本發明屬于金納米材料制備技術領域，具體涉及一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料、制備方法及應用。

背景技術：

近年來，熒光標記在生物科學和臨床醫學等領域，已經成為一種非常重要的研究工具。目前來說，熒光標記材料通常包括貴金屬納米簇、量子點、復合熒光納米粒子和有機染料。由于量子點和有機小分子染料對于生物體的毒性一般較大，貴金屬納米簇的合成成本也不低，所以復合熒光納米的材料的優勢才體現出來。

一般來說，復合熒光納米材料具有合成方法簡單、制備成本低廉、良好的生物相容性和熒光性能穩定的特點，越來越受到國內外研究者的廣泛關注，尤其是其具有良好的生物相容性，使其在生物科學和臨床醫學的熒光標記的有著非常廣闊的前景。

基因治療已被證明是一種有效的治療癌癥的方法并且幾乎沒有副作用。非病毒基因載體包括陽離子脂質，聚合物，樹枝狀聚合物和肽在安全性，低免疫原性，生物相容性，以及大規模生產方面都有著很大的潛力。然而，相比于病毒載體，相比于病毒載體接近100％的轉染效率，非病毒載體10％-60％的轉染效率仍然是其不能廣泛應用的最大瓶頸。因此，有必要通過組合化學篩選分子結構并且設計新型仿病毒納米結構。

技術實現要素：

本發明提供的一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料、制備方法及應用，首次制備出高生物兼容性的dtt納米金簇，解決了現有非病毒載體轉染效率低的問題。

本發明提供了一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，將二硫蘇糖醇、氯金酸按照3:1的體積比例混合均勻，并溶于超純水中，得到原料混合物溶液；

步驟2，將所述原料混合物溶液置于室溫中攪拌10～30min，得到納米粒子分散液；

步驟3，將步驟2的納米粒子分散液用截留分子量為3500da的透析袋透析24h，然后將透析袋內的溶液經真空冷凍干燥，得到利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料。

優選的，上述利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料的制備方法中，步驟3中，所述真空冷凍干燥的溫度為-20～-50℃、真空度為5～10pa。

本發明還提供了一種根據上述利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料的制備方法制備而成的金納米材料。

本發明還提供了一種上述金納米材料作為非病毒載體用于基因治療。

本發明還提供了一種上述金納米材料在基因治療中的應用，包括以下步驟：

s1，將所述金納米材料制備成金納米粒子分散液，并制備外源基因溶液；

s2，將所述金納米粒子分散液與外源基因溶液混合均勻，其中，金納米粒子分散液中金納米粒子與外源基因溶液中外源基因的摩爾比例為15:1，攪拌10～20min，得到基因包裹金簇；

s3，將基因包裹金簇導入靶細胞中，并誘導外源基因在靶細胞中表達，達到基因治療的目的。

與現有技術相比，本發明的利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料具有以下有益效果：

該金納米材料合成方便，熒光性能優越并且穩定，同時具有優良的生物兼容性。運用該金納米材料，我們能夠將外源基因進行包裹，并導入靶細胞中，完成基因治療的目的，該金納米材料作為非病毒載體的轉染效率大于85％，相比于現有技術大幅度提高。

附圖說明

圖1為本發明金納米材料的tem圖；

圖2為本發明金納米材料的粒徑統計分析；

圖3為本發明金納米材料的熒光性能表征；

圖4為本發明金納米材料與質粒結合后的tem圖；

圖5為本發明金納米材料轉運質粒進入酵母細胞的熒光共聚焦檢測圖。

其中，圖5a為對照組405nm激發波長、600-700nm發射波長下細胞，圖5b為對照組488nm激發波長、500-550nm發射波長下細胞，圖5c為圖a的明場通道觀察結果，圖5d為圖a和圖b的重疊圖，圖5e為實驗組405nm激發波長、600-700nm發射波長下細胞，圖5f為實驗組488nm激發波長、500-550nm發射波長下細胞，圖5g為圖e的明場通道觀察結果，圖5h為圖e和圖f的重疊圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明，但不應理解為本發明的限制。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件操作，由于不涉及發明點，故不對其步驟進行詳細描述。

當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。

本發明提供的一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，包括以下實施例：

實施例1

一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，包括以下步驟：

步驟1，將30ml二硫蘇糖醇和10ml氯金酸混合均勻，并溶于100ml超純水中，得到原料混合物溶液；

步驟2，將所述原料混合物溶液置于室溫中攪拌20min，得到納米粒子分散液；

步驟3，將步驟2的納米粒子分散液用截留分子量為3500da的透析袋透析24h，然后將透析袋內的溶液經真空冷凍干燥，得到利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，該金納米材料是粉末狀態；所述真空冷凍干燥的溫度為-20～-50℃、真空度為5～10pa。

實施例2

一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，包括以下步驟：

步驟1，將300ml二硫蘇糖醇和100ml氯金酸混合均勻，并溶于1000ml超純水中，得到原料混合物溶液；

步驟2，將所述原料混合物溶液置于室溫中攪拌10min，得到納米粒子分散液；

步驟3，將步驟2的納米粒子分散液用截留分子量為3500da的透析袋透析24h，然后將透析袋內的溶液經真空冷凍干燥，得到利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，該金納米材料是粉末狀態；所述真空冷凍干燥的溫度為-20～-50℃、真空度為5～10pa。

實施例3

一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，包括以下步驟：

步驟1，將30ml二硫蘇糖醇和10ml氯金酸混合均勻，并溶于200ml超純水中，得到原料混合物溶液；

步驟2，將所述原料混合物溶液置于室溫中攪拌30min，得到納米粒子分散液；

步驟3，將步驟2的納米粒子分散液用截留分子量為3500da的透析袋透析24h，然后將透析袋內的溶液經真空冷凍干燥，得到利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，該金納米材料是粉末狀態；所述真空冷凍干燥的溫度為-20～-50℃、真空度為5～10pa。

為了觀察本發明的利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料在水中的分散性，我們將實施例1的步驟3中得到的透析袋內的溶液置于透射電鏡下觀察，圖1為透析袋內的金納米材料的tem圖，由圖1可以看出視野中的納米粒子均勻分布，說明納米粒子在水中具有良好的分散性，圖2為本發明金納米材料的粒徑統計分析，多數納米粒子的粒徑在1.5-3之間，均勻分布。

圖3為本發明金納米材料的熒光性能表征，納米粒子在603nm出現強度為150的特征峰，表明納米粒子具有良好的熒光性能。

此外，我們將包裹有外源基因的金簇置于透射電鏡下觀察其形貌特征，結果如圖4所示，由圖4可以看出，外源基因在金簇的包裹下，可以形成500nm左右的球形結構，包裹程度良好，可以被用于導入靶細胞。

為了驗證本發明的金納米材料可以用于基因治療，我們以酵母細胞為例，參照實施例1的方法，將外源基因導入酵母細胞中，

s1，將所述利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料粉末制備成1.5mmol/l金納米粒子分散液，制備1mmol/l外源基因溶液；

s2，將所述納米粒子分散液與外源gfp基因溶液以15:1的體積比例室溫混合均勻，得到的混合液中金納米粒子與外源基因的摩爾比例為15:1，攪拌10～20min，得到基因包裹金簇；

s3，將基因包裹金簇導入靶細胞中，并誘導外源基因在靶細胞中表達，達到基因治療的目的，具體為：

s(1)，將100μl基因包裹金簇與100μl重懸于pbs溶液的酵母細胞(od600＝10)混合，室溫下孵育6h，得到孵育后的細胞；

s(2)，將孵育后的細胞于12000rpm，4℃離心30s，收集沉淀，pbs清洗沉淀兩次，最后將沉淀重懸在200μl半乳糖ypd培養基中，誘導表達3h，表達后的外源基因可以用于基因治療；

其中，半乳糖ypd培養基的配方為：4g蛋白胨，2g酵母提取物，4g半乳糖，溶于200ml超純水。

最后，我們以外源gfp基因導入的酵母細胞作為實驗組，以單純的酵母細胞為對照組，通過熒光共聚焦觀察外源基因的導入情況，結果如圖5所示。

圖5a為對照組405nm激發波長、600-700nm發射波長下細胞，圖5b為對照組488nm激發波長、500-550nm發射波長下細胞，圖5c為圖a的明場通道觀察結果，圖5d為圖a和圖b的重疊圖，圖5e為實驗組405nm激發波長、600-700nm發射波長下細胞，圖5f為實驗組488nm激發波長、500-550nm發射波長下細胞，圖5g為圖e的明場通道觀察結果，圖5h為圖e和圖f的重疊圖。

圖5e、圖5f、圖5g、圖5h可以看出，金簇能夠很好地進入細胞，并進行熒光標記；圖5b、圖5f表明細胞能夠表達綠色熒光蛋白，也證明我們的質粒成功進入細胞并表達；圖5c、圖5g、圖5d、圖5h表明，紅色的金簇信號能夠很好地跟gfp信號重疊，進行細胞標記。

由此，我們判斷本發明的金納米材料能夠攜帶外源基因進入宿主細胞中，并使外源基因在宿主細胞中成功表達，該金納米材料作為非病毒載體的轉染效率大于85％，相比于現有技術大幅度提高，在基因治療方面具有良好的應用前景。

盡管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和范圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬于本發明權利要求及其等同技術的范圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。