重組dna序列、酵母菌、乙肝表面抗原制備方法及疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種重組DNA序列、酵母菌、乙肝表面抗原制備方法及疫苗。本發(fā)明的重組DNA序列是將乙型肝炎病毒表面抗原的編碼基因根據(jù)多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)的密碼子使用頻率進(jìn)行密碼子優(yōu)化后得到的。本發(fā)明還提供包含有所述的重組DNA序列的重組多形漢遜酵母菌；將上述重組酵母菌制備adr亞型乙型肝炎表面抗原的方法；以及所得到的乙型肝炎疫苗。本發(fā)明的adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原的重組DNA序列表達(dá)水平高；本發(fā)明的重組酵母菌生長速率快、HBsAg的產(chǎn)率高，能利用廉價的化學(xué)合成培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞高密度發(fā)酵，發(fā)酵染菌率低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明HBsAg adr疫苗有誘導(dǎo)更強的Th1和Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答的趨勢。
【專利說明】重組DNA序列、酵母菌、乙肝表面抗原制備方法及疫苗

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地講，本發(fā)明涉及一種adr亞型乙型肝炎表面抗 原（HBsAg)的重組DNA序列及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 中國屬于乙型肝炎高發(fā)地區(qū)，乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)的攜帶率達(dá)10%左 右。目前控制乙型肝炎的方法主要依靠預(yù)防，乙型肝炎疫苗是預(yù)防乙型肝炎的最有效武器。 通過從乙肝病人的血液中分離純化HBsAg亞病毒顆粒，研制成功了第一代血源多肽乙型肝 炎疫苗。后來應(yīng)用最簡單的真核細(xì)胞-釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)作為受體 細(xì)胞，人們又成功地構(gòu)建了 DNA重組HBsAg工程菌株，它表達(dá)的HBsAg在酵母細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 上組裝成為亞病毒顆粒，從而成為研制第二代基因重組多肽乙型肝炎疫苗的原料。
[0003] 目前在生產(chǎn)重組HBsAg時，大多采用的是釀酒酵母工程菌。有關(guān)使用釀酒酵母生 產(chǎn)重組HBsAg的工藝和方法可參見美國專利US5, 013, 650、美國專利US6, 232, 111、韓國專 利KR9014361、中國專利申請公開CN1552857A、中國專利申請公開CN1552893A等。但是這 一表達(dá)系統(tǒng)在應(yīng)用過程中也存在諸多不足之處，如外源基因表達(dá)水平不高、表達(dá)蛋白的分 泌水平低、多肽鏈糖基化過度、菌株不穩(wěn)定等。
[0004] 而其它的酵母菌株，尤其是甲醇營養(yǎng)型酵母在外源基因的表達(dá)上則顯示出更大的 優(yōu)勢，這其中的多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha)是目前國際上公認(rèn)的最為理想的外 源基因表達(dá)系統(tǒng)之一，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)外源蛋白。多形漢遜酵母的技術(shù)優(yōu)勢和產(chǎn)業(yè) 化應(yīng)用價值可歸納為：①多形漢遜酵母的外源基因整合于細(xì)胞染色體中，重組菌株有絲分 裂遺傳穩(wěn)定性高；②可利用甲醇氧化酶基因（Μ0Χ)和甲醛脫氫酶基因（FMD)等強啟動子，高 效地啟動外源基因的表達(dá)；③具有自主復(fù)制序列（HARS)，重組的頻率商，重組質(zhì)粒可以商 拷貝整合到染色體上，易獲得高拷貝整合的轉(zhuǎn)化子；④蛋白的表達(dá)可在過氧化物酶體內(nèi)進(jìn) 行，可使其免受細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的降解，并降低了對細(xì)胞的毒害作用；⑤能利用廉價的化學(xué)合 成培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞高密度發(fā)酵，不需要添加價格昂貴的天然組分，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本 并提高了外源基因的表達(dá)水平；⑥耐高溫，最適生長溫度為37-43°C，生長速率快，大規(guī)模 發(fā)酵的培養(yǎng)時間短：⑦發(fā)酵中以甘油或甲醇為唯一碳源和能源，能利用甘油的微生物不多， 能利用甲醇的微生物更少，發(fā)酵染菌率低；⑧外源蛋白的表達(dá)量和分泌效率比釀酒酵母高 10倍左右，且沒有過度糖基化現(xiàn)象，因此適合于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)目的蛋白。
[0005] 德國萊茵公司最早使用漢遜酵母表達(dá)adw亞型HBsAg并于1995年開發(fā)成功重組 漢遜酵母乙肝疫苗，1997年韓國綠十字公司從德國萊茵公司引進(jìn)相關(guān)技術(shù)，用漢遜酵母表 達(dá)adw亞型HBsAg制備乙肝疫苗。印度血清研究所亦用重組漢遜酵母表達(dá)的adw亞型HBsAg 生產(chǎn)乙肝疫苗。國內(nèi)已有報道用誘變?nèi)毕菪蜐h遜酵母菌重組構(gòu)建表達(dá)adw亞型HBsAg制備 乙肝疫苗。歐美和印度所制重組乙型肝炎疫苗多為adw亞型，國內(nèi)外未見用漢遜酵母表達(dá) adr生產(chǎn)乙型肝炎疫苗的報道。
[0006] 乙型肝炎疫苗的主要有效成分HBsAg有adw、adr和ayw等亞型，其中a抗原決定 簇是各亞型抗原的共同抗原決定簇。現(xiàn)有乙肝疫苗成功的重要原因之一是HBsAg上有共同 抗原決定簇a。乙型肝炎病毒（HBV)按其HBsAg亞型分布有一定的地域性：歐美以adw型 為主，中東和南亞以ayw亞型為主；我國多為adr亞型。各亞型間雖有共同a決定簇，但相 應(yīng)亞型的疫苗對預(yù)防地域性流行優(yōu)勢的乙型肝炎病毒更具針對性。例如，Heijtink等研究 認(rèn)為adw亞型乙肝疫苗接種誘導(dǎo)的抗-HBs與adr亞型HBsAg的親和力低（參見以下科技 文獻(xiàn)：Heijtink RA,van Bergen P,van Roosmalen MH,Siinnen CM,Paulij WP,Schalm SW, Osterhaus AD.Anti-HBs after hepatitis B immunization with plasma-derived and recombinant DNA-derived vaccines ：binding to mutant HBsAg. Vaccine. 2001Junl4 ； 19(27) :3671-80),并且證明了以漢遜酵母表達(dá)不同亞型（包括adr亞型）的HBsAg研 究疫苗接種反應(yīng)的抗體應(yīng)答差異達(dá)到2-3倍（參見以下科技文獻(xiàn)：Heijtink RA，Bergen P, Melber K, Janowicz ZA, Osterhaus AD.Hepatitis B surface antigen(HBsAg) derived from yeast cells (Hansenula polymorpha)used to establish an influence of antigenic subtype (adw2, adr, ayw3)in measuring the immune response after vaccination.Vaccine. 2002May22 ；20 (17-18) :2191-6.)
[0007] 因此，研制重組漢遜酵母（adr亞型）乙型肝炎疫苗更有利于結(jié)合我國乙型肝炎病 毒亞型流行特點以控制乙型肝炎病毒的傳播。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明根據(jù)漢遜酵母基因密碼子頻率重新設(shè) 計了 adr亞型乙型肝炎表面抗原的重組DNA序列，并將其重組到漢遜酵母的染色體上，進(jìn)行 adr亞型乙型肝炎表面抗原表達(dá)，使其表達(dá)量大大提高。
[0009] 具體而言，本發(fā)明提供：
[0010] (1) 一種重組DNA序列，其中，所述的重組DNA序列是將adr亞型乙型肝炎病毒表 面抗原的編碼基因根據(jù)多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha)的密碼子使用頻率進(jìn)行密 碼子優(yōu)化后得到的。
[0011] ⑵根據(jù)⑴所述的重組DNA序列，其中，所述的重組DNA序列的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0012] (3)根據(jù)⑴所述的重組DNA序列，其中，所述的重組DNA序列編碼的蛋白的氨基 酸序列為SEQ ID N0 :2所示的氨基酸序列。
[0013] (4) 一種重組多形漢遜酵母菌，其中，在所述的重組多形漢遜酵母菌中含有 (1)-(3)中任一項所述的重組DNA序列。
[0014] (5)根據(jù)（4)所述的重組多形漢遜酵母菌，其中，在所述的重組多形漢遜酵母菌的 基因組中整合有（1)-(3)中任一項所述的重組DNA序列。
[0015] (6)根據(jù)（4)所述的重組多形漢遜酵母菌，其中，所述的重組多形漢遜酵母菌的發(fā) 酵液的adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原的產(chǎn)率在85mg/L以上。
[0016] (7) -種adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原的制備方法，其包括：將（4)-(6)中任一 項所述的重組多形漢遜酵母菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，從而得到adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原。
[0017] (8)根據(jù)（7)所述的制備方法，其中，所述的方法還包括：將所述的重組多形漢遜 酵母菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后，進(jìn)行細(xì)胞破碎、過濾、吸附、疏水層析，從而制備得到純化的adr亞 型乙型肝炎病毒表面抗原。
[0018] (9) 一種乙型肝炎疫苗，其中，所述的乙型肝炎疫苗包含通過（7)或（8)所述制備 方法得到的adr亞型乙型肝炎表面抗原。
[0019] (10)根據(jù)（9)所述的疫苗，其中，所述疫苗的劑型為注射液或凍干粉針。
[0020] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：
[0021] 1.本發(fā)明的adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原的重組DNA序列表達(dá)水平高，所表達(dá) 的目的蛋白占宿主細(xì)胞總蛋白量的12重量％以上；
[0022] 2.本發(fā)明的adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原的重組DNA序列可整合于細(xì)胞染色體 中，重組菌株有絲分裂遺傳穩(wěn)定性高；
[0023] 3.本發(fā)明的重組酵母菌生長速率快，大規(guī)模發(fā)酵的培養(yǎng)時間短，細(xì)胞培養(yǎng)密度大， 重組酵母菌發(fā)酵后〇D_值在280以上，表達(dá)HBsAg的活性較高，重組漢遜酵母表達(dá)HBsAg的 反應(yīng)原性是現(xiàn)有重組釀酒酵母表達(dá)HBsAg的1. 7倍；
[0024] 4.本發(fā)明的重組酵母菌能利用廉價的化學(xué)合成培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞高密度發(fā)酵，不需 要添加價格昂貴的天然組分，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本并提高了外源基因的表達(dá)水平。而且 本發(fā)明的重組酵母菌中以甘油為碳源，發(fā)酵染菌率低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)；
[0025] 5.本發(fā)明的重組酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)HBsAg的產(chǎn)率高，單位體積細(xì)胞發(fā)酵液提取純化 出HBsAg的產(chǎn)率在85mg/L以上；
[0026] 6.本發(fā)明的疫苗可以制成注射液、凍干粉針等劑型，其可通過肌肉內(nèi)注射接種途 徑接種。由于本發(fā)明HBsAg adr疫苗有誘導(dǎo)更強的Thl和Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答的趨勢，因 此在進(jìn)行免疫接種時，可以執(zhí)行以2針代替3針的免疫程序。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1示出了實施例2構(gòu)建的pMPT-HBSadr質(zhì)粒；
[0028] 圖2示出了實施例5中的HBsAg的SDS-PAGE圖，其中圖中的泳道1為空白對照；泳 道 2 為 GE Healthcare Life Sciences 公司的蛋白質(zhì)分子量 Maker(LMW_SDS Marker Kit， 17-0445-01);泳道3-7分別為5批純化的ΗΡ-HBsAg ;泳道8為SC-HBsAg ;
[0029] 圖3示出了實施例6中的5(1)的adr亞型重組漢遜酵母乙肝疫苗接種豚鼠誘導(dǎo) 抗-HBs結(jié)果，其中縱軸表示抗乙型肝炎表面抗體（Anti-HBs)滴度（單位為mIU/mL)的對 數(shù)值；
[0030] 圖4示出了實施例6中的5(2)的adr亞型重組漢遜酵母乙肝疫苗接種小鼠誘導(dǎo) 細(xì)胞免疫應(yīng)答結(jié)果，其中圖4A、圖4B、圖4C、圖4D、圖4E分別表示的是HP-HBsAg、SC-HBsAg 以及空白對照誘導(dǎo)的IL-2、IFN- γ、TNF、IL-4、IL-5含量隨著時間的變化圖。

【具體實施方式】
[0031] 以下通過【具體實施方式】的描述并參照附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對 本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只 要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0032] 本發(fā)明提供了一種重組DNA序列，其中，所述重組DNA序列是將adr亞型乙型肝炎 病毒表面抗原的編碼基因根據(jù)多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha)的密碼子使用頻率 進(jìn)行密碼子優(yōu)化后得到的。
[0033] 優(yōu)選的是，進(jìn)行密碼子優(yōu)化設(shè)計時根據(jù)氨基酸序列，從漢遜酵母基因密碼子頻率 表得到adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原的漢遜酵母的優(yōu)選編碼，并用DNAMAN軟件搜索限制 性內(nèi)切酶位點，以確認(rèn)無 BamHI和EcoRI酶切位點。
[0034] 優(yōu)選的是，所述重組DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0035] 優(yōu)選的是，所述的重組DNA序列編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0036] 本發(fā)明還提供了一種重組多形漢遜酵母菌，其中，在所述重組酵母菌中含有如上 任一項所述的重組DNA序列。
[0037] 優(yōu)選的是，在所述的重組多形漢遜酵母菌的基因組中整合有如上任一項所述的重 組DNA序列。
[0038] 更優(yōu)選的是，所述的重組多形漢遜酵母菌是通過如圖1所示的pMPT-HBSadr質(zhì)粒 將SEQ ID N0 :1所示的重組DNA序列整合入基因組中的。
[0039] 優(yōu)選的是，所述的重組酵母菌的發(fā)酵液的adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原的產(chǎn)率 在85mg/L以上。
[0040] 本發(fā)明還提供了一種adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原的制備方法，其包括：將如 上任一項所述的重組酵母菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，從而得到adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原。
[0041] 優(yōu)選的是，所述方法還包括：將所述重組酵母菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后，進(jìn)行細(xì)胞破碎、 過濾、吸附、疏水層析，從而制備得到進(jìn)一步純化的adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原。
[0042] 優(yōu)選的是，所述的過濾采用的是超濾；所述的吸附采用的是硅膠吸附；以及所述 的疏水層析采用的是丁基瓊脂糖疏水層析。
[0043] 本發(fā)明還提供了一種乙型肝炎疫苗，其特征在于，所述疫苗包含通過上述任一項 所述制備方法得到的adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原。
[0044] 優(yōu)選的是，所述疫苗的劑型為注射液、凍干粉針。
[0045] 以下通過具體例子進(jìn)一步解釋或說明本
【發(fā)明內(nèi)容】
，但這些例子不應(yīng)被理解為對本 發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
[0046] 實施例1重組DNA序列的獲得
[0047] 根據(jù)科技文獻(xiàn)"A. K. Raney and A. McLachlan，The Biology of Hepatitis B Virus, In ：Editor A. Mclachlan ed. Molecular Biology of the Hepatitis B Virus, 2000, CRC Press. "獲得adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列。參照漢遜酵母基 因密碼子頻率（參見美國專利文獻(xiàn)US5712114)將上述編碼HBsAg的核酸序列進(jìn)行了重新 設(shè)計。
[0048] 設(shè)計時根據(jù)氨基酸序列，從漢遜酵母基因密碼子頻率（參見美國專利文獻(xiàn) US5712114)人工得到了 adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原的漢遜酵母優(yōu)選編碼，用DNAMAN軟 件搜索限制性內(nèi)切酶位點，排除了 BamHI和EcoRI酶切位點。
[0049] 根據(jù)上述設(shè)計得到了一個由678個堿基組成的序列，如序列表中SEQ ID N0 :1所 示，并在該核酸序列兩端各接入BamHI和EcoRI酶切位點序列接頭，最終所得到的序列如序 列表中SEQ ID N0 :3所示。由寶生物（大連）有限公司合成序列表中SEQ ID N0 :3所示的 DNA序列。EcoRI和BamHI酶切合成的DNA序列（反應(yīng)體系總體積：50μ 1，其中羅氏試劑公 司的Β緩沖體系5 μ 1、EcoRI 1. 5 μ 1、BamHI 1. 5 μ 1、DNA序列10 μ 1，溫度為37°C，反應(yīng)時間 為1小時），電泳回收酶切后的片段（即得插入片段）（采用的是寶生物（大連）有限公司 的DNA回收試劑盒并按其說明書回收酶切后的片段），-20°c保存?zhèn)溆谩?br> [0050] 實施例2構(gòu)建重組多形漢遜酵母
[0051] 以EcoRI和BamHI酶切pMPT-02質(zhì)粒（得自天津博薈生物技術(shù)有限公司）（反應(yīng) 體系總體積：50μ 1，其中羅式試劑公司的B緩沖體系5μ 1、EcoRIl. 5μ 1 5μ 1， pMPT-02質(zhì)粒10 μ 1，溫度為37°C，反應(yīng)時間為1小時），電泳回收酶切后的載體片段，用 寶生物（大連）有限公司的DNA回收試劑盒并按其說明書回收酶切后的載體片段），按照 TaKaRa PCR Ligation Kit(Code NO.D6022,得自寶生物工程（大連）有限公司）附錄中所 述步驟將載體片段與實施例1所述的SEQ ID N0 :3所示的插入片段進(jìn)行連接后，進(jìn)行熱轉(zhuǎn) 化，熱轉(zhuǎn)化條件如下：將連接重組質(zhì)粒5 μ 1加入至JM109株感受態(tài)大腸桿菌（得自寶生物 工程（大連）有限公司），輕輕混合后置冰中30分鐘，轉(zhuǎn)至42°C熱休克90秒，加800 μ 1無 抗生素的LB培養(yǎng)基，37°C以150rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)45分鐘。取200 μ 1涂布瓊脂平板（LB培養(yǎng) 基購自BD公司并按說明書配制，及培養(yǎng)溫度：37°C)過夜培養(yǎng)重組大腸桿菌，從平板上挑選 單顆菌落，用質(zhì)粒DNA提取試劑盒（得自QIAGEN公司）提取質(zhì)粒DNA后，用EcoRI和BamHI 酶切（酶切體系及反應(yīng)條件如下：用羅式試劑公司的B緩沖體系、在50 μ 1體積下以EcoRI 和BamHI雙酶切pMPT-02質(zhì)粒）并篩選出含正確插入adr亞型HBsAg基因的質(zhì)粒，并命名 為pMPT-HBSadr質(zhì)粒，如圖1所示。所述的篩選方法如下：按照EcoRI和BamHI雙酶切片段 大小約為0. 7Kb且測序結(jié)果正確。
[0052] 將10 μ 1 pMPT-HBSadr質(zhì)粒與100 μ 1感受態(tài)HU-11尿嘧啶缺陷型漢遜酵母菌（得 自中國科學(xué)院微生物研究所）混合，在電擊脈沖為1500V、電容21. 5yF的條件下進(jìn)行電 轉(zhuǎn)化，將電轉(zhuǎn)化后樣品涂布于MD固體培養(yǎng)基（1.34% (w/v，下同）酵母氨基酸氮源、5%生 物素、2%葡萄糖、1 %瓊脂）平皿上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)箱為GP-550型隔水式培養(yǎng)箱 (得自天津市華北實驗儀器有限公司）、31°C培養(yǎng)3-5天。挑選出單顆菌落，轉(zhuǎn)接到液體MD 培養(yǎng)基搖瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下，例如搖床-THZ-82A型恒溫培養(yǎng)振蕩器（得自金壇富華 儀器有限公司）、31°〇、16〇11) 111、培養(yǎng)3天，以1(%(?八，下同）甲醇（得自北京化學(xué)試劑公 司，濃度為1 % )繼續(xù)培養(yǎng)1天以誘導(dǎo)HBsAg表達(dá)，從表達(dá)HBsAg水平高者吸取200 μ 1連續(xù) 稀釋后涂MD平皿，31°C培養(yǎng)2-3天，挑取單個菌落如上述轉(zhuǎn)接到液體MD培養(yǎng)基搖瓶中培養(yǎng) 至再次挑斑并再重復(fù)一次獲得原始重組工程菌株，將所得到的菌株進(jìn)行傳代擴菌培養(yǎng)，并 建立了原始菌種、主代菌種和工作菌種三級菌種庫，三代菌種庫經(jīng)全面檢測，其遺傳性狀如 HBsAg序列、表達(dá)HBsAg水平等穩(wěn)定，從而得到了高表達(dá)HBsAg的菌株，保存于-80°C冰柜備 用。
[0053] 實施例3發(fā)酵生產(chǎn)adr亞型HBsAg
[0054] (1)培養(yǎng)基的配制
[0055] -級種子培養(yǎng)基：1· 34% (w/v，下同）YNB (無氨基酸酵母氮源）；0· 4μ Ι/ml生物 素；2%葡萄糖的水溶液，pH為5. 2-5. 6。
[0056] 二級種子培養(yǎng)基：1.34% ΥΝΒ ;0.4μ Ι/ml生物素；2%葡萄糖的水溶液，pH為 5. 2-5· 6〇
[0057] 發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵起始體積12L ;NH4H2P04192g、MgS04 · 7H2036g ;苯二甲酸氫鉀 128g ;NaC14g ;甘油384g ;10mL消泡劑（產(chǎn)品名稱為烏康，得自默克公司）的水溶液，pH為 5· 2-5. 6,110-115°C高壓滅菌 30 分鐘。
[0058] 甲醇-無機鹽培養(yǎng)基：1L培養(yǎng)基中含：26. 7ml85 %的Η3Ρ04 ;0· 93gCaS04 ;18· 2g K2S0414. 9g ;MgS04 · 7H20 ;4. 13g KOH ;40. 0g 甲醇和 4. 35ml 痕量元素母液（1L 痕量元素母 液含：6. 0g CuS04 ·5Η20 ;0· 08gKI ;3. 0g MnS04 ·Η200· 2g ;Na2Mo04 ·2Η20 ;0· 02g H3B03 ;20. 0g ZnCl2 ;65g FeS04 · 7H20 ;0· 5g CoCl2 · 6H20 ;5. 0ml H2S04 和 0· 2g 生物素）。
[0059] ⑵0D6(l(lmi值的測定方法
[0060] 用721型分光光度計（可購自上海精密科學(xué)儀器有限公司），波長設(shè)定在600nm， 以相應(yīng)培養(yǎng)基為空白調(diào)儀器0D值至零，將樣品以培養(yǎng)基進(jìn)行適當(dāng)稀釋后置儀器上讀取0D 值，所讀取稀釋后樣品0D值需小于2. 0,按樣品稀釋度計算樣品的0D6(l(lmi值。
[0061] (3)發(fā)酵過程
[0062] 種子培養(yǎng)（分兩級擴大培養(yǎng)）：將實施例2構(gòu)建的重組多形漢遜酵母菌種接種至 200mL -級種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在20-35°C溫度、100-380rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)22小時，待 培養(yǎng)液〇D6(l(lnm達(dá)到5. 0以上時，將該培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種至1600ml二級種子培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，在 20-35°C溫度、100_350rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)20-22小時，待培養(yǎng)液0D6(l(lnm達(dá)到4. 0以上時，將該培 養(yǎng)液作為發(fā)酵種子。
[0063] 發(fā)酵工藝：用30L發(fā)酵罐（日本丸菱理化裝置研究所生產(chǎn)，型號：MSJ_J2)進(jìn)行發(fā) 酵，用全自動電熱蒸汽發(fā)生器（上海佳田制造有限公司生產(chǎn)，型號：DZF26)產(chǎn)生的蒸汽對發(fā) 酵罐進(jìn)行滅菌，用FC-280型溶解氧監(jiān)控儀（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院生產(chǎn)）進(jìn)行溶氧的 監(jiān)測和控制（溶氧值為10% -80% )。將1800mL上述二級發(fā)酵種子接入裝有10-12L發(fā)酵 培養(yǎng)基滅菌的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，在20-35 °C溫度、350-700rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)96. 7-100小時， 待〇D6(l(lnm達(dá)到200以上時，檢測溶氧上升至80%時，補加甲醇-無機鹽培養(yǎng)基，待達(dá) 到280以上時，停止發(fā)酵并收獲細(xì)胞。
[0064] (4)純化
[0065] 純化的詳細(xì)步驟可參見參考文獻(xiàn)：李津，孔艷.重組乙型肝炎疫苗生產(chǎn)工藝.見李 津，俞詠霆，董德祥主編：生物制藥設(shè)備和分離純化技術(shù).第1版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2003 :348-349.。其中可將上述收獲的細(xì)胞經(jīng)過勻漿器破碎，釋放出HBsAg ;以0. 22 μ m微 孔濾器過濾去除細(xì)胞碎片；再以300K超微濾器超濾去除小分子雜質(zhì)；以硅膠吸附處理法提 取HBsAg ;最后以丁基瓊脂糖疏水層析方法精制純化HBsAg。
[0066] 實施例4本發(fā)明重組漢遜酵母細(xì)胞與現(xiàn)有釀酒酵母細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)HBsAg的比較
[0067] (1) HBsAg 產(chǎn)率
[0068] HBsAg產(chǎn)率=純化獲得HBsAg的總量+純化投料所用原始發(fā)酵液體積。
[0069] 按每升發(fā)酵液獲得純化HBsAg最終產(chǎn)率計，由實施例2得到的重組多形漢遜酵母 菌按實施例3的方法進(jìn)行的9批次純化試驗，所表達(dá)HBsAg的平均產(chǎn)率為約89. 7mg/L，最 高可達(dá)248. 0mg/L。而現(xiàn)有釀酒酵母（以下以默克釀酒酵母（表達(dá)的adw為例）在穩(wěn)定生 產(chǎn)時的HBsAg產(chǎn)率為約9. 7mg/L(以現(xiàn)有釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物825L提取純化出8gHBsAg計 算：8gHBsAg + 825L發(fā)酵液2 9. 7mgHBsAg/L發(fā)酵液）。由此可見，本發(fā)明重組漢遜酵母表達(dá) HBsAg產(chǎn)率是現(xiàn)有釀酒酵母產(chǎn)率的9倍多。
[0070] (2) HBsAg在宿主細(xì)胞蛋白中的含量
[0071] 現(xiàn)有釀酒酵母：取北京天壇生物制品股份有限公司乙肝疫苗室2009年連續(xù)生產(chǎn) 的3批默克釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物細(xì)胞破碎后樣品，檢測其HBsAg含量（檢測方法參見參考文 獻(xiàn)：朱亭玉，王明瑩，何亞麗，蘇桂民，齊璇，柳薔，李津，莊輝，趙鎧.羅式電化學(xué)發(fā)光法在乙 型肝炎疫苗質(zhì)量控制中的應(yīng)用.中國生物制品學(xué)雜志.2009,22(9) :923-926.)和總蛋白含 量（檢測方法參見參考文獻(xiàn)：中華人民共和國藥典（三部）（2010版），附錄VI B蛋白質(zhì)測 定法，附錄34)。計算3批冊8八8(413.5、376.2、379.8 48/1111)占總蛋白含量（28.1、37.1、 35. 6mg/ml)百分比平均值為1. 18% ±0. 3%。
[0072] 本發(fā)明重組漢遜酵母細(xì)胞：取5批小量純化試驗中重組漢遜酵母細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)物 細(xì)胞破碎后樣品，檢測其HBsAg含量和蛋白含量，計算5批HBsAg (454. 11、307. 7、219. 3、 727. 4、409. 9 μ g/ml)占總蛋白含量（2. 33、2. 69、3. 4、3. 77、8. 86mg/ml)的百分比平均值為 12. 3% ±7%。
[0073] 綜上，本發(fā)明重組漢遜酵母表達(dá)的HBsAg在宿主細(xì)胞中總蛋白中的比例為 12. 3±7.0%，現(xiàn)有釀酒酵母（默克釀酒酵母）表達(dá)的HBsAg在宿主細(xì)胞中總蛋白中的比例 為1. 18±0. 3%。由此可見，本發(fā)明重組漢遜酵母表達(dá)的HBsAg在宿主細(xì)胞蛋白中的含量是 現(xiàn)有釀酒酵母的10倍，也就是說，在同等含量宿主蛋白中，漢遜酵母工程菌表達(dá)HBsAg的豐 度是默克釀酒酵母工程菌的10倍。
[0074] 實施例5HBsAg adr與重組釀酒酵母細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)的HBsAgadw的生化性狀比較
[0075] 主要材料：
[0076] 實施例3生產(chǎn)的本發(fā)明的adr亞型HBsAg (以下簡稱HP-HBsAg);
[0077] 作為對照的pHBS56-GAP347/33株重組釀酒酵母細(xì)胞發(fā)酵、表達(dá)和純化制得adw 亞型HBsAg (以下簡稱SC-HBsAg)(參見科技文獻(xiàn)：李津，孔艷.重組乙型肝炎疫苗生產(chǎn)工 藝.以及李津，俞詠霆，董德祥主編：生物制藥設(shè)備和分離純化技術(shù).第1版.北京：化學(xué)工 業(yè)出版社，2003 :348-349.);
[0078] HBsAg診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購自上海科華生物技術(shù)有限公司；
[0079] HP-HBsAg定量參考品（rHPadrHBsAg凍干定量參考品，白色固體，批號200050328) 由北京天壇生物制品股份有限公司乙肝疫苗室制備（具體制備方法可參見科技文獻(xiàn)：李 津，洪云，張國強，王昌華，許毅，張德有，馮素英，汪和睦，趙鎧.adr亞型HBsAg凍干實驗參 考品的制備與檢測.中國生物制品學(xué)雜志.2007,20(9) :69-72.)。
[0080] (1)浮力密度測定
[0081] 將HP-HBsAg和SC-HBsAg樣品各3批分別加到預(yù)先準(zhǔn)備好的蔗糖墊層離心管中， 樣品量均為5ml，濃度均為10 μ g/ml。蔗糖墊層由上至下為：20% (10ml)、40% (10ml)、60% (10ml),用日立超速離心機（55P-72, Automatic preparative ultracentrifuge, Rotor ： RPS40T-305)離心，25000rpm，12小時，4°C。離心結(jié)束后從管頂分部收集，2ml/管。HBsAg 定量檢測按照HBsAg診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）說明書操作，以HBsAg定量參考品做標(biāo)準(zhǔn) 曲線，酶標(biāo)儀（MULTISKANMK3, Thermo)在450nm下讀數(shù)。用阿貝折射儀檢測收集管中蔗糖 的折射率，依折射率/蔗糖密度對照表查出浮力密度。
[0082] HP-HBsAg 的浮力密度為 1. 〇85±0· 014g/ml，SC-HBsAg 浮力密度為 1. 090±0· 009g/ml，表明HP-HBsAg的浮力密度和對照組SC-HBsAg的浮力密度接近。
[0083] (2)還原 SDS-PAGE 電泳
[0084] 按照參考文獻(xiàn)："國家藥典委員會：中華人民共和國藥典（三部）（2010版），附錄 IV C SDS-聚丙烯酰胺凝膠法，附錄23"所述方法進(jìn)行還原SDS-PAGE電泳，其中濃縮膠與分 離膠的濃度分別為4.5% (w/v，下同）及為15%，還原劑為二硫蘇糖醇（DTT)，銀染法染色。
[0085] 結(jié)果參見圖2,其中圖中的泳道1為空白對照；泳道2為GEHealthcare Life Sciences 公司的蛋白質(zhì)分子量 Maker (LMW-SDSMarker Kit，17-0445-01);泳道 3-7 分別為 5批純化的HP-HBsAg，示出純化工藝的可重復(fù)性；泳道8為SC-HBsAg。從圖2中可以看出， HP-HBsAg在SDS-PAGE中顯示為一條高純度的P24主帶（S卩，分子量約為24, 000D的蛋白多 肽條帶）。
[0086] 實施例6 adr亞型HBsAg免疫原性的動物試驗
[0087] 1.試驗藥品：
[0088] (1)實施例3生產(chǎn)的adr亞型HBsAg ;所用重組疫苗的其它組分和疫苗制備方法參 照《重組乙型肝炎疫苗（釀酒酵母）》規(guī)程制備adr亞型漢遜酵母乙肝疫苗（國家藥典委員 會：重組乙型肝炎疫苗（釀酒酵母），中華人民共和國藥典（三部）（2010版），2010,北京： 中國醫(yī)藥科技出版社，126-128頁），簡稱HP。
[0089] (2)現(xiàn)有HBsAg疫苗（北京天壇生物制品股份有限公司所生產(chǎn)重組乙型肝炎疫苗 (釀酒酵母），批準(zhǔn)文號為（98)衛(wèi)藥準(zhǔn)字（京）S-01號），簡稱SC。
[0090] 2.試驗動物：
[0091] (1)豚鼠：白色，雌性，300g/只，北京天壇生物制品股份有限公司試驗動物室提 供，在屏障條件下飼養(yǎng)。
[0092] (2)BALB/C小鼠：雌性，8-10周齡，北京天壇生物制品股份有限公司試驗動物室提 供，在屏障條件下飼養(yǎng)。
[0093] 3.動物分組：
[0094] (1)豚鼠：豚鼠共48只，隨機分為3組（A、B、C)，每組4籠（1號、2號、3號、4號）， 每籠4只。A組免疫3次（0周，4周，8周）；B組免疫2次，間隔8周（0周，8周）；C組免 疫2次，間隔4周（0周，4周）；試驗周期為12周。各組1號和2號籠免疫adr亞型漢遜 酵母乙型肝炎試驗疫苗各1批（HP1、HP2)，3號和4號籠免疫現(xiàn)有HBsAg疫苗各1批（SCI、 SC2);疫苗的接種部位為右后大腿肌肉內(nèi)，第1針為基礎(chǔ)免疫，第2針或（和）第3針為加 強免疫，免疫劑量為lml/只，劑量為2 μ g);基礎(chǔ)免疫前從心臟采血，以后間隔2周采血1 次,共采血7次。
[0095] (2)小鼠：分別以實施例3得到的adr亞型HP-HBsAg及和實施例5中所述的adw 亞型SC-HBsAg兩種抗原各1批背部皮下免疫小鼠，HBsAg的注射劑量均為3 μ g/只，以生理 鹽水注射小鼠作為空白對照組，每組12只小鼠，共3組。分別于第1周，2周，3周，4周脫頸 處死小鼠，每次每組3只小鼠，制備脾懸液（制備方法如下：無菌條件下取出脾臟，盛有5ml Hanks液的培養(yǎng)皿中，用鑷子輕輕梳刮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液吸入離心管中，棄去較大的組織塊， 離心沉淀細(xì)胞；依小鼠淋巴細(xì)胞分離液（EZ-S^? MouselX，購自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限 公司）說明書制備脾細(xì)胞），并經(jīng)淋巴細(xì)胞分液離心分離出單個核細(xì)胞（MNC)，向各孔中加 入HBsAg (按終濃度50 μ g/ml加入），培養(yǎng)4天，收集上清檢測細(xì)胞因子。
[0096] 4.免疫原性測定方法：
[0097] (1)豚鼠：抗體檢測：從所采血樣離心分離出血清，用乙型肝炎表面抗體檢測試劑 盒（得自上海科華生物技術(shù)有限公司）檢測血清中anti-HBs，以anti-HBs標(biāo)準(zhǔn)品做定量曲 線（10mIU、20mIU、40mIU、80mIU、160mIU)，測定按試劑盒說明書進(jìn)行。
[0098] (2)小鼠：細(xì)胞因子檢測：CBA試劑盒（得自PIRECE公司）檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的 IFN- γ、TNF、IL-2、IL-4、IL-5的含量，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。
[0099] 5.試驗結(jié)果：
[0100] (1)豚鼠：由圖3可知，與現(xiàn)有疫苗所用抗原比較，本發(fā)明adr亞型HBsAg能更早的 誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，免疫第2針后，第6W( "W"表示周，下同）和第8W時，adr亞型HBsAg疫苗 (0W，4W，8W) 3針組和（0W，4W) 2針組的anti-HBs抗體滴度數(shù)值上高于adw亞型HBsAg疫苗 (0W，4W，8W) 3針組和SC (0W，4W) 2針組，表明基礎(chǔ)免疫及第1次加強免疫后adr亞型HBsAg 疫苗誘導(dǎo)的anti-HBs抗體滴度上升較快，免疫應(yīng)答出現(xiàn)較快，可能對于抵抗乙型肝炎病毒 的早期感染具有重要意義。理論上能有利于阻斷HBV的母嬰傳播。
[0101] (2)小鼠：Thl細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF等細(xì)胞因子，Th2細(xì)胞主要參與體 液免疫應(yīng)答，主要分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子。由圖4可知，小鼠有誘導(dǎo)更強的Thl和Th2 型細(xì)胞免疫應(yīng)答的趨勢。如圖4A、4B和4C所示，adr亞型HP-HBsAg免疫小鼠3W時脾MNC 分泌的IL-2和IFN- γ達(dá)到頂點，顯著高于空白對照組（P < 0. 05)，在第4W時仍高于adw 亞型SC-HBsAg組和空白對照組（P < 0. 05) ;TNF在第2W時達(dá)到頂點，顯著高于空白對照組 和SC-HBsAg組（P < 0. 05)，之后開始下降。如圖4C所示，HP-HBsAg免疫小鼠后，脾MNC產(chǎn) 生的TNF上升較快，在第2W達(dá)到最高且高于空白對照組和SC-HBsAg組（P < 0. 05);在第4W 時HP-HBsAg組分泌的IL-2下降較慢，高于SC-HBsAg組和空白對照組（P < 0. 05)，而如圖 4B所示，IFN- γ的分泌量在第3W和第4W時均高于SC-HBsAg組和空白對照組（P < 0. 05)， 表明adr亞型HP-HBsAg誘生Thl型細(xì)胞因子的能力較強，呈現(xiàn)產(chǎn)生較早，持續(xù)時間更長的 特點。如圖4D所示，各組分泌的IL-4量均較低，HP-HBsAg組在第3W時達(dá)到最高，顯著高于 SC-HBsAg組和空白對照組（P < 0. 05);如圖4E所示，在第2W時，HP-HBsAg組分泌的IL-5 達(dá)到最高，之后開始下降，在第3W時SC-HBsAg組分泌的IL-5達(dá)到最高但是低于HP-HBsAg 組的峰值；表明HP-HBsAg誘生Th2型細(xì)胞因子的能力較強。
【權(quán)利要求】
1. 一種重組DNA序列，其中，所述的重組DNA序列是將adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原 的編碼基因根據(jù)多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha)的密碼子使用頻率進(jìn)行密碼子優(yōu) 化后得到的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組DNA序列，其中，所述的重組DNA序列的核苷酸序列為 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組DNA序列，其中，所述的重組DNA序列編碼的蛋白的氨基 酸序列為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
4. 一種重組多形漢遜酵母菌，其中，在所述的重組多形漢遜酵母菌中含有權(quán)利要求 1-3中任一項所述的重組DNA序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組多形漢遜酵母菌，其中，在所述的重組多形漢遜酵母菌 的基因組中整合有權(quán)利要求1-3中任一項所述的重組DNA序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組多形漢遜酵母菌，其中，所述的重組多形漢遜酵母菌的 發(fā)酵液的adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原的產(chǎn)率在85mg/L以上。
7. -種adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原的制備方法，其包括：將權(quán)利要求4-6中任一 項所述的重組多形漢遜酵母菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，從而得到adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其中，所述的方法還包括：將所述的重組多形漢遜 酵母菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后，進(jìn)行細(xì)胞破碎、過濾、吸附、疏水層析，從而制備得到純化的adr亞 型乙型肝炎病毒表面抗原。
9. 一種乙型肝炎疫苗，其中，所述的乙型肝炎疫苗包含通過權(quán)利要求7或8所述制備方 法得到的adr亞型乙型肝炎表面抗原。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中，所述疫苗的劑型為注射液或凍干粉針。
【文檔編號】C12P21/02GK104232661SQ201310229177
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月8日
【發(fā)明者】李津, 許毅, 張德有, 楊云凱, 王曦, 馬銳 申請人:北京天壇生物制品股份有限公司