專(zhuān)利名稱(chēng)：一種黑曲霉原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶菌株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種內(nèi)切型菊粉酶菌株，具體是涉及一種黑曲霉原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶菌株及其制備方法，屬遺傳技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
低聚果糖是一種良好的雙歧因子和水溶性膳食纖維，可做為功能性食品或者飼料的原料或添加劑。低聚果糖具有抗腫瘤、刺激雙歧桿菌生長(zhǎng)、防治便秘、抑制腸內(nèi)腐敗物質(zhì)形成、提高機(jī)體免疫力、改善脂質(zhì)代謝、降低膽固醇等作用，同時(shí)可作為膳食纖維用于防治糖尿病和減肥，也可用來(lái)改善腸胃功能，降低血脂和預(yù)防高膽固醇病等。因此，具有重要的健康、藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值。傳統(tǒng)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)低聚果糖是由蔗糖經(jīng)果糖基轉(zhuǎn)移酶合成，反應(yīng)的副產(chǎn)物葡萄糖是酶的抑制劑，反應(yīng)進(jìn)行不徹底，混合物中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖占總量< 55%-60%(干基)，且工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高。目前，如何提高內(nèi)切型菊粉酶的酶活，是這個(gè)新工藝能否用于工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)在利用細(xì)胞誘變和工藝條件的優(yōu)化來(lái)提高微生物生產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶酶活的較多，但未有利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行菌株酶活的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種黑曲霉原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶菌株及其制備方法。它以二種黑曲霉為菌種，經(jīng)含有菊糖的培養(yǎng)基活化、牛蒡汁液體搖瓶培養(yǎng)后，利用纖維素酶和蝸牛酶水解黑曲霉菌絲細(xì)胞的細(xì)胞壁，在恒溫下振蕩，制備原生質(zhì)體；經(jīng)原生質(zhì)體融合后，內(nèi)切型菊粉酶的酶活比二個(gè)出發(fā)菌株分別提高了 33. 41%和47. 44%。原生質(zhì)體融合后再生，經(jīng)過(guò)傳代后，內(nèi)切型菊粉酶的酶活與再生菌株相比偏差較小，遺傳性狀穩(wěn)定。該菌株可用于工業(yè)化生產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶。原生質(zhì)體融合的意義在于打破了微生物的種界界限，可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組。可使遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、獲得更多基因重組的機(jī)會(huì)。可與其他育種方法相結(jié)合，如把常規(guī)誘變和原生質(zhì)體誘變所獲得的優(yōu)良性狀，組合到一個(gè)單株中，經(jīng)過(guò)原生質(zhì)體的融合和再生選育出酶活最高的菌株。本發(fā)明是以如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種黑曲霉原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶菌株，其特征是它以二種黑曲霉為菌種，經(jīng)含菊糖初篩培養(yǎng)基活化、誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)、牛蒡汁液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)后，利用復(fù)合酶液水解黑曲霉菌絲體，制備原生質(zhì)體；將二種原生質(zhì)體溶液各取lml，加入30%聚乙二醇6000 2ml和0. 01mol/L氯化鈣lml，使二種原生質(zhì)體進(jìn)行融合，再將原生質(zhì)體混合液加入到再生培養(yǎng)基中，經(jīng)再生培養(yǎng)、搖瓶液體深層發(fā)酵獲得內(nèi)切型菊粉酶發(fā)酵液，過(guò)濾取上清液，用3，5- 二硝基水楊酸比色定糖法測(cè)定內(nèi)切型菊粉酶的酶活。所述的一種黑曲霉原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶菌株，其特征是所述復(fù)合酶液為蝸牛酶和纖維素酶。一種制備權(quán)利要求1所述的黑曲霉原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶菌株的方法，其特征是按如下步驟進(jìn)行
(1)二個(gè)菌種分別接種于含菊糖的初篩培養(yǎng)基上活化1-2次，誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)1 次，取菌塊接種于牛蒡汁液體培養(yǎng)基中，28-30°C進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)4-5天；
(2)二個(gè)菌種分別取一瓶液體培養(yǎng)的菌絲，過(guò)濾，收集菌絲球，用無(wú)菌水沖洗2-3次，在無(wú)菌濾紙上吸干水分，稱(chēng)濕重；
(3)各取Ig菌絲體，放入到裝有20ml、1%酶解液1:20的IOOml錐形瓶中，在^-32 水浴、lOOr/min振蕩器中震蕩2_4h，用冰浴終止酶解，經(jīng)雙層無(wú)菌鏡頭紙過(guò)濾，用高滲緩沖溶液溶液洗滌沉淀3次，在沉淀中加入200ml高滲緩沖溶液，此為原生質(zhì)體溶液；
(4)將兩種原生質(zhì)體溶液各Iml+ 30%聚乙二醇6000 2ml + 0. Olmol/L氯化鈣lml， 30°C靜置15—20min，2000r/min離心lOmin，用無(wú)菌鏡頭紙過(guò)濾，用高滲緩沖溶液洗滌2_3 次，用高滲緩沖溶液懸浮沉淀20ml，吸0. Iml分別涂布于5個(gè)再生培養(yǎng)基中，30 培養(yǎng)2_3 天；
(5)選擇20株透明圈大的菌株，每個(gè)菌株移入2個(gè)初篩培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌絲體生長(zhǎng)出來(lái)后每個(gè)菌株挖取1 cm 2置于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)4天，發(fā)酵液過(guò)濾取上清液， 測(cè)定內(nèi)切型菊粉酶的酶活。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是采用該技術(shù)所獲得的黑曲霉菌株通過(guò)深層發(fā)酵后在培養(yǎng)液中生產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶，經(jīng)提取、分離后可水解菊糖生產(chǎn)低聚果糖，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，該方法具有較高的可重復(fù)性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明 實(shí)施例1、
將二個(gè)黑曲霉出發(fā)菌株在30 下保溫培養(yǎng)活化7天，取活化菌塊于250ml搖瓶中，28°C 搖床培養(yǎng)5天。過(guò)濾，收集菌絲球，用無(wú)菌水沖洗；各取Ig菌絲體，放入到裝有20ml、l%酶解液(1:20)的100ml錐形瓶中，在32 下振蕩酶解池，用冰浴終止酶解，經(jīng)雙層無(wú)菌鏡頭紙過(guò)濾，用高滲緩沖溶液溶液洗滌沉淀3次，在沉淀中加入高滲緩沖溶液，此為原生質(zhì)體溶液。將兩種原生質(zhì)體溶液各Iml再加入聚乙二醇6000和CaCl2溶液，2000r/min離心 lOmin，用無(wú)菌鏡頭紙過(guò)濾，用高滲緩沖溶液懸浮沉淀20ml，吸0. Iml分別涂布于再生培養(yǎng)基中，30 培養(yǎng)2天。選擇透明圈大的菌株，轉(zhuǎn)入初篩培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌絲體生長(zhǎng)出來(lái)后，菌株挖取1 cm2菌塊轉(zhuǎn)入搖床培養(yǎng)4天，發(fā)酵液過(guò)濾取上清液，測(cè)定內(nèi)切型菊粉酶的酶活，多數(shù)再生菌株的內(nèi)切型菊粉酶的酶活比二個(gè)出發(fā)菌株提高30%和42%以上。實(shí)施例2、
將在^tlC下保溫培養(yǎng)活化的二個(gè)黑曲霉出發(fā)菌株，取活化菌塊于250ml搖瓶中，30 搖床培養(yǎng)4天。過(guò)濾，收集菌絲球，用無(wú)菌水沖洗；各取Ig菌絲體，放入到裝有20ml、1%酶解液(1:20)的100ml錐形瓶中，在30 下振蕩酶解池，用冰浴終止酶解，經(jīng)雙層無(wú)菌鏡頭紙過(guò)濾，用高滲緩沖溶液溶液洗滌沉淀3次，在沉淀中加入高滲緩沖溶液，制備出原生質(zhì)體溶液。將兩種原生質(zhì)體溶液各Iml再加入聚乙二醇6000和氯化鈣溶液，2000r/min離心lOmin，用無(wú)菌鏡頭紙過(guò)濾，用高滲緩沖溶液懸浮沉淀20ml，吸0. Iml分別涂布于再生培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)4天。選擇透明圈大的菌株，轉(zhuǎn)入初篩培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌絲體生長(zhǎng)出來(lái)后，菌株挖取1 cm2菌塊轉(zhuǎn)入搖床培養(yǎng)4天，發(fā)酵液過(guò)濾取上清液，測(cè)定內(nèi)切型菊粉酶的酶活，多數(shù)再生菌株的內(nèi)切型菊粉酶的酶活比二個(gè)出發(fā)菌株提高3 和40%以上。
實(shí)施例3、
將在^tlC下保溫培養(yǎng)活化的二個(gè)黑曲霉出發(fā)菌株，取活化菌塊于250ml搖瓶中，^tlC搖床培養(yǎng)4天。過(guò)濾，收集菌絲球，用無(wú)菌水沖洗；各取Ig菌絲體，放入到裝有20ml、1%酶解液(1 20)的IOOml錐形瓶中，在^tlC下振蕩酶解4h，用冰浴終止酶解，經(jīng)雙層無(wú)菌鏡頭紙過(guò)濾，用高滲緩沖溶液洗滌沉淀3次，在沉淀中加入高滲緩沖溶液，制備出原生質(zhì)體溶液。將兩種原生質(zhì)體溶液各Iml再加入聚乙二醇6000和氯化鈣溶液，2000r/min離心lOmin，用無(wú)菌鏡頭紙過(guò)濾，用高滲緩沖溶液溶液懸浮沉淀20ml，吸0. Iml分別涂布于再生培養(yǎng)基中， ^tlC培養(yǎng)3天。選擇透明圈大的菌株，轉(zhuǎn)入初篩培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌絲體生長(zhǎng)出來(lái)后，菌株挖取1 cm 2菌塊轉(zhuǎn)入搖床培養(yǎng)4天，發(fā)酵液過(guò)濾取上清液，測(cè)定內(nèi)切型菊粉酶的酶活，多數(shù)再生菌株的內(nèi)切型菊粉酶的酶活比二個(gè)出發(fā)菌株提高30%和43%以上。再生菌株用石蠟油斜面保存。
權(quán)利要求
1.一種黑曲霉原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶菌株，其特征是它以二種黑曲霉為菌種，經(jīng)含菊糖初篩培養(yǎng)基活化、誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)、牛蒡汁液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)后， 利用復(fù)合酶液水解黑曲霉菌絲體，制備原生質(zhì)體；將二種原生質(zhì)體溶液各取lrnl，加入30% 聚乙二醇6000 2ml和O.Olmol/L氯化鈣lml，使二種原生質(zhì)體進(jìn)行融合，再將原生質(zhì)體混合液加入到再生培養(yǎng)基中，經(jīng)再生培養(yǎng)、搖瓶液體深層發(fā)酵獲得內(nèi)切型菊粉酶發(fā)酵液，過(guò)濾取上清液，用3，5- 二硝基水楊酸比色定糖法法測(cè)定內(nèi)切型菊粉酶的酶活。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黑曲霉原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶菌株，其特征是所述復(fù)合酶液為蝸牛酶和纖維素酶。
3.一種制備權(quán)利要求1所述的黑曲霉原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶菌株的方法，其特征是按如下步驟進(jìn)行(1)二個(gè)菌種分別接種于含菊糖的初篩培養(yǎng)基上活化1-2次，誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)1 次，取菌塊接種于牛蒡汁液體培養(yǎng)基中，28-30°C進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)4-5天；(2)二個(gè)菌種分別取一瓶液體培養(yǎng)的菌絲，過(guò)濾，收集菌絲球，用無(wú)菌水沖洗2-3次，在無(wú)菌濾紙上吸干水分，稱(chēng)濕重；(3)各取Ig菌絲體，放入到裝有20ml、1%酶解液1:20的IOOml錐形瓶中，在^-32 水浴、lOOr/min振蕩器中震蕩2_4h，用冰浴終止酶解，經(jīng)雙層無(wú)菌鏡頭紙過(guò)濾，用高滲緩沖溶液洗滌沉淀3次，在沉淀中加入200ml高滲緩沖溶液，此為原生質(zhì)體溶液；(4)將兩種原生質(zhì)體溶液各Iml+ 30%聚乙二醇6000 2ml + 0. Olmol/L氯化鈣lml， 30 靜置15—20min，2000r/min離心lOmin，用無(wú)菌鏡頭紙過(guò)濾，用高滲緩沖溶液溶液洗滌 2-3次，用高滲緩沖溶液懸浮沉淀20ml，吸0. Iml分別涂布于5個(gè)再生培養(yǎng)基中，30 培養(yǎng) 2-3 天；(5)選擇20株透明圈大的菌株，每個(gè)菌株移入2個(gè)初篩培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌絲體生長(zhǎng)出來(lái)后每個(gè)菌株挖取1 cm 2置于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)4天，發(fā)酵液過(guò)濾取上清液， 測(cè)定內(nèi)切型菊粉酶的酶活。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種內(nèi)切型菊粉酶菌株，具體是涉及一種黑曲霉原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶菌株及其制備方法，屬遺傳技術(shù)領(lǐng)域。該制備方法以二種黑曲霉為菌種，經(jīng)含有菊糖的培養(yǎng)基活化、牛蒡汁液體搖瓶培養(yǎng)后，利用纖維素酶和蝸牛酶水解黑曲霉菌絲細(xì)胞的細(xì)胞壁，在恒溫下振蕩，制備原生質(zhì)體；經(jīng)原生質(zhì)體融合后，內(nèi)切型菊粉酶的酶活比二個(gè)出發(fā)菌株分別提高了33.41%和47.44%。原生質(zhì)體融合后再生，經(jīng)過(guò)傳代后，內(nèi)切型菊粉酶的酶活與再生菌株相比偏差較小，遺傳性狀穩(wěn)定。該菌株可用于工業(yè)化生產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶。
文檔編號(hào)C12R1/685GK102559515SQ20111045648
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者曹澤虹, 李勇, 楊萬(wàn)根, 王衛(wèi)東, 董玉瑋 申請(qǐng)人:徐州工程學(xué)院