本發明涉及一種光學顯微成像技術，特別涉及一種基于微粒散射光近場照明的超分辨光學顯微成像方法。

背景技術：

遠場光學受限于光學衍射極限，其成像系統的空間分辨率取決于入射波長和顯微物鏡的數值孔徑，通常不會小于入射光波長的一半。為突破衍射極限，最常用的技術為近場掃描光學顯微鏡。該技術利用有孔或者無孔探針，位于樣品表面上方數百納米的范圍內，收集樣品表面倏逝波的強度，由此獲取樣品的輪廓信息。其分辨率理論上由探針尺寸決定，目前可以達到20至50納米的空間分辨率。然而該技術最大的缺陷就是成像速度慢，通常需要幾秒甚至幾十秒來完成一幅圖，因此無法應用于實時的成像測量。

在成像過程中，如果使用的顯微物鏡具有相同的數值孔徑，明場和暗場顯微鏡的分辨率相同。由于采用了邊緣光束照明技術，相比于明場顯微鏡，暗場顯微鏡抑制了背景光線的影響，具有更好的信噪比和圖像對比度，更加適合物體邊界和輪廓的觀測。

技術實現要素：

本發明是針對現在近場掃描光學顯微鏡成像速度受限的問題，提出了一種基于微粒散射光近場照明的超分辨光學顯微成像方法，相比于逐點掃描的近場掃描光學顯微鏡，本方案具有更快的成像速度，同樣可以獲得超越衍射極限的空間分辨率。

本發明的技術方案為：一種基于微粒散射光近場照明的超分辨光學顯微成像方法，包括如下步驟：

1）在現有的暗場光學顯微鏡的基礎上增加三維移動設備，三維移動設備控制微米級的微粒移動；

2）將待測樣品置于顯微物鏡的焦平面上；

3）將微粒移動接近待測樣品表面，距離待測樣品不超過1微米；

4）入射光從側面入射，暗場光學顯微鏡對微粒周圍被散射光照亮的區域進行成像，并完成圖像采集；

5）利用三維移動設備控制微粒在樣品表面逐步按次序移動，并控制微粒距離待測樣品表面的間隔不超過1微米，每移動一步，用暗場光學顯微鏡采集一次圖像，直至完成待測樣品表面的圖像采集；

6）將所有采集圖像按次序拼接，實現待測樣品表面超分辨圖像。

所述微粒大小為1至50微米，用來散射顯微鏡的入射光。

所述三維移動設備包括三維位移平臺和微粒支架，微粒支架一端為尖端結構，尖端結構端吸附或者粘貼微粒，另一端連接至三維位移平臺，三維位移平臺通過微粒支架控制微粒在三維空間內自由移動。

本發明的有益效果在于：本發明基于微粒散射光近場照明的超分辨光學顯微成像方法，利用微粒的散射光作為顯微鏡的照明光源，實現了空間超分辨成像。相比于普通的明場或暗場顯微鏡，本發明具有更高的空間分辨率。相比于近場掃描光學顯微鏡，本發明具有更快的成像速度，不需要在樣品表面逐點掃描，每次成像范圍可以達到10 μm²。

附圖說明

圖1為本發明基于微粒散射光近場照明的超分辨光學顯微成像示意圖；

圖2為本發明成像樣品的掃描電子顯微鏡圖；

圖3為本發明三種顯微鏡模式下對同一樣品的成像效果比較圖。

具體實施方式

一種基于散射光近場照明的超分辨顯微鏡，利用大小為微米級的微粒來散射入射光，再用散射光作為顯微鏡的照明光源。由于微粒距離樣品表面很近，散射光中高頻分量經過樣品表面的調制后，將有倏逝波轉化成傳播波，再有顯微物鏡收集，成像與像平面上。由于更高空間頻率的倏逝波參與成像過程，本發明能夠突破衍射極限，獲得更高的空間分辨率。

如圖1為基于微粒散射光近場照明的超分辨光學顯微成像示意圖，該圖為實現微粒散射光照明的超分辨顯微鏡的一種例證，首先將樣品2置于顯微物鏡1的焦平面上，利用三維位移平臺6來控制微粒支架的移動，微粒支架5端口的微粒4也隨之移動，使得微粒非常接近樣品表面，通常兩者距離不超過一微米。由于微粒4對入射光的散射， 使得微粒4附近的區域3被散射光照亮，其他區域僅有入射光照明。在暗場顯微鏡下，入射光從側面入射，反射時不被顯微物鏡1收集，因此只有微粒4散射光照亮的區域3能清晰成像。再通過三維位移平臺6移動來控制微粒4來掃描整個樣品表面，即可獲得大面積超分辨圖像。微粒支架5具有尖端結構，可以吸附或者粘貼微粒，另一端連接至三維位移平臺6，控制微粒4在三維空間內自由移動。微粒用來散射顯微鏡的入射光，其大小為1至50微米，材料不限，形狀不限。

如圖2為成像樣品的掃描電子顯微鏡圖。本樣品為藍光光盤，其表面材料為非金屬高分子聚合物。此樣品的表面結構為線狀結構，其中線寬為180納米，相鄰兩條線之間的間隔為120納米。

如圖3為三種顯微鏡模式下對同一樣品的成像效果比較，所用樣品如附圖2所示。將樣品放置于普通明場顯微鏡下，并使用數值孔徑為0.8的100×顯微物鏡觀察位移焦平面上的樣品，獲得的圖像如圖3（a）所示，除了個別雜質外，樣品表面的線狀結構并不可見；換成暗場模式，線狀結構依然不可見，如圖3（b）所示；當使用本發明提到的散射光照明模式，其結果如圖3（c）所示，其中白色圓形物體為本發明中使用的微粒4，其直徑大約為7微米，在微粒旁邊有兩塊區域，見虛線框，散射光光強最大，樣品被成像到像平面，線條結構清晰可見，但成像范圍較小。為說明本發明可應用于不同數值孔徑的顯微物鏡，又采用了數值孔徑0.9的150×顯微物鏡來重復上述三種成像模式，其中圖3（d）為明場照明，圖3（e）為暗場照明，圖3（f）為微粒的散射光照明。在明場和暗場條件下，樣品表面的線條結構無法分辨，而在微粒的散射光照明下，結構清晰可見。圖3（f）中微粒直徑為4微米，相比于圖3（c）中7微米的微粒，具有更大的成像區域。所有以上結果中照明光源均為溴鎢燈，其光譜范圍包括整個可見光波段，中心波長為550納米。

在本發明中，采用暗場顯微鏡為基礎，用來降低入射光的影響，只接收散射光信號。不同于普通的暗場顯微鏡的傳播波照明，本技術采用樣品表面附近的微粒的散射光照明技術，即入射光照射在微粒上之后產生的散射光來照明樣品表面，從而獲得更高的空間分辨率。