一種文庫對文庫的酵母雙雜交規模化篩選互作蛋白質的方法
【專利摘要】本發明公開了一種文庫對文庫的酵母雙雜交規模化篩選互作蛋白質的方法，以基因組規模的cDNA作為Bait篩選同樣是基因組規模的cDNA?Library。在本技術實施過程中采取對cDNA文庫進行均一化處理的方法來降低高豐富度互作蛋白對低豐富度互作蛋白的掩蓋作用，提高了篩選的效率；利用酵母URA3基因的特性自動的去除baitc?DNA中具有自激活作用的序列。本發明建立了一種可行性高，成本低廉，實驗條件要求低，工作量較小的利用文庫對文庫的酵母雙雜交技術大規模篩選互作蛋白質的方法，并成功的應用于了病原物-寄主植物互作蛋白質的篩選。
【專利說明】一種文庫對文庫的酵母雙雜交規模化篩選互作蛋白質的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬分子生物學領域，具體涉及一種文庫對文庫的酵母雙雜交規模化篩選互作蛋白質的方法。該方法不同于以往的高通量篩選蛋白質-蛋白質互作的酵母雙雜交方法，本發明采用文庫對文庫的篩選方法，在克服前者的缺點的基礎上能夠方便簡捷的用于分子生物學相關的領域內不同物種和不同物種間蛋白質-蛋白質相互作用研究。
【背景技術】
[0002]蛋白質是基因功能的執行者，其功能的發揮不是孤立的，是在縱橫交錯的網絡中通過與其它分子相互作用完成的。而蛋白質-蛋白質之間的互作就是其中一種重要的形式。目前蛋白質相互作用網絡構建的主要策略有兩種:一種是以蛋白質復合體為出發點，即大規模的質譜分析。另一種是通過酵母雙雜交系統，后者是目前基因組范圍內蛋白質間相互作用網絡構建研究方面應用較為廣泛的策略。
[0003]酵母雙雜交技術是由Fields S.等人于1989年首次建立。該技術的基本原理是基于對真核生物轉錄激活因子(如GAL4、GCN4)結構的認識。轉錄因子通常包含兩個模塊式結構域:一個是DNA結合結構域(DNA binding domain, BD),負責結合于DNA序列的特定位點(上游激活序列，up stream activating sequence, UAS)上；一個是激活結構域(activation domain，AD)協助RNA聚合酶激活其下游基因的轉錄，只有兩者空間上接近共同作用時才能激活報告基因。利用此特性，分別使BD和AD與“誘餌”蛋白(X)和“獵物”蛋白(Y)形成融合蛋白，如 果兩種蛋白X和Y可以發生相互作用，就能使BD和AD空間上相互接近從而激活報告基因的轉錄。
[0004]目前，不同的大規模酵母雙雜交技術已應用于了從病毒到人類等多種生物的蛋白質相互作用研究，但從大規模酵母雙雜交篩選方式來看，卻可以歸納為以下兩種主要的方式:
[0005](I)文庫篩選法:一般用相對較少的已知或未知誘餌去篩選相對較大獵物庫，也可以在誘餌篩選出陽性獵物后，再以獵物為誘餌篩庫，如此循環，最后構建成一個互作的網絡。誘餌可以一個或數個至數千個，可以是0RF、全長cDNA或它們的片段(含結構域)，但一次雜交只能使用一個誘餌篩選，數千個誘餌必須重復數千次雜交；獵物庫一般很大，可以是眾多ORF集合成的庫，也可以是全長cDNA庫或cDNA片段庫。文庫篩選法優點是可以得到相互作用的結構域信息和降低假陰性率。
[0006](2)陣列篩選法:所有含不同AD-Y的菌株單個(一對一陣列法)或混合成集合(高通量陣列法)與排成陣列所有含不同BD-X的菌株一一對應篩選。采用一對一陣列法的好處是陽性克隆可從陣列位置推出序列信息而不需測序，可以自動化；高通量陣列法雖然需測序鑒定陽性克隆，但是相對于一對一陣列法具有通量性高的優點。
[0007]雖然運用以上兩種大規模酵母雙雜交技術已經獲得了部分模式生物如T7噬菌體、幽門螺旋桿菌、酵母、秀麗隱桿線蟲、果蠅、擬南芥的全部或部分的蛋白質互作圖譜，但是這兩種方法有一個共同的缺點，那就是工作量大，成本高，實驗硬件條件要求高。比如2011年來自北卡羅來納大學的Jeffery L.Dangl教授領導由20多個國立和國際實驗室組成的“擬南芥蛋白互作組圖譜聯盟”歷時4年耗資800萬美元首次獲得模式植物擬南芥的部分蛋白相互作用圖譜。該實驗中研究人員分析獲得了擬南芥上萬個開放閱讀框(ORF)，然后利用一對一陣列篩選的方法對這些ORF進行檢測，結果在40萬次蛋白分析實驗中，共發現了 6250個蛋白互作樣本，其中有2774種蛋白參與，但是這些蛋白互作樣本在擬南芥完整蛋白作用譜中僅占大約2%，這主要是因為由于分析的上萬個開放閱讀框(ORF)僅覆蓋擬南芥完整蛋白的三分之一。
[0008]綜上所述，現有的高通量的酵母雙雜交技術并不適合于一般的實驗室進行大規模的蛋白質-蛋白質互作的篩選，因此亟需探索一種操作簡捷、工作量小、成本較低、硬件條件要求較低的新的高通量的酵母雙雜交方法。

【發明內容】

[0009]本發明的目的在于提供了一種文庫對文庫的酵母雙雜交規模化篩選互作蛋白質的方法，該方法成本較為低廉、對實驗條件要求較低，是一種適合規模化蛋白質相互作用發掘的方法。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施:
[0010](I)均一化(特定組織或細胞的所有表達基因其拷貝數和表達量是不一樣的，經過均一化這一步驟的處理使所有表達基因的含量大致相等)“誘餌” CDNA文庫和“獵物” CDNA文庫的構建:提取實驗對象組織總RNA，純化獲得mRAA，分別以GBK-SMART III和GBK-⑶S III(“誘餌”cDNA第一鏈)，SMART III和CDS III (“獵物”cDNA第一鏈)為引物進行RT-PCR反應，對生成的第一鏈cDNA再分別以BD 5’PCR primer和BD 3’PC R primer (“誘餌”cDNA文庫)，AD 5’PCR primer和AD 3’PCR primer (“獵物” cDNA文庫)為引物通過LD-PCR反應進行擴增獲得未均一化的雙鏈cDNA文庫，然后按照DSN法(雙鏈特異性核酸酶Duplex-specificnuclease)對上述兩個cDNA文庫進行均一化處理并以BD 5’PCR primer和BD 3’PCRprimer, AD 5’ PCR primer和AD 3’ PCR primer對相應的文庫進行擴增，獲得足夠量的均一化的“誘餌” cDNA文庫和“獵物” cDNA文庫。
[0011](2)大規模轉化“誘餌”cDNA文庫、“獵物”cDNA文庫:將上述構建好的“誘餌”cDNA文庫按照 Clontech 公司 Yeastmaker?Yeast Transformation System 2 試劑盒操作說明與線性化的質粒PGBKT7共轉化酵母菌株MaV203，“獵物”cDNA文庫與線性化的質粒pGADT7共轉化酵母菌株Y187，獲得轉化入酵母菌株中的“誘餌” cDNA文庫和“獵物” cDNA文庫。
[0012](3)含有cDNA文庫的酵母菌株的收集及“誘餌”cDNA文庫中自激活序列的去除:將構建有“獵物” cDNA文庫的Y187菌株涂布SD/-Leu酵母平板培養基，將構建有“誘餌” cDNA文庫的酵母MaV203涂布含0.2 % 5-F0A的SD/_Trp酵母平板培養基，30°C放置3~5天，沖洗收集生長的克隆，即獲得構建進酵母菌株Y187中的“獵物” cDNA文庫和去除自激活序列的酵母菌株MaV203中的“誘餌” cDNA文庫。
[0013](4)構建以酵母菌株Y2HGold為載體的“誘餌”cDNA文庫:將上述去除自激活序列的“誘傅” cDNA 文庫離心收集,Clontech 公司 Easy yeast plasmid Isolation kit 提取質粒，獲得的質粒利用Yeastma ker?Yeast Transformation System 2試劑盒轉化酵母菌株Y2HGold。[0014](5)大規模酵母雙雜交篩選互作蛋白質:上述構建好的Y2HGold菌株中的“誘餌” cDNA文庫和Y187菌株中的“獵物” cDNA文庫混合雜交，通過兩重選擇培養基的篩選獲得報告基因被激活表達的陽性克隆，對互作雙方的插入片段進行測序及分析。
[0015]所述步驟(1)中構建“誘餌” cDNA文庫和“獵物” cDNA文庫分別使用了兩對引物，其中 GBK-SMART III和 GBK-CDS III用于“誘餌” cDNA 文庫的第一鏈合成，BD 5’ PCR primer和BD 3’PCR primer用于雙鏈的合成；SMART III和CDS III用于“獵物”cDNA第一鏈的合成，AD 5’PCR primer和AD 3’PCR primer用于雙鏈的合成。具體序列如下:GBK_SMART 1115’-CTGATCTCAGAGGAGGACCTGCATATGGCCATGGAGGCCrGrGrG-3’ GBK-CDS II1:5’-CGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCC-d (T) 3(IVN_3，SMART II1: 5 ’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCrGrGrG-3，CDS II1:5’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)S0VN-3J BD 5’ PCR primer:5’ -GAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGCATATGGC-3’ BD 3’ PCR primer:5’ -GGGTTATGCTAGTTATGCGGCCGCTGCAGGTCGACGGA-3’AD 5’PCR primer:5 ’-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’ AD3’ PCR primer:5’ -GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’
[0016]SMART III和 CDS IILAD 5，PCR primer 和 AD 3，PCR primer 序列來源于 Clontech公司試劑盒，GBK-SMART III和 GBK-CDS III，BD 5，PCR primer 和 BD 3，PCR primer 則是本發明的創新，GBK-SMART III由42個堿基組成，前39個堿基與質粒pGBKT7(購買自Clontech公司)同源，最后的三個rG (非脫氧核苷酸G)是基于RNase H_反轉錄酶完成mRNA反轉錄后在第一鏈cDNA的3’末端繼續延長三個C堿基的特性，在引物GBK-SMART III 3’端末端設計添加的，這三個rG與cDNA第一鏈3’末端延長的三個C堿基互補，使RNase H ~反轉錄酶在合成中自動進行模板轉換，并將與PGBKT7同源的重組序列固定在cDNA的3’末端；GBK-⑶S III由56個堿基組成，在3’端帶有30個(d) T，尾端設計了 VN序列，以提高啟動引導的特異性，并在其5’端設計了與pGBKT7同源的重組序列，這樣就在cDNA第一鏈的兩端引入了質粒PGBKT7同源的重組序列，然后再根據GBK-SMART III，GBK-CDS III的序列分別設計引物 BD 5，PCR primer 和 BD 3，PCR primer。
[0017]所述步驟(2)中酵母菌株MaV203的表型如下
[0018]
【權利要求】
1.一種文庫對文庫酵母雙雜交規模化篩選互作蛋白質的方法，步驟如下: (1)均一化誘餌CDNA文庫和獵物cDNA文庫的構建:提取目標生物組織總RNA，純化獲得mRNA，分別以 GBK-SMART III和 GBK-CDS III, SMART III和 CDS III為引物進行 RT-PCR反應，對生成的第一鏈cDNA再分別以BD 5’ PCR primer和BD 3’ PCR primer,AD 5’PCR primer和AD 3’ PCR primer為引物通過LD-PCR反應進行擴增獲得未均一化的雙鏈cDNA文庫，然后按照DSN法對上述兩個cDNA文庫進行均一化處理并以BD 5’ PCR primer和BD 3’ PCRprimer, AD 5’ PCR primer和AD 3’ PCR primer對相應的文庫進行擴增，獲得足夠量的均一化的誘餌cDNA文庫和獵物cDNA文庫； 所述引物如下:

2.根據權利要求1所述的一種文庫對文庫酵母雙雜交規模化篩選互作蛋白質的方法，其特征在于:所述步驟(1)中構建均一化誘餌cDNA文庫和獵物cDNA文庫的目標生物組織或細胞既可以來源于同一種生物又可來源于具有互作關系的不同生物。
【文檔編號】C40B20/00GK103774241SQ201210395295
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月18日 優先權日:2012年10月18日
【發明者】史軍偉, 張婷婷, 董五輩 申請人:華中農業大學