包括廢紙漿、循環利用紙板漿、牛皮紙漿、亞硫酸鹽漿和熱洗機械漿和其它高得率漿。
另外，消化動物飼料中的葡聚糖的能力可以通過向該飼料中添加本發明的內切葡聚糖酶來提高。因此，本發明提供了一種改善對動物飼料的消化能力的方法，該方法包括一個采用本發明的內切葡聚糖酶或纖維素酶制劑處理動物飼料的步驟。
附圖的簡要說明

圖1表示質粒pNCE5Bam的構建。圖2表示pJND-c5的構建。
將200ml所述粗纖維素酶制劑溶液加到硫酸銨終濃度為1M的溶液中，然后以20ml/分鐘的流速上樣到Source PHE柱子上(凝膠體積150ml，由Amersham Pharmacia Biotech制造)，該柱子預先用1M硫酸銨溶液進行了平衡。接下來，采用硫酸銨濃度為1.0M至0M的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)以20ml/分鐘的流速進行線性梯度洗脫并分步收集級分。在這些級分當中，發現當采用硫酸銨濃度為0.3M時得到的部分級分中的棉花原纖維-釋放活性很強。因此，收集200ml的該級分。該步驟進行兩次。
將400ml如此得到的活性級分加到硫酸銨濃度為1.5M的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，然后以20ml/分鐘的流速上樣到Source ISO柱子上(凝膠體積125ml，由Amersham Pharmacia Biotech制造)，該柱子預先用1.5M硫酸銨的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)進行了平衡。接下來，采用從硫酸銨濃度為1.5M的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)至超純水以20ml/分鐘的流速進行線性梯度洗脫并分步收集級分。在這些級分當中，發現當采用硫酸銨濃度為1.05M時得到的部分級分的脫脂棉原纖維-釋放活性很強。因此，收集200ml的該級分。
然后，將硫酸銨加到200ml如此獲得的活性級分中從而達到65％飽和度的水平，在4℃下將所述混合物攪拌60分鐘，然后以15000rpm離心從而回收沉淀。將該沉淀溶解在20ml的蒸餾水中并利用Ultrafree/Biomax-5K(Millipore)進行脫鹽從而回收到40ml的溶液。
將30ml如此得到的活性級分加到50mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)中，然后以5ml/分鐘的流速上樣到SP Sepharose FF柱子上(凝膠體積16ml，由Amersham Pharmacia Biotech制造)，該柱子預先用50mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)進行了平衡。接下來，采用從50mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)至1M NaCl的50mM醋酸鹽緩沖液(pH5.0)以4ml/分鐘的流速進行線性梯度洗脫并分步收集級分。在這些級分當中，發現當氯化鈉濃度約為0.12M時得到的部分級分的脫脂棉原纖維-釋放活性很強。因此，收集12ml的該級分。
此后，將6ml如此得到的活性級分加到50mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)中，然后以1ml/分鐘的流速上樣到Mono S5/5HR柱子上(由AmershamPharmacia Biotech制造)，該柱子預先用50mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)進行了平衡。接下來，采用從50mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)至1M NaCl的50mM醋酸鹽緩沖液(pH5.0)以1ml/分鐘的流速進行線性梯度洗脫并分步收集級分。在這些級分當中，發現當氯化鈉濃度約為0.1M時得到的部分級分的脫脂棉原纖維-釋放活性很強。因此，收集1至3ml的該級分。該級分被分離成NCE5。通過SDS-PAGE分析，該NCE5具有一條25kD的帶。將上述純化NCE5的純化步驟重復50次，獲得了大量的純化樣品。
所述SDS-PAGE分析是利用Tefco提供的系統來進行的。即，使用了一個電泳槽(No.03-101)，一個電源(3540型)，一種8％的凝膠(01-015)和一個用于SDS-PAGE的緩沖液試劑盒(06-0301)。所述電泳條件是18mA/10分鐘，然后是20mA/90分鐘。為了電泳后進行蛋白質的測定，利用電泳用2D-銀染色劑II“Daiichi”(由Daiichi Pure Chemicals制造)進行銀染。利用由Bio-Red制造的SDS-PAGE分子量標準蛋白LowRange(161-0304)作為蛋白標準品。
通過Neen Din等的方法(Neen Din等，生物技術(Biotechnology)，9(1991)，1096-1099)的改進方法測定脫脂棉原纖維-釋放活性。即，當在下述條件下利用耐洗牢度試驗儀進行反應時，以600nm的吸光度測定從脫脂棉中釋放的原纖維量。
測量儀器耐洗牢度試驗儀L-12(Daiei Kagaku Seiki MFG.，日本)溫度 55℃時間 120分鐘反應pHpH7(50mM磷酸鹽緩沖液)向所述處理溶液中加入適當量的不銹鋼珠和脫脂棉以及內切葡聚糖酶溶液。實施例2纖維素酶NCE5的部分氨基酸序列(1)N-端氨基酸序列的鑒定為了測定實施例1中純化的蛋白質的N-端氨基酸序列，所述NCE5級分通過采用SDS-PAGE mini(由Tefco制造)來處理，通過電子印跡轉移到PVDF膜上，采用考馬斯亮藍R250(由Nakalai Tesque制造)染色，脫色，用水沖洗，然后風干。當從其中切下印跡了25kD蛋白質的部分后，上樣到492型蛋白質測序儀(由PE Applied Biosystems制造)以便分析N-端氨基酸序列，沒有獲得通過Edman降解的信號，因此，表明所述N-端氨基酸得到了修飾和保護。因此，將所述膜浸泡在0.5％的聚乙烯吡咯烷酮(分子量40000，由Sigma制造)/100mM醋酸溶液中于37℃下保持30分鐘從而封閉所述膜上蛋白質未結合部分，通過采用Pfu焦谷氨酸氨基肽酶(由Kakara Shuzo制造)在50℃下處理5小時來除去所述被修飾的N-端殘基，然后再次進行序列測定。如此獲得的序列如下所示。
NCE5的N-端氨基酸序列
Ser-Gly-Ser-Gly-Arg-Thr-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)-(Cys)-Lys-Pro-Ser-(Cys)-Ala-Trp-Pro (20個殘基) (SEQ IDNO3)(2)肽作圖為了測定實施例1中純化的蛋白質的內部氨基酸序列，對所述蛋白質進行還原烷基化，然后繪制其肽圖譜。
也就是，將300μg的純化蛋白質溶解在被裝在一支試管中的500μl還原烷基化緩沖液(0.5M tris，7M鹽酸胍，10mM EDTA·2Na2)中，然后向其中加入1mg的DTT。用氮氣置換所述試管中的空氣，將所述內容物在室溫下保持5小時從而進行所述蛋白質的還原反應。還原反應后，向其中加入2.5mg的一碘代乙酸從而在室溫下進行30分鐘的烷基化暗反應。反應結束后，用蒸餾水對所述反應混合物進行透析以便脫鹽，然后進行凍干，將如此獲得的粉末用作一種還原性烷基化NCE5。
將該粉末溶解在0.1M的碳酸氫銨緩沖液(pH8.0)中。將該溶液與基于蛋白質的約1/50摩爾量的胰蛋白酶(由Promega制造)混合并在37℃下反應過夜。通過利用172μ型的制備型HPLC系統(由PE AppliedBiosystems制造)對所述的消化產物進行柱層析(柱子C18 220×2.1mm，0.1％TFA的5％乙腈至0.085％TFA的35％乙腈梯度)，分離出5種肽。每一種如此獲得的肽片段的氨基酸序列通過492型的蛋白質測序儀(由PE Applied Biosystems制造)來進行測定。測得的結果如下所示T-28.8Leu-Lys-Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg(8個殘基) (SEQ ID NO4)T-32.6Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys(6個殘基) (SEQ ID NO5)T-35.9Trp-Asp-Asn-Pro-Leu-Phe-Asp-Gly-Gly-Asn-Thr-Arg(12個殘基)(SEQ ID NO6)T-35.9Glu-Trp-Cys-Cys-Ala-Cys-Tyr-Glu-Leu-Thr-Phe-Thr(12個殘基)(SEQ ID NO7)T-43.0Phe-Asp-Trp-Phe-Leu-Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Ser-Val-Asn-Trp-Arg******* (15個殘基)(SEQ ID NO8)在通過肽作圖獲得的N-端氨基酸序列和氨基酸序列中，4種肽與由S.Takashima等(S.Takashima等，生物技術雜志，67，85-97(1999))報道的灰色腐質霉eg14序列相同。然而，在T-43.0中沒有發現相同的序列。因此表明盡管所述序列具有同源性，但是它是不同的因而是一種新型蛋白質。
制備下列與由*所示肽T-43.0的N-端和部分氨基酸序列對應的合成寡核苷酸作為引物。
N-端5′-TAY TGG GAY TGY TGY AAR CC-3′(20聚體)(SEQ ID NO9)T-43.05′-TCI GCR TTI ARR AAC CAR TC-3′(20聚體)(SEQ ID NO10)以1μg的cDNA作為模板，在下列條件下于含1.25個單位的LA TaqDNA聚合酶(由Takra Shuzo制造)和其中所附的緩沖液、0.2mM dNTP、10％DMSO和1μM的各種引物的50μl反應溶液中進行PCR。在94℃下保持1分鐘，(94℃，30秒鐘，55.0℃，30秒鐘，72.0℃，1分鐘)×25次，然后在72.0℃下保持5分鐘。
通過該反應擴增了一個約500bp的DNA片段，利用DYEnamic ET終止子循環測序預混試劑盒(由Amersham Pharmacia Biotech制造)和ABI PRISM 310基因分析儀(由PE Applied Biosysytems制造)并按照其中所附的使用說明書進行序列測定。結果，由如此測定的核苷酸序列推導出的氨基酸序列含有所有實施例2中獲得的部分氨基酸序列。因此，將該序列作為以下篩選實驗中的一個探針。(3)纖維素酶組分NCE5基因的克隆(i)通過噬菌斑雜交的篩選將通過PCR擴增的100ng的500bp DNA片段預先用ECL直接DNA/RNA標記檢測系統(由Amersham Pharmacia Biotech制造)進行標記。
將在(1)-(iv)中制備的噬菌斑轉移到Hybond-N+尼龍轉移膜(由Amersham Pharmacia Biotech制造)上，采用0.4N氫氧化鈉進行堿處理從而使膜上的重組噬菌體DNA變性為單鏈DNA，用5×SSC(1×SSC15mM檸檬酸三鈉，150mM氯化鈉)沖洗，然后風干固定所述的DNA。接下來，按照試劑盒中的使用手冊進行雜交和檢測反應，然后對富士醫用X光膠片(FUJI MEDICAL X-RAY FILM)(由Fuji Photo Film制造)進行感光處理從而得到6個陽性克隆。(ii)噬菌體DNA的制備按照試劑盒所附的使用手冊由陽性克隆制備作為質粒DNA的DNA。
由氨芐青霉素抗性大腸桿菌菌株SOLRTM制備一種其中所述DNA片段被克隆到pBluescript SK(-)中的質粒，在與上述相同的條件下以所述質粒為模板并利用步驟(2)中使用的N-端和T-43.0引物進行PCR。結果，從一個質粒中得到一個500bp的擴增產物。由于據推定所述目的DNA被克隆到了該質粒中，所以采用EcoRI進行消化并進行瓊脂糖凝膠電泳。
結果表明，所述質粒含有一個大約1kbp的EcoRI片段。(4)cDNA核苷酸序列的測定插入到步驟(3)-(ii)中獲得的陽性重組pBluescript SK(-)質粒中的大約1kbp的EcoRI片段的核苷酸序列通過利用T3和T7引物的相同方法來測定。結果，該核苷酸序列含有一個672bp可讀框，由該可讀框分別推導出的核苷酸序列和氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO2和SEQ ID NO1表示。
而且，由于從所推導出的這種蛋白質的N-端數第18位氨基酸以后的序列與實施例2的步驟(1)中測定的25kDa蛋白質的N-端序列相同，所以表明該基因編碼25kDa蛋白質。
另外，還認為所述可讀框的第1個至第18個氨基酸的序列是一個用于將所述蛋白質分泌到胞外部分的信號序列。
將如此制備的原生質體懸浮在1ml的SUTC緩沖液中，將100μl的該懸浮液與10μg的DNA(TE)溶液(10μl)進行混合后在冰浴中保持5分鐘。接下來，與400μl的PEG溶液(60％ PEG4000，10Mm氯化鈣，10mM Tris-HCl(pH7.5))混合，將該混合物在冰浴中保持20分鐘，與10ml的SUTC緩沖液混合，然后以2500rpm離心10分鐘。將如此收集的原生質體懸浮在1ml的SUTC緩沖液中，以4000rpm離心5分鐘并最終懸浮在100μl的SUTC緩沖液中。
將如此處理的原生質體與YMG軟瓊脂一起鋪在一種含潮霉素(200μg/ml)的YMG培養基(1％葡萄糖、0.4％酵母提取物、0.2％麥芽提取物、1％瓊脂(pH6.8))上并在37℃下培養5天，將如此形成的菌落用作轉化體。實施例5pJND-c5轉化體的培養和鑒定(1)通過SDS-PAGE進行評價將質粒pJND-c5引進上述的Humicola insolens MN200-1中并篩選出40個具有潮霉素抗性的菌株。利用(N)培養基將這些菌株在37℃下培養5天，通過12％-SDS-PAGE mini(由Tefco制造)電泳分析如此獲得的培養物上清液，結果發現12個克隆中的一種被認為是NCE5的25kDa蛋白質的含量增加得尤其明顯。(2)重組NCE5的N-端氨基酸殘基的鑒定為了證實在上述步驟(1)中大量表達的所述蛋白質是由NCE5基因編碼的，對該蛋白質的N-端氨基酸序列進行了測定。首先，通過12％-SDS-PAGE mini電泳對所述培養物上清液進行分離，按照實施例2中的方法將得到的蛋白質電轉移到一種PVDF膜上，分子量為25kDa的蛋白質經過處理除去了其被修飾的N-端氨基酸殘基后進行蛋白質序列的測定。結果，其序列與由質粒pJND-c5的核苷酸序列推導出的纖維素酶NCE5的N-端氨基酸序列一致。實施例6評價由Humicola insolens表達的NCE5磨蝕被染色的粗斜紋布含纖維素織物的活性在下述條件下，利用實施例5中獲得的表達NCE5基因的Humicolainsolens的培養液以及Humicola insolens的培養液，對一條退漿12盎司的藍色牛仔褲進行磨蝕處理。按照國際公布WO98/03640的說明書通過對將表達質粒pEGD01引進Humicola insolens MN200-1后得到的轉化體進行振蕩培養來得到表達NCE4基因的Humicola insolens的培養液。在37℃下利用(N)培養基將所述轉化體振蕩培養5天。所述Humicola insolens的培養液通過在37℃下將Humicola insolensMN200-1振蕩培養5天來得到。
試驗機器20kg滌衣機(由Sanyo Electric制造的全自動洗衣機SCW5101)溫度65℃時間60分鐘pH 6.2(6.7mM磷酸鹽緩沖液)向處理溶液中加入適量的橡膠球和每種纖維素酶制劑的溶液。
利用分光光度計(由Minolta制造，CM-525i)測定一種實驗室顯示系統L值(亮度)來作為磨蝕度。通過計算相對對照(未處理的織物)增加的L值(增加的亮度)，即ΔL值，來評估磨蝕度，也就是說，對每種測試的粗斜紋布測定10個點的ΔL值(n＝10)，然后計算出它們的平均值。在此基礎上，計算出作為獲得ΔL值約為6所必需的蛋白質的內切葡聚糖酶的濃度。
通過利用蛋白質測定試劑盒(由Bio-Rad實驗室制造)制作牛血清白蛋白的標準曲線來測定所述蛋白質的濃度。
結果見表1。
表1樣品 蛋白質濃度Humicola insolens培養液80.0mg/升表達NCE4基因的Humicola insolens的培養液6.0mg/升表達NCE5基因的Humicola insolens的培養液6.0mg/升實施例7 評價由Humicola insolens表達的NCE5在磨蝕被染色的粗斜紋布含纖維素織物的過程中的逆染色在各種溫度下利用實施例5中獲得的表達NCE5基因的Humicolainsolens的培養液和表達NCE4基因的Humicola insolens的培養液對被染色的粗斜紋布含纖維素織物進行磨蝕。需要加入的酶濃度被定義為在65℃下獲得ΔL值大約為6所必需的量。
試驗結束后，為了評估逆染色，利用分光光度計(由Minolta制造，CM-525i)以實驗室顯示系統L值(亮度)的形式測定縫在所述被染色的粗斜紋布含纖維素織物組織上的一塊白棉布的白度。L值較高意味著白布較白且逆染色度較低。
所述結果見表2。與NCE4相比，在每一反應溫度下，NCE5都具有較高的磨蝕度和較低的逆染色度，因此該結果表明NCE5的逆染色度較低。
表2酶反應溫度磨蝕度(ΔL)逆染色度(L)NCE5 65℃6.00 74.9955℃8.32 75.1045℃7.74 75.33NCE4 65℃5.88 74.5355℃7.29 74.1745℃6.30 74.56實施例8利用耐洗牢度試驗儀評價由Humicola insolens表達的NCE5去除再生纖維素織物上的絨毛的作用按照下述方式評價實施例5中獲得的由Humicola insolens表達的NCE5從再生纖維素織物的一個典型例子，lyocell進行上去除絨毛的活性。
在一個大洗衣機中與一種表面活性劑和橡膠球一起進行洗滌，使得一塊被預先染色的lyocell針織布(由日本Toyoshima制造)的表面起毛。然后在下列條件下對這種起毛的lyocell針織布(由日本Toyoshima制造，10cm×10cm)進行去除lyocell絨毛的處理從而計算出完全去除所形成的絨毛所需要的由Humicola insolens表達的NCE5的蛋白質濃度。
試驗機器滌衣機L-12(日本Daiei Kagaku Seiki MFG.)溫度55℃
時間60分鐘反應溶液40ml反應pH pH5(10mM醋酸鹽緩沖液)向處理溶液中加入適量的橡膠球和所述的內切葡聚糖酶溶液。
結果表明通過加入蛋白質濃度為6mg/L的酶完全去除了所述的絨毛。實施例9評價由Humicola insolens表達的NCE5當被配制成洗滌劑時去除棉織品上的絨毛的作用按照下述方式評價實施例5中獲得的由Humicola insolens表達的NCE5去除棉織品上的絨毛的活性。即在一個大洗衣機中利用實施例5中制備的表達NCE5的Humicola insolens培養物上清液與一種表面活性劑和橡膠球一起進行洗滌，使得一塊針織棉布(2cm×15cm)的表面起毛。然后在下列條件下進行去除絨毛的處理。計算出完全去除所形成的絨毛所需要的蛋白質濃度。
試驗機器滌衣機L-12(日本Daiei Kagaku Seiki MFG.)溫度40℃時間120分鐘反應溶液40ml反應pH pH9.3(5mM碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液)(非離子表面活性劑)Persoft NK-100(由Nippon Oil & Fats制造)0.20g/L(陰離子表面活性劑)LAS(由Wako Pure Chemical Industries制造)0.10g/L向處理溶液中加入適量的橡膠球和所述的內切葡聚糖酶溶液。
結果表明通過加入蛋白質濃度為45mg/L的酶完全去除了所述的絨毛并使得布的顏色能夠變得澄明。
另外，還按照JIS L1096的45°懸臂式方法測定了棉針織物的抗彎曲性。結果表明如果不加入所述的酶處理，被測試的針織棉布片的遷移長度為127mm，如果加入15mg/L(蛋白質濃度)的NCE5進行處理，被測試的針織棉布片的遷移長度為81mm，顯然它被軟化了。實施例10評價由Humicola insolens表達的NCE5提高紙漿的打漿度的效果將蛋白質量為60μg的表達NCE5的Humicola insolens培養液加到6g干重的來源于寬葉樹的未漂白牛皮紙漿中，然后在50℃下于270ml的50mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中反應1小時。通過將所述混合物煮沸10分鐘使得所述酶失活，然后按照JIS P-8121測定打漿度(CSF)。
結果見表3。
表3樣品 CSF(ml)未加入酶試驗區 492表達NCE5的Humicola insolens培養液 519本文引用的所有出版物、專利和專利申請的全部內容被引入本申請的說明書中作為參考。
工業實用性本發明的內切葡聚糖酶NCE5可被用于洗滌劑組合物中而且還可用于使廢紙脫墨、提高紙漿的打漿度和改善含纖維素織物的性能，如絨毛的去除、手感及外觀的改善、使顏色澄明、顏色的局部改變和硬挺度的降低。
序列表<110>Meiji Seika Kaisha，Ltd.<120>含內切葡聚糖酶NCE5的纖維素酶制劑<130>PH-1228-PCT<160>12<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>223<212>PRT<213>Humicola insolens<400>1Met Gln Leu Pro Leu Thr Thr Leu Leu Thr Leu Leu Pro Ala Leu Ala1 5 10 15Ala Ala Gln Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys20 25 30Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ala Pro Val Arg Thr35 40 45Cys Asp Arg Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg Ser50 55 60Gly Cys Asp Ala Gly Gly Gly Ala Tyr Met Cys Ser Asp Gln Ser Pro65 70 75 80Trp Ala Val Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Trp Ala Ala Val Asn Ile85 90 95Ala Gly Ser Asn Glu Arg Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr100 105 110Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Arg Met Ile Val Gln Ala Ser115 120 125Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro130 135 140Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr Gly Ala145 150 155 160Pro Pro Asn Gly Trp Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Gln Arg His165 170 175Glu Cys Asp Ala Phe Pro Glu Lys Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg180 185 190Phe Asp Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg Gln195 200 205Val Ser Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Gly Cys Ser Arg210 215 220<210>2<211>672<212>DNA<213>Humicola insolens<400>2atgcagctcc ccctgaccac gctcctcacc ctcctccccg ccctcgcggc ggcccagtcc 60ggcagcggcc gcaccacgcg ctactgggac tgctgcaagc cgtcgtgcgc gtggcccggc 120aagggcccgg cgcccgtgcg gacgtgcgac cggtgggaca acccgctgtt cgacggcggc 180aacacgcgca gcgggtgcga cgcgggcggc ggcgcctaca tgtgctcgga ccagagcccg 240tgggcggtca gcgacgacct ggcgtacggc tgggcggccg tcaacattgc cggctccaac 300gagaggcagt ggtgctgcgc ctgctacgag ctgaccttca ccagcgggcc ggtggcgggc 360aagaggatga ttgtgcaggc gagcaacacg ggaggcgatt tggggaacaa ccactttgat 420attgctatgc ccggcggtgg cgtcggtatc ttcaacgcct gcaccgacca gtacggcgcg 480ccccccaacg gctggggcca gcgctacggc ggcatcagcc aacgccacga gtgcgacgcc 540ttccccgaga agctcaagcc cggctgctac tggcgctttg actggttcct caacgccgac 600aacccgagcg tcaactggcg gcaggtcagc tgcccggccg agattgtggc caagagcggc 660tgctcgcgtt aa 672<210>3<211>20<212>PRT<213>Humicola insolens<400>3Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Serl 5 10 15Cys Ala Trp Pro20<210>4<211>8<212>PRT<213>Humicola insolens<400>4Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg1 5<210>5<211>6<212>PRT<213>Humicola insolens<400>5Tyr Trp Asp Cys Cys Lys1 5<210>6<211>12<212>PRT<213>Humicola insolens<400>6Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>Humicola insolens<400>7Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr1 5 10<210>8<211>15<212>PRT<213>Humicola insolens<400>8Phe Asp Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg1 5 10 15<210>9<211>20<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述合成DNA<400>9taytgggayt gytgyaarcc 20<210>10<211>20<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述合成DNA<220><221>n<222>3<223>肌苷<220><221>n<222>9<223>肌苷<400>10tcngcrttna rraaccartc 20<210>11<211>38<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述合成DNA<400>11ggggatcctg ggacaagatg cagctccccc tgaccacg 38<210>12<211>38<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述合成DNA<400>12ggggatcctg catttaacgc gagcagccgc tcttggcc 38
權利要求
1.一種具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質，該蛋白質含有部分SEQID NO1所示的氨基酸序列或從第19位至第223位的序列，或其一種具有內切葡聚糖酶活性的修飾蛋白質。
2.如權利要求1所述的蛋白質或其一種修飾蛋白質，其中所述的蛋白質在N-端側還含有SEQ ID NO1所示的從第1位至第18個位的氨基酸序列的一部分序列或全部序列。
3.如權利要求1或2所述的酶，其中該酶來源于霉菌。
4.如權利要求3所述的酶，其中所述霉菌屬于腐質霉屬。
5.如權利要求4所述的酶，其中所述霉菌屬于Humicolainsolens。
6.一種含有編碼權利要求1至5中任一項權利要求所述的蛋白質或酶的DNA序列的DNA組分。
7.一種含有SEQ ID NO2所示DNA序列或其修飾序列的DNA組分。
8.一種含有如權利要求6或7所述的DNA序列的表達載體。
9.一種被權利要求8所述的表達載體轉化的宿主細胞。
10.如權利要求9所述的宿主細胞，其中該宿主細胞是一種酵母菌或霉菌。
11.如權利要求10所述的宿主細胞，其中所述酵母菌屬于糖酵母屬、漢遜氏酵母屬或畢赤氏酵母屬。
12.如權利要求11所述的宿主細胞，其中所述酵母菌是啤酒糖酵母。
13.如權利要求10所述的宿主細胞，其中所述霉菌屬于腐質霉屬、曲霉屬、木霉屬、鐮孢屬或支頂孢屬。
14.如權利要求10所述的宿主細胞，其中所述霉菌是Humicolainsolens、黑曲霉或米曲霉、綠色木霉、尖孢鐮孢或纖維素溶解支頂孢。
15.一種制備如權利要求1至5中任一項權利要求所述的蛋白質、其修飾蛋白質或酶的方法，包括以下步驟培養權利要求9至14中任一項權利要求所述的宿主細胞，然后從所述宿主細胞和/或其培養混合物中收集如權利要求1至5中任一項權利要求所述的酶、蛋白質或其修飾蛋白質。
16.一種通過權利要求5所述方法制備的內切葡聚糖酶。
17.一種纖維素酶制劑，其含有如權利要求1至5和權利要求16中任一項權利要求所述的蛋白質、其修飾蛋白質質或酶。
18.一種處理含纖維素織物的方法，其包括一個使得所述含纖維素織物與權利要求1至5和權利要求16中任一項權利要求所述的蛋白質、其修飾蛋白質或酶接觸或與權利要求17所述的纖維素酶制劑接觸的步驟。
19.一種降低含纖維素織物的起毛率或減少含纖維素織物中產生絨毛的方法，其包括一個使得所述含纖維素織物與權利要求1至5和權利要求16中任一項權利要求所述的蛋白質、其修飾蛋白質或酶接觸或與權利要求17所述的纖維素酶制劑接觸的步驟。
20.一種對含纖維素織物進行失重處理從而改進其手感和外觀的方法，其包括一個使得所述含纖維素織物與權利要求1至5和權利要求16中任一項權利要求所述的蛋白質、其修飾蛋白質或酶接觸或與權利要求17所述的纖維素酶制劑接觸的步驟。
21.一種使有色的含纖維素織物的顏色澄明的方法，其包括一個采用權利要求1至5中任一項權利要求和權利要求16所述的蛋白質、其修飾蛋白質或酶或權利要求17所述的纖維素酶制劑對有色的含纖維素織物進行處理的步驟。
22.一種使有色的含纖維素織物發生局部顏色改變的方法，其包括一個采用權利要求1至5和權利要求16中任一項權利要求所述的蛋白質、其修飾蛋白質或酶或權利要求17所述的纖維素酶制劑對有色的含纖維素織物進行處理的步驟。
23.一種降低含纖維素織物變得硬挺的速率或降低含纖維素織物硬挺度的方法，其包括一個采用權利要求1至5和權利要求16中任一項權利要求所述的蛋白質、其修飾蛋白質或酶或權利要求17所述的纖維素酶制劑對含纖維素織物進行處理的步驟。
24.如權利要求18至23中任一項權利要求所述的方法，其中通過浸泡、洗滌和漂洗織物來對織物進行處理。
25.一種洗滌劑添加劑，其含有以一種非散射顆粒形式或一種穩定化液體形式存在的權利要求1至5和權利要求16中任一項權利要求所述的蛋白質、其修飾蛋白質或酶或權利要求17所述的纖維素酶制劑。
26.一種洗滌劑組合物，其含有權利要求1至5和權利要求16中任一項權利要求所述的蛋白質、其修飾蛋白質或酶或權利要求17所述的纖維素酶制劑。
27.一種用于廢紙脫墨的方法，該方法包括在一個通過采用脫墨劑處理廢紙來進行脫墨的步驟中使用權利要求1至5和權利要求16中任一項權利要求所述的蛋白質、其修飾蛋白質或酶或權利要求17所述的纖維素酶制劑。
28.一種提高紙漿的打漿度的方法，該方法包括一個采用權利要求1至5和權利要求16中任一項權利要求所述的蛋白質、其修飾蛋白質或酶或權利要求17所述的纖維素酶制劑處理紙漿的步驟。
29.一種改善對動物飼料的消化能力的方法，該方法包括一個采用權利要求1至5和權利要求16中任一項權利要求所述的蛋白質、其修飾蛋白質或酶或權利要求17所述的纖維素酶制劑對含纖維素纖維進行處理的步驟。
全文摘要
本發明提供了一種內切葡聚糖酶，該酶可用于減少含纖維素纖維的絨毛、改善其手感和外觀、使顏色澄明、局部改變顏色、降低硬挺度并可用于洗滌劑組合物中，還可用于使廢紙脫墨和提高紙漿的打漿度等。從Humicola insolens中克隆了一種編碼內切葡聚糖酶NCE5的cDNA并測定了其DNA序列和由該DNA序列推導出的氨基酸序列。
文檔編號D21C9/00GK1436243SQ01811284
公開日2003年8月13日 申請日期2001年5月22日 優先權日2000年5月22日
發明者村島弘一郎, 中根公隆, 西村智子, 古賀仁一郎, 河野敏明, 隅田奈緒美, 矢內耕二, 村上健 申請人:明治制果株式會社