一種戊二醛降解菌株及制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種戊二醛降解菌株及制備方法和應用，其步驟：A、從豬場采集土樣，加至裝有無菌水的三角瓶中，搖瓶培養。B、3-5d后，取土壤溶液涂布在以戊二醛為唯一碳源的無機鹽固體培養基上，恒溫培養。C、將以戊二醛為唯一碳源的無機鹽平板上生長的單菌落挑出，繼續進行劃線分離純化，然后重新涂布到上述含戊二醛的無機鹽平板上進行培養。經分離篩選后，獲得對戊二醛具有穩定高效降解能力的菌株LP12，在LB斜面上保存備用。鑒定結果顯示LP12為氮假單胞菌。利用LP12的生物降解作用能迅速清除環境中存在的戊二醛，填補了國內戊二醛污染土壤治理的一項空白。該菌株繁殖速度快，擴大培養需要的原料低廉，生產成本低，經濟效益好，有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種戊二醛降解菌株及制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬環境污染治理領域。具體涉及一種高效修復戊二醛污染土壤的菌株，同時還涉及一種高效修復戊二醛污染土壤的菌株的制備方法，還涉及一種戊二醛降解菌株在土壤環境治理中的用途。
【背景技術】
[0002]戊二醛是一種五碳雙縮醛化合物，廣泛應用于手術器械的滅菌和環境物品的消毒及食品餐具的滅菌與消毒等領域(蔣合舉等，2007)。由于戊二醛本身的內在毒性或使用不當而造成的健康危害時有發生。它對皮膚、粘膜與呼吸道有刺激、對部分人群有致敏作用，并可引發氣喘和炎性或纖維性肺病。各國對工作場所戊二醛濃度都作出了極限規定。如美國工作場所臨界極限為0.1ppm,英國定為0.05ppm (沈偉等,2008)。我國衛生部規定,接觸皮膚或黏膜的消毒劑中戊二醛含量限制為1000mg/l (衛生部，2003)。
[0003]此外，戊二醛在畜牧品方面所造成的生產和環境安全問題也很嚴重。作為一種畜牧生產領域常用的高效消毒劑，戊二醛在防治畜牧養殖常見病害的同時也造成了環境污染。殘留在土壤中的戊二醛不僅抑制了病原微生物生長，有益微生物的繁殖和生長也受到影響(Dario Bonassi, 2003)。此外,殘留的戍二醒還對畜牧產品安全構成極大的威脅。
[0004]目前的環境治理主要是采用物理、化學或生物方法。化學處理方法會造成二次污染，物理吸附法僅僅是將戊 二醛轉移到其它的載體上，并沒有從根本上清除戊二醛。而生物降解方法可將戊二醛進行無害化轉化，實現徹底降解。不過，目前戊二醛污染問題尚未得到足夠重視，相關技術措施尤其是生物降解方法和技術手段還不成熟，尤其是戊二醛降解菌資源還相對有限，嚴重影響了利用生物降解技術處理污染土壤的效果。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是在于提供了一種戊二醛降解菌株，該菌株不僅能耐受較高濃度的戊二醛，還具有高效降解戊二醛的能力，并且性能穩定，非常適合用于治理被戊二醛污染的土壤環境。
[0006]本發明的另一個目的是在于提供了一種戊二醛降解菌株的制備方法，該方法能在較短時間內大量獲得優質高效的目的菌株，并且簡單易掌握，成本低廉。
[0007]本發明的再一個目的是在于提供了一種戊二醛降解菌株在戊二醛污染土壤治理中的應用，該應用能迅速、高效且徹底地降解污染土壤環境中的戊二醛，無殘留，無二次污染。為了實現上述目的，本發明采用以下技術措施:
[0008]一種戊二醛降解菌株的制備方法，其步驟是:
[0009]I)從華中農業大學種豬場采集土樣(任意取點)，稱取IOg加至裝有90ml無菌水的
三角瓶中，搖瓶培養。
[0010]2) 3 — 5d后，取100 μ I 土壤溶液涂布在以戊二醛為唯一碳源的無機鹽固體培養基上，28 °C恒溫培養。[0011]3)將以戊二醛為唯一碳源的無機鹽平板上生長的單菌落挑出來，繼續進行劃線分離純化，然后重新涂布到上述含戊二醛的無機鹽平板上進行培養。經3次分離篩選后，最終獲得對戊二醛具有穩定高效降解能力的菌株LP12，在LB斜面上保存備用。
[0012]4)鑒定結果顯示LP12為氮假單胞菌(Pseudomonas azotoformans),它是革蘭氏陰性桿菌，不形成芽孢，化能有機營養，嚴格好氧，在LB培養基中IOh即可到達穩定期。
[0013] 申請人:將上述分離得到的氮假單胞菌(Pseudomonas azotoformans) LP12于2012年4月24日送交中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為:CCTCCN0:M2012122。菌株LP12生物學和形態學鑒定
[0014]①.生物學特征:桿狀細菌，專性需氧，最適生長溫度20°C~28°C，菌落圓形、表面光滑、凸起、濕潤，淺黃色，有光澤，直徑2~3nm。
[0015]②.遺傳學特性:LP12的16S rDNA序列為SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。NCBI`數據庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)進行序列分析結果顯示該序列與氮假單胞菌的16Sr DNA序列具有97%的相似性，因此結合形態學觀察和分子生物鑒定確認本發明所分離的戍二醒降解菌為氮假單胞菌(Pseudomonas azotoformans)。
[0016]③.培養條件:
[0017]分離篩選所用培養基為戊二醛培養基=C5H8O2 0.5mg/l、KNO3 1900mgl、NH4N031650mg/l、KH2PO4 170mg/l、MgSO4.7H20 370mg/l、CaCl2.2H20 440mg/l，自然 pH，121°C高壓蒸汽滅菌30min。培養溫度為28°C。
[0018]保存活化以及收集該菌株所用培養基為LB培養基:胰化蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl 1(^/1，？!1為7.0~7.2，1211:高壓蒸汽滅菌301^11。培養溫度為28°C。
[0019]④.功能特性:LP12具有對戊二醛的耐受性和高效降解性，對戊二醛最高耐受濃度為1.5% (V/V)，對戊二醛最高降解率可達到98.4%。
[0020]一種戊二醛降解菌株在戊二醛污染土壤治理中的應用，其步驟是:
[0021]I)檢測污染土壤中戊二醛的初始濃度；
[0022]2)將純培養的降解菌，利用LB液體培養基在28°C，180rpm培養18h至穩定期；
[0023]3)將擴大培養的菌液均勻撒在污染土壤表層；
[0024]4) 48小時后，檢測污染土壤中戊二醛濃度。
[0025]本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果:
[0026]I)本發明填補了國內戊二醛污染土壤治理的一項空白；
[0027]2)本發明利用微生物的降解作用來清除環境中存在的戊二醛，這種微生物降解方法可將戊二醛進行無害化轉化，實現高效、迅速且徹底的降解，避免了物理治理方法的不徹底性或化學治理易造成二次污染等弊端。
[0028]3)該菌株在實驗室和土壤環境中，都保持著對戊二醛的高效降解能力，說明該菌株性能穩定，便于擴大生產和實際應用。
[0029]4)該菌株繁殖速度快，擴大培養需要的原料低廉，生產成本低，經濟效益好，有廣闊的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為一種LP12菌株革蘭氏染色的結果不意圖。[0031]圖2為一種LP12菌株的16srDNAPCR擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳分析示意圖。
[0032]圖中:M:DNA分子量標準；1:空白對照；2 =PCR擴增產物。
[0033]圖3為一種LP12菌株的生長曲線示意圖。
[0034]圖4為一種戊二醛含量與HPLC峰面積的標準曲線示意圖。
[0035]圖5為一種在LB培養基條件下，LP12菌株對戊二醛的降解曲線示意圖。
[0036]圖中:CK指示實驗條件為添加相應濃度戊二醛的LB培養基；
[0037]圖6為一種在有菌土條件下，LP12菌株對戊二醛的降解曲線示意圖。
[0038]圖中:CK指示實驗條件為添加相應濃度戊二醛的有菌土示意圖。
[0039]圖7為一種在無菌土條件下，LP12菌株對戊二醛的降解曲線示意圖。
[0040]圖中:CK指示實驗條件為添加相應濃度戊二醛的無菌土。
具體實施方案
[0041]以下敘述是根據本發明實施方案的實施例。應該說明的是，本發明的實施例對于本發明只有說明作用，而沒有限制作用。本發明中所涉及的其他各種實驗操作，均為本領域的常規技術，文中沒有特別說明的部分，本領域的普通技術人員可以參照本發明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻或相關的說明書、手冊等加以實施。
[0042]實施例1:戊二醛降解菌的篩選與鑒定
[0043]I)戊二醛降解菌的分離:
[0044]將IOg采集自華中農業大學種豬場土壤，加至裝有90ml無菌水的三角瓶中，搖瓶培養4d后，取100 μ I 土壤溶液涂布在含0.05%戊二醛(ν/ν)的無機鹽固體培養基(KNO31900mg/l、NH4NO3 1650mg/l、KH2PO4 170mg/l、MgSO4.7H20 370mg/l、CaCl2.2H20 440mg/l)上；28°C恒溫培養。將平板上生長的單菌落挑出來進行劃線分離純化，然后重新涂布到上述含戊二醛的無機鹽平板上進行培養。經3次分離篩選后，保存對戊二醛具有穩定高效降解能力的菌株，在LB斜面上保存備用。
[0045] 申請人:將上述分離得到的菌株中的一株菌命名為LP12，經鑒定為氮假單胞菌(Pseudomonas azotoformans)。 申請人:于2012年4月24日將該菌株送交中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為:CCTCC NO:M2012122o LP12菌株革蘭氏染色的結果見圖1。
[0046]2)氮假單胞菌LP12菌株的鑒定:
[0047](I)氮假單胞菌LP12菌株總DNA的分離
[0048]①收集1.5ml LP12的過夜培養物，6，OOOrpm離心5min，棄上清液；
[0049]②加入300 μ I TE，吹吸充分混勻，8，OOOrpm離心5min，棄上清液，重復2次；
[0050]③加入30 μ I 10%的SDS混合均勻，水浴37°C 30min ；
[0051]④加入5μ I蛋白酶K，50°C水浴Ih ;
[0052]⑤加入80 μ I 5Μ 的 NaCl ；
[0053]⑥加等體積的酹-仿(1:1),振蕩5min, 12，OOOrpm離心5min,使溶液分層；取上層水相到新的離心管中；
[0054]⑦重復上述操作⑥2-3次，至分層界面無蛋白析出為止；取上層水相到新的離心管中；[0055]⑧加入2倍體積的無水乙醇在-20 °C條件下靜止30min ；12, OOOrpm離心5min,棄
上清液；
[0056]⑨加入70% (ν/ν)乙醇洗漆沉淀，12，OOOrpm離心5min,棄上清,然后置于室溫自然風干后，加入50 μ I ddH20使DNA完全溶解；
[0057]⑩將抽提的總DNA取2 μ 1，用0.7% (ν/ν)的瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA質量。
[0058](2) 16S rDNA擴增和序列分析
[0059]以上述總DNA為模板，采用細菌16SrDNA通用引物:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(16sf27)和 GGTTACCTTGTTACGACTT (16rl492)，進行 PCR 反應，擴增16SrDNA片段。
[0060]按下列反應體系依次加入:
【權利要求】
1.一種戊二醒降解菌株，其特征在于:氮假單胞菌azotofOrmans')LP12，CCTCC，NO:M2012122o
2.權利要求1所 述的一種戊二醛降解菌株在戊二醛污染土壤治理中的應用。
【文檔編號】A62D3/02GK103451118SQ201210180999
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年6月4日 優先權日:2012年6月4日
【發明者】陳雯莉, 黃巧云, 駱萍 申請人:華中農業大學