專利名稱：利用酵母表面展示系統分析單抗的抗原表位的方法及其在疫苗開發中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用酵母表面展示系統分析單抗的抗原表位的方法及其在疫苗開發中的應用。
背景技術：
宿主的抗體反應在抵抗病原體感染的過程中起著重要作用，而體內的多克隆抗體反應是由針對不同抗原或同一抗原的不同抗原表位的單克隆抗體組成的。深入的理解這個復雜的過程能夠為研究疾病的發病機制提供關鍵的信息，還能夠為高效疫苗的研發和疾病治療提供重要的理論基礎。在抗原表位的諸多研究方法中，興起于1990年的噬菌體展示肽庫技術(kott， J. K. and G.P.Smith, Searching for peptide ligands with an epitope library. Science, 1990. 249 (4967) :p. 386-90.)，即用隨機合成的短肽文庫(一般6-12個氨基酸， 庫容量達IOll-IO12)和噬菌體展示系統進行篩選的方法，以其快捷、準確、不受氨基酸位點限制的優點而逐漸成為目前應用最廣、發展最快的抗原表位篩選平臺之一。然而，噬菌體展示肽庫技術也存在很大的局限性(1)短肽文庫可以產生的絕大部分是線性表位，不能很好地模擬占抗原表位80%以上的構象型表位；(2)噬菌體的衣殼蛋白所能容納的外源分子小、結構簡單，對外源蛋白缺乏修飾，該系統中很多細胞毒性分子和真核生物蛋白難以表達和展示；C3)噬菌體個體過小，多采用親合層析柱或親合聚苯乙烯板進行篩選，篩選效率低；(4)每輪篩選后，噬菌體必須重新感染宿主細胞以便獲得足夠的病毒粒子進行下一輪篩選，重組病毒粒子間感染能力的差別會造成一定的擴增優勢；( 噬菌體易被空氣傳播， 因而容易引起交叉污染。單克隆抗體的特點是能與抗原的專一表位結合，判斷不同來源的單克隆抗體表位的異同，對了解抗體的使用價值和大規模抗體制備等均具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用酵母表面展示系統分析單抗的抗原表位的方法及其在疫苗開發中的應用。本發明提供的分析目的蛋白的抗原表位的方法，包括如下步驟(1)構建所述目的蛋白的DNA文庫；所述DNA文庫中，所述目的蛋白的編碼基因的 DNA片段插入T載體；所述T載體含有酵母a凝集素Aga2p的編碼基因，且所述DNA片段編碼的肽片段的N端與所述酵母a凝集素Aga2p的C端融合；(2)將所述DNA文庫展示在酵母表面，得到酵母展示文庫甲；(3)將所述目的蛋白的單克隆抗體與所述酵母展示文庫甲混合，分選出與所述單克隆抗體結合的酵母；(4)將篩選出的酵母提取質粒進行測序，根據插入所述T載體的DNA片段的核苷酸序列分析所述目的蛋白的抗原表位(各個質粒中插入的共有DNA片段編碼的肽片段即為候選的識別表位)。所述T載體具體可為在PCTC0N2質粒的Nhe I和BamH I位點之間插入序列表的序列表3自5，末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的pCTC0N2_T質粒。所述目的蛋白的編碼基因的DNA片段具體插入所述PCTC0N2-T質粒的km I酶切位點。所述酵母為可釀酒酵母，優選為釀酒酵母EBY100。所述步驟(1)中，構建所述DNA文庫的方法可包括如下步驟①將所述目的蛋白的編碼基因用DNase I進行消化，回收50_100bp的DNA片段；②將步驟①回收的DNA片段進行隨機片段重組；③將步驟②重組后的DNA片段加A尾；④將步驟③得到的加A尾后的DNA片段插入所述PCTC0N2-T質粒的km I酶切位點，然后轉化宿主菌，得到所述DNA文庫。所述隨機片段重組的反應體系具體可為90ng小片段DNA，4y 1 5XPhire buffer, 0. 8 μ 1 dNTPs,0. 5μ 1 Phire DNA 聚合酶(1 個單位)，加 ddH20 至 20 μ 1。所述隨機片段重組的反應程序具體可為95°C 2分鐘；94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C N秒鐘，10個循環或15個循環；72°C 10分鐘；第1個循環時，N為60秒，自第2個循環開始，每個循環比上個循環N增加k (即第2個循環時，N為65秒，第3個循環時N為70秒，以此類推)。所述反應程序中，優選10個循環或15個循環。也可用物理剪切法、隨機引物擴增法和酶消化法等方法構建目標蛋白的DNA文庫。所述宿主菌可為大腸桿菌，優選大腸桿菌Dffia。在進行所述步驟(1)前，可先通過PCR擴增所述目的蛋白的編碼基因。所述PCR 擴增所用的酶可為高保真DNA聚合酶，優選為PyroBest DNA Polymerase0所述方法中，可利用流式細胞術進行步驟(3)中的所述分選。所述步驟O)中，將所述DNA文庫展示在所述酵母表面可包括如下步驟①提取所述步驟(1)中得到的含有所述DNA文庫的質粒，轉化所述酵母，得到重組酵母甲；②收集所述重組酵母甲誘導培養36小時以上，得到酵母展示文庫甲；所述誘導是通過向培養酵母的體系中加入半乳糖實現的。所述誘導培養的參數具體可為采用SGCAA培養基，20°C、250rpm搖床中培養36小時。SGCAA培養基的配方具體為半乳糖20g，酵母氮源6. 7g，酸水解酪素5g， NaHPO4 · 12H20 13. 6g, NaH2PO4 · H2O 8. 56g，加重蒸水至 IL0所述方法還可包括如下步驟(5)構建所述步驟(4)分析獲得的所述抗原表位的編碼序列的DNA突變文庫；所述DNA突變文庫中，所述抗原表位的編碼序列的突變DNA片段插入所述PCTC0N2-T質粒；(6)將所述DNA突變文庫展示在所述酵母表面，得到酵母展示文庫乙；(7)將所述目的蛋白的單克隆抗體和C-myc單抗一起與所述酵母展示文庫乙混合，分選出與C-myc單抗結合且與所述目的蛋白的單克隆抗體不結合的酵母；
(8)將篩選出的酵母提取質粒進行測序，根據插入所述pCTC0N2-T質粒的DNA片段的核苷酸序列與所述抗原表位的編碼序列的差異分析蛋白的抗原表位(與原基因序列進行比對，發生變化的核苷酸即為候選的破壞多肽片段與所述單克隆抗體結合的核苷酸，對應的氨基酸殘基即為蛋白與單抗結合中的關鍵氨基酸殘基)。所述步驟(5)中，構建所述DNA突變文庫的方法可包括如下步驟①通過PCR擴增所述抗原表位的編碼基因；所述PCR擴增所用的酶為低保真DNA 聚合酶，優選為rTaq酶；②將所述PCR擴增產物插入所述PCTC0N2-T質粒的km I酶切位點，然后轉化宿主菌，得到所述DNA突變文庫；所述方法中，可利用流式細胞術進行步驟(7)中的所述分選；所述步驟(6)中，將所述DNA文庫展示在所述酵母表面可包括如下步驟①提取所述步驟( 中得到的含有所述DNA突變文庫的質粒，轉化所述酵母，得到重組酵母乙；②收集所述重組酵母乙誘導培養36小時以上，得到酵母展示文庫乙；所述誘導是通過向培養酵母的體系中加入半乳糖實現的。所述誘導培養的參數具體可為采用SGCAA培養基，20°C、250rpm搖床中培養36小時。SGCAA培養基的配方具體為半乳糖20g，酵母氮源6. 7g，酸水解酪素5g， NaHPO4 · 12H20 13. 6g, NaH2PO4 · H2O 8. 56g，加重蒸水至 IL0以上任一所述方法均可應用于研究抗原和抗體相互作用。以上任一所述方法在均可應用于疫苗研發。所述目的蛋白可為序列表的序列3所示的蛋白(H5W禽流感病毒的HA蛋白)。所述目的蛋白的編碼基因優選序列表的序列4所示的DNA。所述目的蛋白可為序列表的序列1所示的蛋白(gpl60蛋白)。所述目的蛋白的編碼基因優選序列表的序列2所示的DNA。所述單抗可為2F5單抗、4E10單抗、VRCOl單抗或AVFluIgG03單抗。所述AVFluIgG03單抗的制備方法如下①合成序列表的序列6所示的輕鏈可變區基因，克隆入Pac-L-Fc載體的)(ba I和 Sac I酶切位點之間，得到重組質粒甲。②合成序列表的序列7所示的重鏈可變區基因，克隆入所述重組質粒甲的Bio I 和Spe I酶切位點之間，得到重組質粒乙；③將所述重組質粒乙導入Sf9細胞，收集培養上清，得到AVFluIgG03單抗。單克隆抗體的酵母隨機片段文庫篩選路線參見圖1。大量擴增的目的抗原基因片段經過隨機切割與重組后通過T-A連接的方式與Aga2蛋白的C端融合，然后導入酵母并在相應的誘導條件下展示在釀酒酵母表面，通過相應的單克隆抗體進行FACS篩選，獲得與單抗反應的片段，然后對共有的同單抗反應的蛋白基因片段進行隨機突變文庫的構建，通過對陰性酵母克隆的篩選，分析突變的基因位點，對單抗的識別表位進行精確的定位。在進行單克隆抗體的表位確定時，通過構建同該單抗對應的特定目的蛋白的重組文庫并將其展示在酵母表面，然后把單克隆抗體與酵母庫混合，再利用流式分選技術(FACQ篩選出與單抗反應的陽性酵母克隆。通過分析大量的陽性克隆的重復序列，就可以對單識別的抗原表位(包括線型表位和構象型表位)進行定位研究。然后對重復區序列進行隨機突變，再用同樣的單抗篩選突變的抗原蛋白文庫，篩選出不同單抗反應的陰性酵母克隆，分析突變的位點， 可對單抗的識別位點進行精確定位。利用單抗篩選得到的細胞表面表達抗原表位的酵母細胞作為免疫原，獲得同單抗具有相似特性的免疫抗體。酵母細胞還是一個有效的免疫佐劑，能夠直接免疫動物誘導特定抗體的產生，使用酵母細胞作為抗原進行免疫，還能夠有效地激活樹突狀細胞(Dendritic cell, DC)的功能，加強保護性細胞免疫應答。因此，利用單抗篩選得到的細胞表面表達抗原表位的酵母細胞作為免疫原，很可能在接受免疫的機體產生較好的體液免疫和細胞免疫效果。同傳統的抗原表位分析方法相比，利用酵母表面展示技術進行單克隆抗體識別表位的確定具有獨到的優點(1)酵母細胞對蛋白的修飾途徑更多，可以方便地展示大分子量和復雜的蛋白，因此可用于篩選單抗的空間構象表位；(2)酵母可采用FACS逐個篩選，大大提高準確性與篩選通量；C3)酵母可獨立完成自身的生長復制過程，操作簡便，干擾因素少；(4)酵母本身即為免疫佐劑，可檢驗抗原表位能否再誘導類似活性的抗體產生。


圖1為單克隆抗體的酵母隨機片段文庫篩選路線。圖2為構建gpl60蛋白的DNA文庫過程中的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為2F5單抗識別的抗原表位的序列分析。圖4為4E10單抗識別的抗原表位的序列分析。圖5為應用AVFluIgG03單抗的分選效果評價。圖6為實施例5中各組小鼠血清的效價檢測結果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。釀酒酵母EBY100 :invitrogen公司，產品目錄號C839-00。Biomed質粒小提試劑盒博邁德公司。大腸桿菌DH5a 天根公司。Phire DNA聚合酶(Phire hot-start DNA Polymerase) :New England Biolabs。 Hlcarrier DNA (Iifefl DNA) =Merck 產品目錄號CB^2012。HA蛋白購自北京義翹神州生物技術有限公司，Catalog Number 11048-V08H1。2F5 單抗獲自 NIH AIDS Research&Reference Reagent Program, Catalog Number :14750 4E10 單抗獲自 NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, Catalog Number :10091o VRCOl 單抗獲自 NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, Catalog Number :12033。2F5 單抗、4E10 單抗和 VRCOl 單抗均為對HIV-1 具有廣譜中和活性的單抗，其中2F5和4E10的抗原識別序列為線性表位，分別為ELDKWA和NWFDIT ； VRCOl則是針對CD4bs區的廣譜中和抗體，其識別的表位是一個構象性表位。pCTC0N2質粒(酵母展示載體)由MIT Dane Wittrup教授惠贈，公眾可以從清華大學獲得；參考文獻:Chao, G. , et al. , Isolating and engineering human antibodiesusing yeast surface display. NATURE PROTOCOLS,2006. 1(2) :p. 755—768)。Pac-L-Fc 載體參考文獻Yao LS, et al. Generation of human recombinant antibody Fab fragment and its IgG to adeno—associated virus type II from phage display library. Zhonghua Shi Yah He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. 2003Sep ； 17(3) :240-3.。Sf9 細胞參考文獻:Sun L, et al. Generation, characterization and epitope mapping of two neutralizing and protective human recombinant antibodies against influenza A H5Nlviruses. PLoS One. 2009 ；4 (5) :e5476. Epub 2009May 7.。YPD培養基葡萄糖2g，蛋白胨2g，酵母提取物lg，加重蒸水至100ml。SDCAA培養基葡萄糖20g，酵母氮源6. 7g，酸水解酪素5g，NaHPO4 · 12H20 13. 6g， NaH2PO4 · H2O 8. 56g，加重蒸水至 IL0SDCAA平板葡萄糖20g，酵母氮源6. 7g，酸水解酪素5g，瓊脂粉15g， NaHPO4 · 12Η2013· 6g, NaH2PO4 · H2O 8. 56g，加重蒸水至 IL0SGCAA培養基半乳糖20g，酵母氮源6. 7g，酸水解酪素5g，NaHPO4 · 12H20 13. 6g， NaH2PO4 · H2O 8. 56g，加重蒸水至 IL0實施例1、pCTC0N2-T質粒(重組酵母展示載體)的構建為了便于建庫，需要將PCTC0N2質粒改造成T載體，步驟如下1、合成序列表的序列5所示的DNA(雙鏈)。 5，-AGTCGCTAGC CCAGGGATAGGGTGGCCACCCTATCCCTGG GGATCCGGGT-3，(序列 5)。左邊的下劃線標注Nhe I識別序列，右邊的下劃線標注BamH I識別序列，粗體標注兩個km I識別序列。2、用限制性內切酶Nhe I和BamH I雙酶切步驟1合成的DNA，回收酶切產物。3、用限制性內切酶Nhe I和BamH I雙酶切pCTC0N2質粒，回收載體骨架。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到PCTC0N2-T質粒(骨架載體為pCTC0N2質粒，在骨架載體的Nhe I和BamH I位點之間插入了序列表5自5’末端第 11至40位核苷酸所示的DNA)。pCTC0N2-T質粒在pCTC0N2質粒里引入了兩個)(cm I酶切位點，用限制性內切酶km I酶切會形成T尾。實施例2、AVFluIgG03單抗的制備1、合成序列表的序列6所示的輕鏈可變區基因，克隆入I^c-L-Fc載體(德國 PROGEN PR3003)的Xba I和Me I酶切位點之間，得到重組質粒甲。2、合成序列表的序列7所示的重鏈可變區基因，克隆入重組質粒甲的)(ho I和 SpeI酶切位點之間，得到重組質粒乙。3、采用美國Pharmogen公司的BaculoGold共轉染試劑盒，將重組質粒乙導入Sf9 細胞，收集培養上清，得到AVFluIgG03單抗。實施例3、應用本發明的方法分析gpl60蛋白的抗原表位一、構建gpl60蛋白的DNA文庫(隨機切割片段文庫)構建gpl60蛋白的DNA文庫，首先將gpl60蛋白的編碼基因通過DNase I進行隨機切割，獲得約50-100bp的小片段，然后通過隨機重組得到具有特定長度分布的隨機片段 DNA 文庫(Lin, Ζ. , S. Li and Y. Chen, Identification of Viral Peptide Fragments forVaccine Development. Viral Applications of Green Fluorescent Protein :Methods and Protocols，2009 :p.261-274. ；Chen，Y.，et al.，Random dissection to select for protein split sites and its application in protein fragment complementation. PROTEIN SCIENCE, 2009. 18(2) :p. 399-409.)。上述方法非常類似于 DNA shuffling 的程序(Lorimer，I.and I. Pastan，Random recombination of antibody single-chain fv sequences after fragmentation with dnasei in the presence of Mn2+. Nucleic Acids Res, 1995. 23(15) :p. 3067-3608.)，巧妙地利用片段重組過程來調節隨機片段DNA文庫的分布，可根據篩選需要構建更為合理的文庫，為獲得關鍵的構象型抗原表位提供基礎。1、大量擴增目的基因①進行目的基因PCR擴增合成序列表的序列2所示的gpl60蛋白的編碼基因(序列2所示蛋白編碼序列表的序列1所示的gpl60蛋白，即HIV-1B’亞型毒株的膜蛋白)作為模板，用gpl60-F和 gpl60-R組成的引物對進行PCR擴增(所用的DNA聚合酶為Takara公司生產的PyroBest DNA Polymerase, 一種高保真聚合酶)，得到PCR擴增產物(模板DNA)。gpl60-F:5，-ATGAGAGTGACGGGG-3，；gpl60-R :5，-TAGCAAAGCCCTTTC-3，。②采用QIAquick PCR Purification Kit純化回收PCR擴增產物，進行DNA定量 (DNA的濃度應大于130ng/y 1)。2、DNase I 隨機消化①準備DNase I 底物溶液；4 μ g 模板 DNA、2. 5 μ 1 IM Tris-Cl (ρΗ7· 5)，10 μ 1 50mMMnCl2,加 ddH20 至 49 μ 1。②加入Ιμ DNase I (0. 075U)(購自 Worthington 公司，產品目錄號 LS006361)， 15°C 反應 4min。③加入10 μ 1 0. 5Μ EDTA水溶液終止反應。④90°C放置10分鐘，進一步使DNase I失活。3、純化DNase I酶切片段產物①使用I^all超濾濃縮離心管(截留分子量為30K)過濾去除步驟2的反應體系中的模板DNA。②將步驟①收集的濾液通過Mil超濾濃縮離心管(截留分子量為3K)，回收分子量為I以下的小片段DNA。采用Nanodrop 2000分光光度計(Thermo)確定DNA濃度。步驟②得到的小片段DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖見見圖2A的泳道1，大小為 50-100bp。4、小片段DNA的重組將步驟3得到的小片段DNA進行隨機片段重組，得到隨機片段。重組反應體系90ng小片段 DNA，4y 1 5 X Phire buffer, 0. 8 μ 1 dNTPs，0. 5μ1 Phire DNA聚合酶(1個單位)，加ddH20至20 μ 1。重組反應程序95°C 2分鐘；94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C N秒鐘，15個循環； 720C 10分鐘；4°C保存。第1個循環時，N為60秒，自第2個循環開始，每個循環比上個循環N增加k ；即第2個循環時，N為65秒，第3個循環時N為70秒，以此類推)。
得到的隨機片段用QIAquick PCR Purification Kit純化并定量其濃度。隨機片段的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2B的泳道1，大小為IOO-SOObp。5、隨機片段加A尾將步驟4得到的隨機片段采用Α-tailing DNA Kit(Takara)按試劑盒的說明書加 A尾，具體步驟如下在微量離心管中配制如下加“A”反應液(50ul) :10XA_Tailing Buffer 5μ 1, dNTP Mixture 4 μ 1，A-Tailing Enzyme 0· 5 μ 1，隨機片段 2 μ g，加 ddH20 至 50 μ 1 ;72°C 反應20分鐘，然后冰浴4分鐘；然后用QIAquick PCR Purification Kit純化，并用 Nanodrop2000分光光度計定量DNA片段濃度。6、載體骨架的制備用限制性內切酶)(cm I酶切pCTC0N2-T質粒，得到載體骨架。酶切體系pCTC0N2-T質粒 24μ g，10XNEB buffer2 10 μ 1，10XBSA Ιμ ，限制性內切酶)(cm I 2μ 1，加 ddH20 至 100μ 1。反應條件37°C水浴4小時(3-6小時均可)。采用QIA quick Gel Extraction Kit回收酶切產物。將回收的酶切產物用 QIAquick PCR Purification Kit純化，并用Nanodrop2000分光光度計定量DNA片段濃度。7、隨機片段庫與載體的結合將步驟5力Π“Α”后的隨機片段和步驟6的載體骨架恒溫金屬浴16°C連接過夜(12 小時以上均可)。連接體系10XT4 ligase buffer 20 μ 1，加“Α”后的隨機片段1 μ g，骨架載體 4yg，T4 ligase (New England Biolabs) 10 μ 1，力口 ddH20 至 200 μ 1。8、電轉①用QIAquick PCR Purification Kit純化步驟7的連接混合物。②將純化后的片段電轉到大腸桿菌Dffia細胞中。③涂LB平板(含50mg/ml氨芐青霉素)，37°C溫箱中過夜培養，次日查看轉化結果，統計板上的菌落數(庫容量)。庫容量為500，000左右。隨機挑取10個單菌落，采用 PCTC0N2質粒上下游的測序引物通過PCR進行插入片段大小的鑒定(圖2C。1至12為不同單克隆的PCR擴增產物)。④采用刮板器刮干凈LB平板上的菌落，放入60ml LB培養基(含100mg/ml氨芐青霉素)，即為gpl60蛋白的DNA文庫。二、酵母轉化、培養和誘導1、酵母轉化平行進行10組酵母轉化，每組均采用如下方法(1)從YPD平板上挑取一個新鮮的釀酒酵母EBY100單克隆至5ml YPD液體培養基，30°C 250rpm過夜培養；(2)將過夜培養物稀釋至0D600值為0. 4-0. 5，在30°C搖床中繼續培養至0D600值達到2(約4小時)；(3)室溫1500g離心5分鐘，棄上清，收集酵母細胞；用25ml無菌水重懸酵母細胞， 室溫1500g離心5分鐘，棄上清，收集酵母細胞；(4)用Iml 0. IM醋酸鋰溶液重懸酵母細胞，30°C水浴10分鐘，然后13000g離心k，棄上清，收集酵母細胞；(5)用0. 5ml 0. IM醋酸鋰溶液重懸酵母細胞，50ul每管分裝(感受態細胞)；(6)將單鏈carrier DNA放入沸水中水浴5分鐘，然后立即取出冰浴；(7)采用Biomed質粒小提試劑盒(博邁德)提取步驟一得到的DNA文庫的質粒， 將ι μ g質粒稀釋至50ui ；(8)取一管步驟( 得到的感受態細胞，13000g離心k，棄上清；依次加入240 μ 1 50% PEG溶液、36 μ 1 IM醋酸鋰溶液、25 μ 1單鏈carrier DNA、50ul步驟(7)的質粒，充分混勻；30°C水浴30分鐘，然后42°C水浴15分鐘；13000g離心k，棄上清，收集酵母細胞；(9)用Iml無菌水重懸酵母細胞，取出IOOul涂SDCAA平板，在30°C恒溫箱中放置約48小時，能看到明顯的菌落，統計菌落數，計算酵母轉化效率。每一組的轉化效率(菌落數)為50，000-100, 000,10組的庫容量就是500，000-1000, 000,能夠涵蓋通過理論計算的絕大多數克隆。2、誘導(1)每組剩余的900ul菌液用IOml SDCAA重懸后混合在一起，30°C，250rpm搖床中培養至0D600約為3 (24小時)。( 取500微升菌液，室溫8000rpm離心1分鐘，棄上清，用Iml SGCAA培養基重懸細胞，然后稀釋至0D600在0. 5-1之間；(3) 200C 250rpm搖床中誘導36小時，得到的菌液即為酵母展示文庫。三、分析gpl60蛋白針對2F5單抗的抗原表位1、酵母展示文庫的FACS分選將步驟二得到的酵母展示文庫進行FACS分選，步驟如下①將酵母展示文庫(IO7-IO8個細胞)裝入1. 5ml Ep管中，8000rpm(或> 8000rpm 也可)離心1分鐘，棄上清；②加入1ml PBS，輕彈管壁將酵母重懸，8000rpm離心1分鐘，取沉淀；重復此操作一次；③加入用50ul蛋白濃度為10ug/ml的2F5單抗，輕彈混勻，冰浴1小時，期間每隔 15-20分鐘輕彈管壁；④加入Iml PBS，混勻，8000rpm 4°C離心1分鐘，取沉淀；重復此操作一次；⑤加入用50ul PBS 100倍稀釋的熒光標記的二抗(PE標記羊抗鼠IgG，購自Santa Cruz公司，貨號sc-3738)，輕彈混勻，冰浴45分鐘，期間每隔15-20分鐘輕彈管壁(注意避光)；⑥加入Iml PBS，混勻，8000rpm 4°C離心1分鐘，取沉淀(酵母)；重復此操作一次；⑦用PBS重懸酵母(3_細1 PBS)轉移到流式細胞儀進行FACS分選，收集與單抗結合的酵母細胞。2、FACS分選效果評價將步驟1分選得到的酵母細胞(10萬-50萬)轉移到試管中，加入SDCAA培養基至總體積為anl，將試管置于30°c搖床中，讓酵母復蘇2-3小時。取出200ul (大約5000-10000 個酵母細胞)復蘇的菌液涂SDCAA平板，將平板倒置在30°C恒溫箱中，48小時后收菌，得到陽性單克隆。從平板上挑取陽性單克隆單菌落到5-6ml SDCAA培養基中，在30°C、250rpm搖床中生長二4小時后0D600大約為6-8 ；取部分菌液離心棄上清，用SGCAA培養基重懸細胞使其0D600在0. 5-1之間，20°C、250rpm搖床中誘導36小時后進行FACS分析。FACS分析方法同步驟三的1中FACS分選的方法，差別僅在于步驟①中取IO6-IO7個細胞，步驟⑦中用 0.5-lml PBS重懸酵母。24個單克隆FACS分析為陽性。3、測序及序列分析①對于步驟三的3中FACS分析為陽性的單克隆，擴大培養后，用甘油凍存菌種 (甘油終濃度15% )，剩余全部菌液用質粒小提試劑盒提取質粒；②由于從酵母中提取的質粒拷貝數很低，將提取的質粒轉化到大腸桿菌Dffia，然后進行測序(檢測插入PCTC0N2-T質粒中的片段的核苷酸序列)。③序列分析采用kquencher軟件將插入到pCTC0N2載體中的隨機片段與gpl60蛋白編碼基因的全長序列進行比對，結果見圖3。Sequencher軟件按照軟件的操作手冊進行分析。經過序列比對發現，2F5單抗對各個單克隆的共有識別序列為LELDKWA，同已知的識別序列均一致，表明本發明提供的方法對于抗原表位的定位非常精確。四、分析gpl60蛋白針對4E10單抗的抗原表位用4E10單抗代替2F5單抗，其它同步驟三。25個單克隆FACS分析為陽性。FACS分析為陽性的單克隆的序列分析結果見圖 4。經過序列比對發現，4E10單抗對各個單克隆的共有識別序列為WASLWNWFDIT，同已知的識別序列均一致，表明本發明提供的方法對于抗原表位的定位非常精確。五、分析gpl60蛋白針對VRCOl單抗的抗原表位用VRCOl單抗代替2F5單抗，其它同步驟三。32個單克隆FACS分析為陽性。VRCOl單抗對各個單克隆的共有識別序列為序列表的序列1自N末端第257至471位氨基酸殘基，是一個構象性表位，包括了膜蛋白的V3、 V4和V5區段，而HIV的⑶4bs區即包括在內。實施例4、精確確定H5m_HA蛋白針對AVFluIgG03單抗的抗原識別表位一、構建H5m_HA蛋白的DNA文庫(隨機切割片段文庫)1、大量擴增目的基因①進行目的基因PCR擴增合成序列表的序列4所示的H5m_HA蛋白的編碼基因(序列表的序列4所示DNA 編碼序列表的序列3所示的H5m-HA蛋白)，作為模板，用HA-F和HA-R組成的引物對進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物(模板DNA)。HA-F 5' -GATCAGATTTGCATTGGTTA-3，；HA-R 5’ -TATTTGGTAAGTTCCTATTG-3’。②采用QIAquick PCR Purification Kit純化回收PCR擴增產物，進行DNA定量 (DNA的濃度應大于130ng/y 1)。步驟2至8同實施例3的步驟一的2至8。二、酵母轉化、培養和誘導
同實施例3的步驟二。三、初步確定H5m_HA蛋白針對AVFluIgG03單抗的抗原表位將步驟二得到的酵母展示文庫進行FACS分選用AVFluIgG03單抗代替2F5單抗， 其它同實施例3的步驟三。應用AVFluIgG03單抗篩選，7個單克隆FACS分析為陽性。經過序列比對發現， AVFluIgG03單抗對H5m-HA蛋白的識別序列為序列表的序列3自N末端第51至260位氨基酸殘基(對應序列表的序列4自5’末端第241至774位核苷酸)。這個單抗的識別序列位于H5W的HAl區段，該表位為一構象性抗原表位。四、精確確定H5m_HA蛋白針對AVFluIgG03單抗的抗原識別表位(一)構建H5m_HA蛋白的突變DNA文庫1、大量擴增針對步驟三發現的抗原表位的突變DNA片段①合成序列表的序列4所示的H5m_HA蛋白的編碼基因，作為模板，用HA-F和 HA-R組成的引物對進行PCR擴增(所用的DNA聚合酶為Takara公司的rTaq酶，該酶的保真性較低，容易產生突變)，得到PCR擴增產物(突變DNA片段)。Fl 5' -GAGCGCTAGCATTTTAAGAGATTGTA-3’ (下劃線標注 NheI 識別序列)；Rl :5，-TAGTGGATCCCCCTTTCTTGACAATTTT-3‘(下劃線標注 BamHI 識別序列)。②采用QIAquick PCR Purification Kit純化回收PCR擴增產物，進行DNA定量 (DNA的濃度應大于130ng/y 1)。2、用限制性內切酶NheI和BamHI雙酶切步驟1的PCR擴增產物，回收酶切產物。3、載體骨架的制備用限制性內切酶NheI和BamHI雙酶切pCTC0N2_T質粒，得到載體骨架。酶切體系pCTC0N2-T質粒 24 μ g, IOXNEB buffer2 60 μ 1，100XBSA 6 μ 1，限制性內切酶 NheI 和 BamHI 各 12 μ 1，加 ddH20 至 600 μ 1。反應條件37°C水浴4小時(3-6小時均可)。采用QIA quick Gel Extraction Kit回收酶切產物。將回收的酶切產物用 QIAquickPCR Purification Kit純化，并用Nanodrop2000分光光度計定量DNA片段濃度。4、隨機突變庫與載體的結合將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架恒溫金屬浴16°C連接過夜(12小時以上均可)。連接體系=IOXiM ligase buffer 20 μ 1，酶切產物1 μ g，骨架載體4 μ g，T4 ligase (New England Biolabs) 10 μ 1，力口 ddH20 至 200μ1。5、電轉①用QIAquick PCR Purification Kit純化步驟4的連接混合物。②將純化后的片段電轉到大腸桿菌Dffia細胞中。③涂LB平板(含50mg/ml氨芐青霉素)，37°C溫箱中過夜培養，次日查看轉化結果，統計板上的菌落數(庫容量)。庫容量為500，000左右。④采用刮板器刮干凈LB平板上的菌落，放入60ml LB培養基(含100mg/ml氨芐青霉素)，即為隨機突變庫。( 二)酵母轉化、培養和誘導同實施例3的步驟二。
(三)精確分析單抗AVFluIgG03的抗原表位1、FACS 分選將步驟二得到的酵母展示文庫進行第一次FACS分選用C-myc單抗和 AVFluIgG03單抗代替2F5單抗，同時加入兩種二抗(PE標記羊抗鼠IgG和FITC標記羊抗雞 IgG)，其它同實施例3的步驟三的1 ；收集與C-myc單抗結合且與AVFluIgG03單抗不結合的酵母細胞進行第二次FACS分選用C-myc單抗和AVFluIgG03單抗代替2F5單抗，同時加入兩種二抗(PE標記羊抗鼠IgG和FITC標記羊抗雞IgG)，其它同實施例3的步驟三的1 ；收集與C-myc單抗結合且與AVFluIgG03單抗不結合的酵母細胞進行第三次FACS分選用C-myc 單抗和AVFluIgG03單抗代替2F5單抗，同時加入兩種二抗(PE標記羊抗鼠IgG和FITC標記羊抗雞IgG)，其它同實施例3的步驟三的1 ；收集與C-myc單抗結合且與AVFluIgG03單抗不結合的酵母細胞。2、FACS分選效果評價用C-myc單抗和AVFluIgG03單抗代替2F5單抗，同時加入兩種二抗(PE標記羊抗鼠IgG和FITC標記羊抗雞IgG)，其它同實施例3的步驟三的2。分選前的酵母展示文庫(A)、第一次分選后收集的酵母細胞(B)、第二次分選后收集的酵母細胞(C)和第三次分選后收集的酵母細胞(D)的FACS圖譜見圖5。第三次分選后，共得到41個與C-myc單抗結合且與AVFluIgG03單抗不結合的單克隆。3、測序及序列分析同實施例3的步驟三的3。41個單克隆中，27個為單點突變的克隆。與序列表的序列4所示的H5m_HA蛋白的編碼基因比對，27個單點突變的克隆中的單點突變(重復克隆不計)見表1(發生位置的數字均表示序列表的序列4自5’末端的位數，數字前面為突變前得核苷酸，數字后面為突變后的核苷酸)。表1測序結果
權利要求
1.分析目的蛋白的抗原表位的方法，包括如下步驟(1)構建所述目的蛋白的DNA文庫；所述DNA文庫中，所述目的蛋白的編碼基因的DNA 片段插入T載體；所述T載體含有酵母a凝集素Aga2p的編碼基因，且所述DNA片段編碼的肽片段的N端與所述酵母a凝集素Aga2p的C端融合；(2)將所述DNA文庫展示在酵母表面，得到酵母展示文庫甲；(3)將所述目的蛋白的單克隆抗體與所述酵母展示文庫甲混合，分選出與所述單克隆抗體結合的酵母；(4)將篩選出的酵母提取質粒進行測序，根據插入所述T載體的DNA片段的核苷酸序列分析所述目的蛋白的抗原表位。
2.如權利要求2所述的方法，其特征在于在進行所述步驟(1)前，先通過PCR擴增所述目的蛋白的編碼基因；所述PCR擴增所用的酶為高保真DNA聚合酶；優選為PyroBest DNA Polymerase。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述T載體為在pCTC0N2質粒的NheI 和BamH I位點之間插入序列表的序列表5自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的pCTC0N2-T質粒；所述目的蛋白的編碼基因的DNA片段插入所述pCTC0N2_T質粒的Xcm I酶切位點；所述酵母為釀酒酵母，優選為釀酒酵母EBYlOO。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)中，構建所述DNA文庫的方法包括如下步驟①將所述目的蛋白的編碼基因用DNaseI進行消化，回收50_100bp的DNA片段；②將步驟①回收的DNA片段進行隨機片段重組；③將步驟②重組后的DNA片段加A尾；④將步驟③得到的加A尾后的DNA片段插入所述PCTC0N2-T質粒的kmI酶切位點， 然后轉化宿主菌，得到所述DNA文庫。
5.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，利用流式細胞術進行步驟(3)中的所述分選。
6.如權利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于步驟⑵中，將所述DNA文庫展示在所述酵母表面包括如下步驟①提取所述步驟(1)中得到的含有所述DNA文庫的質粒，轉化所述酵母，得到重組酵母甲；②收集所述重組酵母甲誘導培養36小時以上，得到酵母展示文庫甲；所述誘導是通過向培養酵母的體系中加入半乳糖實現的。
7.如權利要求3至6中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟(5)構建所述步驟(4)分析獲得的所述抗原表位的編碼序列的DNA突變文庫；所述DNA 突變文庫中，所述抗原表位的編碼序列的突變DNA片段插入所述PCTC0N2-T質粒；(6)將所述DNA突變文庫展示在所述酵母表面，得到酵母展示文庫乙；(7)將所述目的蛋白的單克隆抗體和C-myc單抗一起與所述酵母展示文庫乙混合，分選出與C-myc單抗結合且與所述目的蛋白的單克隆抗體不結合的酵母；(8)將篩選出的酵母提取質粒進行測序，根據插入所述PCTC0N2-T質粒的DNA片段的核苷酸序列與所述抗原表位的編碼序列的差異分析蛋白的抗原表位。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟( 中，構建所述DNA突變文庫的方法包括如下步驟①通過PCR擴增所述抗原表位的編碼基因；所述PCR擴增所用的酶為低保真DNA聚合酶；優選為rTaq酶；②將所述 PCR擴增產物插入所述pCTC0N2-T質粒的km I酶切位點，然后轉化宿主菌，得到所述DNA 突變文庫；所述方法中，利用流式細胞術進行步驟(7)中的所述分選；所述步驟(6)中，將所述DNA文庫展示在所述酵母表面包括如下步驟①提取所述步驟 (5)中得到的含有所述DNA突變文庫的質粒，轉化所述酵母，得到重組酵母乙；②收集所述重組酵母乙誘導培養36小時以上，得到酵母展示文庫乙；所述誘導是通過向培養酵母的體系中加入半乳糖實現的。
9.權利要求1至8中任一所述方法在研究抗原和抗體相互作用中的應用。
10.權利要求1至8中任一所述方法在疫苗研發中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種利用酵母表面展示系統分析單抗表位的方法及其在疫苗開發中的應用。本發明提供的方法，包括如下步驟(1)構建目的蛋白的DNA文庫；(2)將DNA文庫展示在酵母表面，得到酵母展示文庫；(3)將目的蛋白的單抗與酵母展示文庫甲混合，分選出與單抗結合的酵母；(4)將篩選出的酵母提取質粒進行測序，分析所述目的蛋白的抗原表位。同傳統方法相比，本發明的優點(1)酵母細胞對蛋白的修飾途徑更多，可以展示大分子量和復雜蛋白；(2)酵母可采用FACS逐個篩選，提高準確性與篩選通量；(3)酵母可獨立完成自身的生長復制過程，操作簡便，干擾因素少；(4)酵母本身即為免疫佐劑，可檢驗抗原表位能否再誘導類似活性的抗體產生。
文檔編號C40B50/06GK102321146SQ20111020680
公開日2012年1月18日 申請日期2011年7月22日 優先權日2011年7月22日
發明者史宣玲, 姚辰, 左騰, 張林琦, 汪樺 申請人:清華大學