本發明屬于功能性納米材料技術領域，具體涉及一種具有熒光特性的碳量子點的制備方法，特別涉及一種以海藻為碳源制備具有熒光特性的碳量子點細胞標記探針的方法。

背景技術：

功能性納米材料是近年來發展非常迅速的一個技術領域，科學家們已經成功地制備出包括有機高分子小球、微脂粒、半導體量子點、硅量子點、上轉化納米探針、貴金屬納米顆粒、磁性納米小球等等在內的多種納米材料，并利用它們的各種優異性能開發出了多種技術手段，在醫學檢測，疾病診斷，能源電池，環境評估、污染治理等各領域廣為應用。

碳量子點是納米材料領域一個新的研究熱點。它是指直徑在2-40納米范圍內的碳原子微球。碳量子點在保留碳材料各種優良的物理化學性能的同時，表現出顯著的熒光特性和良好的水相分散性。實驗表明碳量子點可以直接作為一種安全有效的熒光探針，被各種細胞內化從而對這些細胞進行熒光標記，而表面修飾的碳量子點能夠特異性地標記腫瘤細胞。總之，碳量子點在生物檢測以及生物分析等領域具有重要的應用價值。

碳量子點的制備方法主要有兩大類，一類是利用高純石墨、炭黑和碳納米管為原料，利用電子束光刻蝕、電化學氧化、化學剝離、微波及超聲輔助、氧等離子處理等方法，破壞石墨片層之間的相互作用力，同時在片層內形成大量的氧化基團，將石墨烯片層切割開得到小尺寸的碳量子點；另外一類是利用檸檬酸和乙二胺等小分子化合物，在一定溫度下進行縮合反應，生成具有較高分子量的碳量子點。這兩種制備方法的原料都是高純度的化合物，成本較高。并且合成的過程中常常會用到濃硝酸和濃硫酸，反應副產物的無害化處理較為復雜。近年來，科學家發現了多種天然有機物制備碳量子點的方法，如中國專利CN2014108419973公開了一種以雞蛋清為碳源的碳量子點熒光標記材料的方法，中國專利CN2012102644112一種光致放光碳量子點的制備方法公開了采用豆漿殘渣為原料制備碳量子點的方法，中國專利2013102199000公開了以植物葉子為原料制備碳量子點的方法，然而這些天然有機物制備過程中普遍存在產品收率低，如采用豆漿殘渣產品收率為5-7.3％，且過程中涉及到硫酸、氫氧化鈉等化學藥品的使用，不屬于綠色生產工藝，此外這些原材料仍然具有價格較高，來源有限的缺點。

我們國家耕地資源有限，但是擁有廣闊的海洋面積，海藻的產量巨大，能夠作為一種價低量高的生物質資源。滸苔是大型天然野生海藻的一種，具有繁殖能力強，環境適應范圍廣的特點。近年來隨著全球氣溫變暖、水體富營養化等一系列環境因素的改變，海洋滸苔綠潮連續暴發。中國黃海最早于2007年便出現滸苔，迄今為止連續九年爆發滸苔綠潮災害。例如2015年6月在山東沿海海域有較大面積滸苔漂浮，綠潮覆蓋面積約430平方公里，分布面積約35200平方公里(新華網新聞)。大量滸苔漂浮聚集在海面，阻塞了船舶航行的通道。以此同時，滸苔的大量生長增殖以及腐爛分解的過程都需要消耗大量氧氣，對其生長海域其他水生生物的生存構成嚴重威脅。得不到及時清除的滸苔腐爛時發出惡臭，影響沿海旅游業發展。如何對滸苔進行無害化處理，將其‘變廢為寶’是我們面臨的一個嚴峻挑戰。目前對滸苔的無害化處理主要途徑是將其制成飼料，或者加工食用。

基于以上論述，設計實現有效的途徑，將滸苔轉化為具有功能性的熒光碳量子點材料，對于滸苔的高附加值無害轉化具有重要的現實意義。

技術實現要素：

本發明的目的在于針對現有碳量子點合成技術中的不足，提供一種以海藻為原料制備生產熒光碳量子點并作為細胞標記探針加以應用的方法，解決了海藻，特別是滸苔高附加值無害化處理的問題。

為了實現上述技術方案，本發明涉及的以海藻為碳源的熒光碳量子點的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)清洗海藻原料以去除雜質，然后將海藻和水一起粉碎，得到海藻漿料；

(2)將適量海藻漿料放入密封體系中進行高溫水熱反應并使海藻漿體碳化；

(3)對步驟(2)中碳化產物進行后處理以去除不溶物以及大尺寸的組分，得到熒光碳量子點溶液；

(4)將步驟(3)中的熒光碳量子點溶液進行冷凍干燥處理，得到熒光碳量子點粉末。

本發明涉及的海藻為滸苔、海帶、裙帶菜和紫菜中的一種或多種，但不限于這幾種,水優選為為純水。

本發明涉及的滸苔為條滸苔、緣管滸苔、鏟滸苔和扁滸苔中的一種或多種。

本發明涉及的步驟(1)中將質量比(1.5-2.5)：1的海藻和水一起放入組織搗碎機中粉碎3-10分鐘，得到海藻漿料優選海藻和水質量比為2：1，粉碎時間為5分鐘。

本發明涉及的步驟(2)中密封體系為密閉反應釜，步驟(2)中的海藻漿料占密閉反應釜體積的三分之一，高溫水熱反應和碳化過程具體為：在加熱裝置中將密閉反應釜升溫至180-200℃，并維持60-90分鐘，為保證熒光碳量子點的產率和質量，加熱裝置的溫度波動控制在±5℃。

本發明涉及的加熱裝置為微波反應器、烘箱或馬弗爐中的一種。

本發明涉及的步驟(3)中的后處理過程為離心、過濾、透析中的一種，但并不限于這幾種。

本發明所述的離心具體為：將步驟(2)中碳化產物放入離心機中，在轉速5000-12000轉/分鐘的條件下離心處理10-20分鐘，離心上清液為熒光碳量子點溶液，優選轉速為10000轉/分鐘,離心時間為15分鐘。

本發明所述的過濾具體過程為：將步驟(2)中碳化產物通過0.10-0.45μm濾膜處理，濾出液為熒光碳量子點溶液，優選為濾膜孔徑為0.22μm。

本發明所述的過濾具體過程為：將步驟(2)中碳化產物通過截留分子量500Da的透析膜處理除去小分子雜質，透析袋內部截留溶液為碳量子點溶液。

本發明涉及的以海藻為碳源的熒光碳量子點用于生物標記、重金屬分析、電極復合材料制備、抗體偶聯以及復合光催化劑制備等各個方向。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：(1)有效地將廉價的海藻，特別是滸苔轉化為具有熒光特性的納米尺寸的碳量子點，實現滸苔的高附加值和無害轉化；(2)制備方法工藝簡單、操作性強、成本低、可以實現大規模的碳量子點的制備,無需使用其他化學藥品，環境友好；(3)制備的熒光碳量子點用于生物標記、重金屬分析、抗體標記和細胞染色；(4)制備過程中產品收率高；(5)粉碎處理過程有利于海藻中的成分分散在水溶液中提高后續水熱反應和碳化過程的效率。

附圖說明：

圖1為本發明涉及的實施例1熒光碳量子點的透射電鏡表征圖；

圖2為本發明涉及的實施例1熒光碳量子點的紫外-可見光吸收譜圖；

圖3為本發明涉及的實施例1熒光碳量子點的熒光發射譜圖；

圖4為本發明涉及的實施例1熒光碳量子點對細胞生長繁殖的影響；

圖5為本發明涉及的實施例1濃度500mg/L熒光碳量子點與細胞共同培養5小時之后的共聚焦顯微鏡成像結果。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明做進一步說明：

實施例1：

(1)用自來水對滸苔進行洗滌，除去表面泥沙等雜質，然后用純水進行沖洗；

(2)稱取200克步驟(1)處理后的滸苔原料(干重約10克)，按照滸苔和純水的質量比為2:1的比例將滸苔和純水混合，放入組織搗碎機的原料容器，粉碎5分鐘，得到滸苔漿料；

(3)稱取10克步驟(2)得到的滸苔漿料，放入30mL聚四氟水熱反應釜并加蓋放入外包套管進行密閉；

(4)將裝有滸苔漿料的反應釜放入微波反應器，設置溫度為200℃，壓力為20atm,反應60分鐘，然后停止加熱；

(5)待反應釜的溫度降低到40℃以下，將反應釜的蓋子打開，反應產物為紅褐色溶液，含有少許黑色的不溶物；

(6)將步驟(5)得到的反應產品混合物收集到離心管中，設定轉速10000rpm,離心20分鐘,將離心管上層清液轉移到干凈的試管中，不溶物沉淀直接丟棄；

(7)將步驟(6)得到的熒光碳量子點溶液進行冷凍干燥處理，得到熒光碳量子點粉末,計算得出熒光量子產率為4.7％，產品收率為9.6％。

對實施例1制備的碳量子點粉末進行測試，結果如圖1-5所示，從透射電鏡表征圖可以看出制備得到的熒光碳量子點顆粒分散均勻，而且粒徑分布范圍相對較窄，基本在2-6nm范圍內，平均顆粒直徑為3.5nm。從紫外-可見光吸收譜圖可以看出熒光碳量子點無明顯的吸收峰。從熒光發射譜圖可以得出當用360nm的激發光對碳量子點進行照射的條件下，熒光碳量子點在400-600nm區間有很強的熒光發射，發射峰在440nm附近。從與細胞共同培養5小時之后的共聚焦顯微鏡成像結果可以得出：濃度500ug/mL的滸苔碳量子點對細胞的生長增殖無明顯影響，可以富集在細胞質的部位對其進行熒光標記。

實施例2：

(1)用自來水對滸苔進行洗滌，除去表面泥沙等雜質，然后用純水進行沖洗；

(2)稱取200克步驟(1)處理后的滸苔原料(干重約10克)，按照滸苔和純水的質量比為2:1的比例將滸苔和純水混合，放入搗碎杯，利用組織搗碎機粉碎5分鐘，得到滸苔漿料；

(3)稱取30克步驟(2)得到的滸苔漿料，放入100mL聚四氟水熱反應釜并加蓋放入外包金屬套管進行密閉；

(4)將裝有滸苔漿料的反應釜放入烘箱，設置溫度為180℃，反應90分鐘，反應過程中溫度波動控制在±5℃,然后停止加熱；

(5)待反應釜的溫度降低到40℃以下，將反應釜的蓋子打開，反應產物為紅褐色溶液，含有少許黑色的不溶物；

(6)將步驟(5)得到的反應產品混合物用裝有0.22μm濾膜的抽濾裝置進行過濾處理，收集澄清的濾出液，轉移到干凈的試管中，濾膜收集的不溶物直接丟棄；

(7)將步驟(6)得到的熒光碳量子點溶液進行冷凍干燥處理，得到熒光碳量子點粉末。計算得出熒光量子產率為4.9％，產品收率為7.8％。

實施例3：

(1)用自來水對滸苔進行洗滌，除去表面泥沙等雜質，然后用純水進行沖洗；

(2)稱取200克步驟(1)處理后的滸苔原料(干重約10克)，按照滸苔和純水的質量比為2:1的比例將滸苔和純水混合，放入搗碎杯，利用組織搗碎機粉碎5分鐘，得到滸苔漿料；

(3)稱取30克步驟(2)得到的滸苔漿料，放入100mL聚四氟水熱反應釜并加蓋放入外包金屬套管進行密閉；

(4)將裝有滸苔漿料的反應釜放入馬弗爐，設置溫度為200℃，反應60分鐘，反應過程中溫度波動控制在±5℃,然后停止加熱；

(5)待反應釜的溫度降低到40℃以下，將反應釜的蓋子打開，反應產物為紅褐色溶液，含有少許黑色的不溶物；

(6)將步驟(5)得到的反應產品混合物收集分裝到離心管中，設定轉速10000rpm,離心20分鐘,將離心管上層清液轉移到干凈的試管中，不溶物沉淀直接丟棄；

(7)將步驟(6)得到的熒光碳量子點溶液進行冷凍干燥處理，得到熒光碳量子點粉末。計算得出熒光量子產率為3.8％，產品收率為8.9％。

實施例4：

本實施例4與實施例1除步驟(1)中選擇的原料為裙帶菜，步驟(2)中裙帶菜和純水的質量比為2.5:1，步驟(6)中轉速5000rpm，離心10分鐘,其他步驟均相同，制備出熒光碳量子點粉末。

實施例5：

本實施例5與實施例2除其他步驟均相同，除步驟(1)中選擇的原料為紫菜，步驟(2)中紫菜和純水的質量比為1.5:1，步驟(6)抽濾裝置中采用0.45μm濾膜，其他步驟均相同，制備出熒光碳量子點粉末。

測試表明，實施例2-5制備的熒光碳量子點粉末性能與實施例1制備的的熒光碳量子點粉末性能接近。

對比例1：

本對比例1與實施例1除步驟(4)反應溫度為150℃，反應時間為30min時，其他步驟均相同，制備熒光碳量子點粉末,計算得出熒光量子產率為1.2％，產品收率為2.1％。