專利名稱：從天然原料提取和純化紫杉醇的方法
技術領域：
本發明涉及一種從天然原料提取和純化紫杉醇的便捷方法。與現有技術中已有的方法相比，該方法特別經濟，因為步驟少，純化期間損失的量少。
自1960年到1981年，從35000種植物中提取和分離出110000種混合成分并對其進行了試驗(Blume E.國家癌癥研究所雜志(J.Natl.Cancer Inst.)1991；831054-1056)。
紅豆杉是所選擇并進行試驗的一類植物，Wani等首先從來源于美國西海岸(Oregon)的紅豆杉樹皮(短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)Nutt)中得到了提取物(Wani等，美國化學會雜志(J.Am.Chem.Soc.)，1971；932325-2327)。這些樹皮粗提物被證實對白血病細胞具有細胞毒性活性并對各種腫瘤具有抑制作用。
數年后，分離出該提取物的活性化合物。該活性化合物的通用名為紫杉醇，并經X射線晶體照相術和1H-NMR譜確定了其分子結構(Wani等，J.Am.Chem.Soc.1971；932325-2327)。
從那時開始，進行了針對紫杉醇對癌瘤的體外和體內作用的研究，得到的陽性結果表明該活性化合物是一種有前景的卵巢癌和乳腺癌治療藥物(Rowinski等，治療藥理學(Pharmacol.Ther.)1991；5235-84)。食品和藥品管理局(Food and Drug Administration)從1992年開始批準了紫杉醇用于治療各種癌癥的用途。
首先用于生產紫杉醇的紅豆杉是短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)，但對發現于全球不同地區的種類也進行了試驗。它們包括漿果紅豆杉(Taxus baccata)、加拿大紅豆杉(Taxus canadensis)、喜馬拉雅紅豆杉(Taxus wallichiana)、云南紅豆杉(Taxus yunnanensis)、Taxusdensiformis、Taxus hicksii、Taxus wardii、東北紅豆杉(Taxuscuspidata)、Taxus capitata、Taxus brownii(Miller等，有機化學雜志(J.Org.Chem.)1981；461469；Mclaughlin等，自然生殖雜志(J.Nat.Prod.)1981；44321；Kingston等，J.Nat.Prod 1982；45466；Senilh等，J.Nat.Prod.1984；47131-137；Huang等，J.Nat.Prod.1986；49665-669；Fett-Neto等，生物/技術(Bio/Technology)1992；101572-1575)。
所有這些種類都含有紫杉醇，但含量都非常有限-約為0.0004-0.008％(Kingston，Pharmacol.Ther.1991；521-34)。這種紫杉醇的低濃度使其提取和純化成本非常高，因為需要時間并且通常要求采用重復色譜法。
各種紅豆杉中紫杉醇的低濃度對環境產生巨大影響。要從短葉紅豆杉樹皮中提取1kg紫杉醇需要砍伐約3000棵生長的樹木以得到10000kg樹皮。所得量(1kg)的紫杉醇可用于治療約500名患者，但癌癥患者的數量高達數十萬。重新種植樹木將遠不能滿足人類所需的紫杉醇的需要，因為它們生長緩慢(Vidensek等，J.Nat.Prod.1990；531609-1610；keisey等，J.Nat.Prod.1992；55912-917；Wheeier等，J.Nat.Prod.1992；55432-440)。
已經提出了許多提取和純化紫杉醇的方法。例如Wani等(Wani等，J.Am.Chem.Soc，1971；932325-2327)提出了從美國西海岸的紅豆杉樹皮中提取和純化紫杉醇的方法，包括用乙醇處理樹皮，然后數步色譜法純化的步驟。
Miller等(1981)采用下列方法從喜馬拉雅紅豆杉中提取紫杉醇1)用植物提取并濃縮提取物；2)通過分離水和己烷除去脂肪；
3)用二氯甲烷提取并濃縮；4)在第一個硅膠柱上經色譜法的第一次純化；5)在第二個硅膠柱上經色譜色譜法的第二次純化；6)第一次逆流分布；7)第二次逆流分布；8)制備HPLC色譜。
Senilh等(1984)通過下列方法從漿果紅豆杉的樹皮中分離出紫杉醇(或TaxolTMA0.0165％)、三尖杉寧堿(或TaxolTMB0.0064％)和其它化合物1)用乙醇提取并濃縮；2)分離水和二氯甲烷；3)濾過色譜；4)硅膠色譜；5)氧化鋁色譜；6)中壓二氧化硅柱色譜；7)HPLC色譜。
其它類似方法，則需要在制備HPLC色譜后再進行兩次或三次柱色譜處理。
Polysciences Inc.采用的另一個方法包括下列步驟1)用甲醇或乙醇處理干燥的樹皮粉，將所得提取物濃縮以除去醇，2)然后該濃縮物用二氯甲烷處理并將所得溶劑提取物濃縮得到粉末，3)將該粉末溶于丙酮和輕石油(1∶1)的混合液中并過濾除去不溶性物質，4)濃縮含有紫杉醇的有機相，將其溶于30％輕石油中并上Florisil柱上，5)經過兩次結晶純化柱洗脫的紫杉醇級分，6)將如此獲得的紫杉醇結晶進行硅膠柱色譜，以分離紫杉醇與其它紫杉烷(taxanes)(相關類似物，三尖杉寧堿等)，
7)將上步獲得的純化紫杉醇結晶兩次，和8)使未分離的混合物和母液循環通過硅膠柱，以獲得額外量的純凈紫杉醇。
當然，也還有其它從天然原料純化紫杉醇的方法，例如下列文獻中所述的Kingston等公開了從短葉紅豆杉獲得新紫杉烷的方法(J.Nat.Prod.1982；45466-470)；和Witherup等包括了從短葉紅豆杉中分離紫杉醇及其相關化合物的方法(液相色譜雜志(J.Liq.Chrom.)1989；122117-2132)。
1994年授予Nair的美國專利5279949公開了一種使用觀賞性紅豆杉組織純化紫杉醇的方法。在該專利方法包括1)用70％乙醇提取新鮮的針葉，2)用木炭對提取物進行脫色并過濾，3)濃縮過濾的提取物以除去大部分有機溶劑，4)離心水性提取物以分離含紫杉醇的固體，5)然后對固體進行第一次常壓相二氧化硅色譜，6)將所得的紫杉醇粗產物級分進行第二次低壓二氧化硅色譜；和7)以反向柱進行最終的純化。
Pandey等的美國專利5654448公開了一種從短葉紅豆杉樹皮提取和純化紫杉醇的方法。該方法包括1)用甲醇處理樹皮三次，每次提取時間為5天，然后濃縮所得提取液；2)分離甲醇濃縮物以獲得二氯甲烷和水層，將二氯甲烷萃取液蒸發至干，該固體殘余物含有約1.6-2.2％w/w的紫杉醇，3)將該固體殘余物溶于丙酮中并與同體積的己烷混合以除去極性雜質，將該混合物蒸發至約其1/3體積；4)將丙酮/己烷殘余物滴加到己烷(1.5L-3.0L殘余物用10-15L己烷)，得到沉淀，將其過濾并在40℃下于高真空度(1mm-2mm)下干燥，得到約0.5-0.6kg的固體殘余物；
5)將上步得到的固體殘余物溶于0.5L丙酮-二氯甲烷中形成1∶9v/v混合物，然后用二氧化硅柱進行色譜；三尖杉寧堿和紫杉醇一同洗脫下來；將含紫杉醇和三尖杉寧堿的級分合并并旋轉蒸發至干，該固體殘余物是紫杉醇和三尖杉寧堿的混合物，含約36-40克紫杉醇(45-55％)；6)將上步獲得的混合物粗品(10g)進行化學改性以通過溴化分離紫杉醇和三尖杉寧堿；溴化反應后得到的固體殘余物重13.2g；7)將溴化的殘余物溶于丙酮/二氯甲烷(1∶9v/v)并經二氧化硅柱色譜分離，合并含有紫杉醇的級分并蒸發至干；和8)將上步獲得的固體殘余物溶于丙酮，用等體積的正己烷或者其它己烷使其結晶；用冷丙酮/己烷(1/1v/v)洗滌結晶，過濾并于40℃下真空干燥，如此獲得的固體重4.84g，經HPLC色譜測定其含有＞97％w/w的紫杉醇。
Rao的美國專利5475120和5670673公開了一種分離紫杉醇的方法。該方法中1)將樹皮、針葉、木質部、根部或它們的混合物用乙醇處理，減壓下(＜35-40℃)濃縮所得提取物以除去大部分乙醇；2)將該濃縮物分配到氯仿(或二氯甲烷、二氯乙烷或三氯乙烷)中，在減壓下濃縮氯仿提取物形成稠漿，將該稠漿到入玻璃器皿中并在真空烤箱(＜40℃)中干燥，在使用樹皮或木質部的情況下形成粉末，在使用針葉的情況下形成針狀結晶(100kg木質部或樹皮得到1.5-2.5kg提取物，100kg針葉獲得2.4-4.8kg提取物)；3)將氯仿固體提取物(2-2.5kg)溶于乙腈(5L)并加入水(5L)；然后用硅膠平衡該混合物(2-3L漿狀物)；在攪拌該混合物的同時逐漸加入水(15L)；虹吸出澄清溶液，將浸漬了樣品的硅膠漿轉移到一不銹鋼柱的頂部；將含紫杉醇和各種重要的紫杉醇類似物的級分放在通風櫥中，使其在通風櫥中緩慢蒸發溶劑；1-2天或形成結晶并使該過程持續8-10天；和4)將所得的含低于5％三尖杉寧堿的結晶粗品用丙酮/輕石油混合物并使用木炭重結晶兩次，由此獲得41g純凈的紫杉醇，即產率為0.04％，該產物是用100 kg樹皮得到的；或者使該結晶粗品的氯仿通過二氧化硅或者Florisil短柱進行脫色。另一種除去三尖杉寧堿雜質的方法包括使用臭氧。用1-2％甲醇的氯仿混合溶液洗脫該柱，得到可通過濃縮或結晶回收的批量紫杉醇。產量與上面接近，為40g。HPLC色譜分析顯示如此回收的紫杉醇含低于0.3％的三尖杉寧堿。
Liu的美國專利5969165公開了一種采用工業制備性低壓色譜法從加拿大紅豆杉中分離和純化紫杉醇以及其它相關化合物的方法。
在該方法中，將加拿大紅豆杉(200kg)的針葉和樹枝用60℃的1000L甲醇提取5小時，然后過濾。該原料用55-60℃的700L甲醇再提取4小時并過濾。將濾液合并并與10kg活性炭(5％w/w)混合。過濾除去活性炭。然后將濾液濃縮為約100L。再加入300L水和二氯甲烷(1∶1)。收集有機層，水溶液用200L二氯甲烷萃取兩次以上。將二氯甲烷溶液合并并蒸發形成漿狀物，然后用20L丙酮稀釋。
用丙酮溶液包被20kg Celite545，干燥后加載到三個工業制備性低壓色譜柱(150times.15cm)上。每個柱填充15kg氧化鋁吸附劑。柱在10-15psi低壓下用包含己烷和丙酮的混合溶劑系統以約150ml/min的流速系統。
收集含紫杉烷的級分并將其合并，然后濃縮除去所有其它溶劑。將所得物質溶于甲醇并在室溫下保持過夜，得到針狀結晶。過濾結晶并用丙酮重結晶，得到白色結晶，經鑒定為13-乙酰基-9-二氫漿果赤霉素III。
將濾液濃縮至干。殘余物溶于3L丙酮中。將該丙酮溶液與1.5kg聚苯乙烯-二乙烯基苯混合。蒸發除去溶劑，所得粉末加載到用聚苯乙烯-二乙烯基苯填充的工業制備性低壓色譜柱的頂部，在低于30psi的操作壓力下用45％丙酮的水溶液以150ml/min流速洗脫。
合并含有紫杉醇和三尖杉寧堿的級分并蒸發除去大部分丙酮，然后用去離子水稀釋并用2.5L二氯甲烷提取三次。將有機層濃縮至干，殘余物溶于1L甲醇中。
將大約30％(v/v)的水加到該甲醇溶液中并使該混合物在60℃溫熱數分鐘，然后在室溫保持過夜。濾出甲醇溶液中的結晶粗品并于70-75℃在真空烤箱中干燥。該固體包含約70％的紫杉醇和25％的三尖杉寧堿，200kg加拿大紅豆杉的針葉和樹枝的產率為31克。
將紫杉醇粗品溶于200ml乙腈并用250ml去離子水稀釋并加載到色譜柱上。色譜柱裝填聚合物樹脂(Diaion，一種微孔聚甲基丙烯酸酯樹脂)。該柱用35、40、45和50％的乙腈水溶液分步洗脫。
將所得的含紫杉醇或三尖杉寧堿的級分分別合并并保持于5℃下直至結晶。然后分別過濾紫杉醇和三尖杉寧堿結晶，并且二者都在65℃下用甲醇和水的混合液進行重結晶。
獲得的紫杉醇為白色針狀結晶，純度＞99％，產率為18.5g(0.009％)。所得三尖杉寧堿的純度＞98％，產率為6.5％(0.003％)。
本發明者審閱現有技術中公開的純化紫杉醇的已知方法認為，要獲得高純度的紫杉醇，必須進行多步色譜分離和結晶純化步驟。特別是，由于不同種類紅豆杉中紫杉醇含量底下，導致很高的生產成本。再者，由于小規模色譜柱可純化的生物質的量非常有限，并且純化后得到的紫杉醇產率很低。
發明目的和概述本發明的目的首先是提供一種方法，該方法使得-不同種類的紅豆杉的樹皮、針葉和/或樹枝提取后更容易獲得生物質(biomass)；-提高了如此獲得的和需經色譜純化的生物質的量；-減少了純化步驟；-提高了所得紫杉醇的量；以及最終-使生產成本降低到更經濟的水平。
本發明的另一個目的是提供一種高純度的紫杉醇結晶混合物。
依據本發明，上述的第一個目的通過運用從含待提取紫杉醇的天然紫杉烷原料提取和純化紫杉醇的方法實現，該方法包括下列步驟a)用有機溶劑從上述天然紫杉烷原料提取含紫杉醇的粗提物；b)將所述粗提物用堿或酸處理，通過沉淀得到生物質，分離所述生物質并將其干燥；c)通過除去其中含有的樹脂和天然色素，脫去如此分離的生物質的顏色(percolorizing)，將所述生物質溶于丙酮后，往其中加入至少一種非極性溶劑直至獲得富含紫杉醇的油相；d)用堿或酸處理上步回收的富含紫杉醇的油相中包含的生物質，通過沉淀獲得另一種生物質，分離所述的另一種生物質并將其干燥；e)上步獲得的分離的另一種生物質在揮發性溶劑中的溶液經色譜純化至少一次，并使經色譜得到的純化溶液進行至少一次的結晶。
依據本發明，上述的第二個目的通過紫杉醇結晶混合物實現，該混合物通過上述方法獲得，且經過濾和干燥該結晶其由以下組成-約53％的純度高于99％的結晶，-約22％的純度高于98％的結晶，和-約23％的純度高于92％的結晶。
通過閱讀下列非限制性說明，本發明，其優點和其減少實際操作的方式將得以更好的理解。
發明詳述在本發明范圍和下列說明中，“脫色(percolorize)”是指通過加入與溶液混溶或不混溶的非極性溶劑而從所述溶液中除去樹脂和色素。
如上所述，本發明的方法是用于從含有待提取的紫杉醇的天然原料中提取和純化紫杉醇。第1步-提取方法的第1步包括用有機溶劑混合物從紫杉烷的天然原料(naturalsource)中提取含有紫杉醇及其類似物的粗提物(raw material)。
用作本發明方法原料的紫杉烷天然原料是紅豆杉類植物。更具體地說，包括含有紫杉醇的任一松柏類植物的種。這類含紫杉醇的松柏類植物的種包括短葉紅豆杉、歐洲紅豆杉、加拿大紅豆杉、喜馬拉雅紅豆杉、云南紅豆杉(Taxus yunnanensis)、Taxus densiformis、Taxus hicksii、Taxus wardii、東北紅豆杉、Taxus capitata或Taxus brownii。
本發明的方法具有可使用含紫杉醇的紫杉烷天然原料的任一部分的優點。優選用所選擇的松柏類植物的樹皮進行提取?；蛘撸墒褂盟x擇的松柏類植物的樹枝和針葉同時進行提取。
優選將如此獲得的提取物進行過濾以除去沉淀，并且在其中填充了熱水(優選65-70℃)的雙層壁的罐中進行潷析。在該罐中蒸餾溶劑直至獲得非常粘稠的液體。然后回收提取物并將其溶于甲醇。
在該提取步驟中，使用的有機溶劑優選選自醇類、鹵代烴類以及鹵代醇和烴的混合物。這些溶劑的實例可例舉甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷和甲醇與二氯甲烷或者三氯甲烷的混合物。
在使用鹵代烴和醇的混合物的情況下，醇與鹵代烴的體積比優選為9∶1～1∶9。該混合物的體積比更優選為約1∶1。第2步-第一次沉淀方法的第2步包括在堿性或酸性介質中處理粗提物，獲得生物質沉淀。
在堿性介質中進行沉淀時，該介質優選由一種堿性鹽，如乙酸鈉、乙酸鉀或者三(羥甲基)氨基甲烷(也稱為TRIS)的溶液組成。
根據優選的實施方案，堿性介質由氫氧化鈉溶液組成并且采用的氫氧化鈉濃度為10毫摩爾-80毫摩爾/升溶液，更優選為20毫摩爾-50毫摩爾/升溶液。
堿性介質的pH通常為8.5-11，優選為9-10。
當在酸性介質中進行沉淀時，酸性介質由無機酸溶液或有機酸溶液組成。所述酸選自鹽酸、乙酸和檸檬酸。酸溶液的濃度優選為10毫摩爾-50毫摩爾/升溶液，更優選為20毫摩爾-30毫摩爾/升溶液。
酸性介質的pH優選為2-4。
在各種情況下下，加到粗提物中以產生生物質沉淀的堿性或酸性溶液的體積為方法第1步所提取的粗提物體積的1-20倍。
當使用堿性溶液時，加到粗提物中的堿性溶液的體積等于粗提物體積的1-15倍。當使用酸性溶液時，加到粗提物中的酸性溶液的體積等于方法第1步獲得的粗提物體積的1-10倍。
在這些條件下，形成的沉淀非常細而輕，因此過濾非常困難。事實上，通過低速離心(5000rpm)不能全部回收沉淀。需15000或者甚至20000rpm的轉速才能有效從溶液中分離沉淀。
為解決該問題，有助于從所獲得的生物質中分離沉淀，可在分離和干燥前加入氯化鈉將生物質鹽化，氯化鈉的加入量為25-200克/升用于沉淀的酸性或堿性溶液。氯化鈉的加入量優選為50-100，更優選為50-75克/升用于沉淀的酸性或堿性溶液。
用氯化鈉鹽化溶液可產生絮凝作用。而后，所得沉淀變重，更加凝聚且易于過濾或低速離心。
優選在劇烈攪拌下，將氯化鈉快速加到溶液中。
根據本發明的另一個優選方案，該步沉淀出的生物質經過濾或離心與溶液分離，然后在室溫空氣中干燥或者真空干燥，優選通過通風或者冷凍干燥。第3步-脫色(percolorization)本發明方法的第3步包括脫去上步分離出的生物質的顏色。
具體地說，在該第3步中，通過往前步沉淀獲得的生物質中加入第1步提取的粗提物的大約2倍體積的丙酮(在沉淀前)，使其重新形成溶液。
更優選的是，通過首先加入丙酮，然后加入水使生物質重新形成溶液。對于加入的每100體積的丙酮而言，水的加入量優選為2-10體積，更優選為5-7體積。
待溶解后，往所得的溶液中加入至少一種非極性溶劑以形成富含紫杉醇的油相。
用于該脫色步驟的非極性溶劑優選選自與丙酮混溶的烴，如己烷或庚烷。當使用己烷時，使用的己烷體積通常為丙酮溶液體積的3-4倍。
然后將如此得到的混合物轉移到一個潷析瓶中，回收沉在瓶底部的含有紫杉醇和其它紫杉烷的油相。然后蒸發該油相并加入甲醇。
該第3步除去了松柏類植物原料中的大部分樹脂和天然色素。第4步-第二次沉淀本發明方法的第4步包括用堿或酸處理包含在上步回收的富含紫杉醇的油相中生物質，通過沉淀獲得另一種生物質，然后分離該另一種生物質并將其干燥。
更具體地說，在該第4步中，首先將上步獲得的富含紫杉醇的油相蒸發至干，然后用甲醇使其形成溶液。
然后，當稱為第2步的第一次沉淀步驟在酸性介質中進行時，在堿性介質中沉淀所得的甲醇溶液；或者當第一次沉淀步驟在酸性介質中進行時，在堿性介質中沉淀所得的甲醇溶液。該次沉淀的目的是獲得沉淀形式的含紫杉醇的生物質。
根據本發明的一個優選實施方案，通過沉淀如此獲得的生物質在分離和干燥前也通過往其中加入氯化鈉進行鹽化，加入的氯化鈉濃度為30-200克/升用于沉淀的酸性或堿性溶液。加入的氯化鈉濃度優選為50-100克/升用于沉淀的酸性或堿性溶液。
然后過濾包含在生物質中的沉淀并在室溫空氣中或者真空下干燥，或者凍干。
該步獲得的沉淀非常細而輕，導致過濾非常困難。事實上，通過低速離心(例如5000rpm)只能部分回收沉淀。只有15000或者甚至20000rpm的轉速才能使沉淀與溶液完全分離。因此適合再次往溶液中加入氯化鈉以生產絮凝作用，使得沉淀變重，更加凝聚且易于過濾或低速離心。用于該步處理的氯化鈉的濃度為25-200克/升溶液，更優選為50-75克/升溶液。在劇烈攪拌下，將氯化鈉快速加到溶液中。第5步-色譜法純化本發明方法的第5步和最后一步包括將上步得到的分離的另一種生物質在揮發性溶劑中的溶液用色譜法純化至少一次；和將用色譜法獲得的純化溶液結晶至少一次。
為此，將第4步干燥后得到的沉淀溶于揮發性溶劑中，然后進行至少一步色譜純化并使經色譜獲得的純化溶液結晶至少一次。但優選將第4步干燥后得到的沉淀進行數次色譜純化和數次結晶，連續純化和結晶的次數優選為三次。
這三次連續純化和結晶將作為亞步驟A-F進行描述。A-第一次色譜純化在第一次色譜純化步驟中，將第4步獲得的生物質溶于揮發性溶劑中。將所得溶液與硅膠混合并通風干燥，然后將包上了生物質的硅膠加載到裝有同型硅膠的色譜柱上。在該柱中，生物質用含30-40％丙酮和60-70％己烷的洗脫混合液洗脫純化。洗脫混合液優選含有約40％的丙酮和約60％的己烷。
用于溶解的揮發性溶劑優選是丙酮。然后過濾丙酮溶液，除去不溶性顆粒并與硅膠混合。然后將所得混合物在通風或真空下干燥。
將浸漬了紫杉醇及其類似物的硅膠加載到柱上，柱的高度優選為142cm，內徑為76cm并且包含2.2-2.3kg硅膠。柱中的硅膠用丙酮和己烷(40-60％，體積/體積)組成的洗脫混合液洗脫和平衡。在0-30psi的壓力下，以約100ml/分的流速用相同的溶劑混合液進行洗脫。B-第二次色譜純化在第二次色譜純化步驟中，優選將上步回收的富含紫杉醇的級分合并，然后蒸發干至獲得殘余物。
然后通過在揮發性溶劑中溶解制備該殘余物的溶液。將如此獲得的溶液在與上步相同的條件下進行再次純化，得到富含紫杉醇的新級分。
根據一個優選的實施方案，將殘余物溶于丙酮中，然后與硅膠混合并干燥。
將浸漬了紫杉醇及其類似物的硅膠加載到包含2.2-2.3kg硅膠的柱上(長142cm×內徑7.6cm)。柱中的硅膠用丙酮和己烷(40-60％，體積/體積)組成的洗脫混合液洗脫和平衡。在0-30psi的壓力下，以約100ml/分的流速用相同的溶劑混合液進行洗脫。
再次合并含紫杉醇(通常含40-60％的紫杉醇)的級分。C-第一次結晶在該步中，將前面經色譜純化步驟獲得的含紫杉醇的級分蒸發至干，然后加入丙酮再成溶液。調整丙酮的量，以使根據HPLC分析的對應于紫杉醇峰的溶液的吸光度為1.0-1.5D.O.。然后在丙酮溶液中加入3-4倍體積的己烷使紫杉醇結晶。
結晶快速地形成。使該混合物在室溫或者2-8℃下放置過夜，使其充分結晶。D-第二次結晶在該步中，過濾分離前步重結晶獲得的結晶，并使其重新形成丙酮溶液，同時調整丙酮的體積，以使根據HPLC分析的對應于紫杉醇峰的溶液的吸光度為1.0-1.5D.O.。
然后將3-4倍積的己烷加到該丙酮溶液中，使該溶液中的紫杉醇重結晶。
根據HPLC分析，該步獲得的結晶紫杉醇的純度高于80％。E-第三次色譜純化在該步中，過濾前步獲得的結晶，然后用二氯甲烷溶解結晶。
將如此獲得的溶液與硅膠混合后通風干燥。
將包有紫杉醇的硅膠加載到裝有同種硅膠的色譜柱上。然后用有機溶劑基的洗脫混合液對紫杉醇進行第三次純化。洗脫混合液優選含有95-98％的二氯甲烷和2-5％的異丙醇。
該步中，優選將結晶溶于二氯甲烷，與硅膠混合后干燥。將浸漬了紫杉醇的硅膠加載到裝有1.5-1.6kg硅膠的色譜柱(長142cm×內徑7.6cm)上。該硅膠柱用二氯甲烷和異丙醇(98-2％/體積)組成的溶劑洗脫和平衡。在0-30psi的壓力下，以約50ml/分的流速用相同的溶劑混合液進行洗脫。F-第三次結晶該步中，根據其純度合并前步經色譜回收的富含紫杉醇的級分，優選根據純度+98～+99％以及90-98％。然后蒸發至干，再形成甲醇溶液。
調整加入的甲醇體積，以使根據HPLC分析的對應于紫杉醇峰的吸光度為1.0-1.5D.O.。
然后往甲醇溶液中加入每體積的溶液2-10倍體積的水，使紫杉醇進行第三次重結晶。優選每體積的甲醇溶液使用4-7倍體積的水。
在上面描述的最后的純化和重結晶步驟中，使用的水優選是通過去離子化/或蒸餾得到的純化水。
根據優選的一個實施方案，將冷卻到2-4℃的7-10倍體積的純水加到冷卻在冰中的1體積的甲醇溶液中。而后，立即出現結晶。在2-4℃下整夜繼續結晶過程。
將水加到甲醇溶液中的操作可在室溫下進行。如此形成結晶的速度稍慢，但其在2-4℃過夜充分結晶。為獲得細而松散的結晶，過濾結晶并通風或真空干燥。然后將結晶再懸浮于純水中并在約-60℃凍干66-72小時。
所得紫杉烷級分用自動加樣器(Waters 717 plus)、光電二極管陣列檢測器(Waters 996)、多溶劑遞送系統(Waters600E)和C18Nova-Pak柱(60埃，4微米(3.9×150mm))經HPLC色譜分析(Waters系統)。
注射5微升樣品分離級分。當使用溶劑系統乙腈-水-甲醇(自20∶50∶30至35∶35∶30)時，流動相的流速約為1ml/分。
在228nm檢測化合物的峰，樣品分析時間約為36分鐘。
在色譜純化步驟中用于溶解殘余物的揮發性溶劑優選選自酮類(cetones)、C1-C3輕質醇類、乙酸乙酯、二氯甲烷和這些溶劑的混合物。
在步驟F結束時，紫杉醇在水中結晶、過濾并干燥后，獲得紫杉醇結晶混合物。該紫杉醇結晶的混合物包含-53％純度高于99％的結晶；-22％純度高于98％的結晶；和-23％純度高于92％的結晶。
下列實施例僅用于說明，而不應認為是對本發明范圍的限制。
實施例1提取用去離子水洗滌50kg干燥的加拿大紅豆杉的針葉和樹枝后，在通風下干燥。將該原料粉碎并轉移到布袋中。將該布袋放入盛有150L混合溶劑(二氯甲烷-甲醇1∶1體積/體積)的不銹鋼罐中。在室溫下提取16小時。將提取液泵入過濾器中過濾到雙層壁的罐中。借助在罐的雙層壁中循環的70℃熱水蒸餾溶劑直至獲得非常粘稠的液體。第一次沉淀回收提取濃縮物并用2L甲醇稀釋。往提取物中加入20mM NaOH溶液通過沉淀分離生物質。在提取物加到NaOH溶液中時形成非常細的沉淀。提取物與堿性溶液的體積比約為1∶15。
細微沉淀非常難以過濾。只有非常高速(15000-20000rpm)的離心才能回收生物質。因此，為使沉淀更加凝聚，以50g/L溶液的比例往該溶液中加入氯化鈉。然后過濾沉淀或在20℃下以4200rpm的速度離心30分鐘(J6MC Beckman離心機，4.2JS轉子)。應該清楚，可使用連續流動的離心機處理大量沉淀。
所得沉淀經空氣或真空干燥或者凍干(凍干機-FTS系統)。沉淀的重量約為500-550g。為除去其中包含的不溶性顆粒，將該沉淀溶解于2L丙酮中并在0-2℃下以4200rpm離心30分鐘。脫色然后，將1L丙酮溶液加到6L燒瓶中，通過在每次連續加入1L己烷后劇烈人工振搖使該溶液與4L己烷混合。使該混合物放置約10分鐘，回收瓶底部的油相。
在實踐中，可使用大的Becher或者足夠大的罐一次性地處理丙酮溶液，可虹吸出己烷并將剩余的液體轉移到一單獨的燒瓶中以充分回收油相。
該步期間，棄去深色的己烷相。第二次沉淀然后將油相蒸發至干。殘余物溶于2L甲醇中。通過將該甲醇溶液加到20mM HCl溶液中得到沉淀第二次分離生物質。加入提取液時形成非常細微的沉淀。提取液與酸性溶液的比例約為1∶5。該細微沉淀仍非常難以過濾。只有非常高速(15000-20000rpm)的離心才能回收生物質。因此，為使沉淀更加凝聚，再次往該溶液中加入氯化鈉(50g/L溶液)。然后過濾沉淀或者在20℃下以4200rpm的速度離心30分鐘(J6MCBeckman離心機，4.2JS轉子)。也可使用連續流動的離心機處理大量沉淀。通過低壓硅膠色譜的第一次純化將回收的沉淀經空氣或真空干燥或者凍干。沉淀的重量約為240-260g。將該沉淀溶于0.5L丙酮并在0-2℃下于4200rpm離心30分鐘，以除去其中含有的不溶性顆粒。然后將丙酮溶液與200-250g硅膠(230-400目，藥用級，Silicycle，Quebec，Canada)混合。將浸漬了提取物的硅膠通風或者真空干燥。將干燥的硅膠加載到裝有2.2kg硅膠(230-400目)的柱(142×7.6cm內徑)上。硅膠用丙酮和己烷的混合液(40∶60％，體積/體積)洗脫和平衡。用Dynamax溶劑遞送系統，用相同的溶劑進行洗脫。在10-30psi壓力下，洗脫液流速約為100ml/分。混合溶劑的體積約為30L，并以1L溶劑每份分批收集各級分。HPLC分析表明所得的第17-25號的9份級分含有紫杉醇。
通過HPLC測得這些級分中的紫杉醇含量分別為11；24；32；40；38；33；29；14和9％。
值得指出的是含紫杉醇的級分在不同次的純化之間可能偏離到其它級分。通過低壓硅膠色譜的第二次純化合并含紫杉醇的級分并蒸發至干。將殘余物重新溶于100ml丙酮并將其與100g硅膠混合。將包被紫杉醇的硅膠在通風下空氣或者真空干燥。將干燥的硅膠加載到裝有2.2kg硅膠(230-400目)柱(142×7.6cm內徑)上。硅膠用丙酮和己烷的混合液(40∶60％，體積/體積)洗脫和平衡。使用溶劑遞送系統，用相同的溶劑進行洗脫。在10-30psi壓力下，洗脫液流速約為100ml/分。混合溶劑的體積約為30L，以1L溶劑/級分分批收集級分。HPLC分析表明第22-26號的5份級分含有紫杉醇。通過HPLC測得這些級分中的紫杉醇含量分別為40；58；66；50和49％。這些含紫杉醇的級分可在不同次的純化之間偏離到其它級分。第一次結晶合并含紫杉醇的級分并蒸發至干。將殘余物再溶于800ml丙酮中。根據HPLC分析，調整丙酮的量以使對應于紫杉醇峰的溶液的吸光度為1.0-1.5D.O.。往該丙酮溶液中加入3倍體積的己烷(2.4L)。隨后形成結晶。使該混合物在2-8℃下保持過夜以使其充分結晶。第二次結晶過濾所得結晶并將其再溶于400ml丙酮中。往該丙酮溶液中加入3倍體積(2.4L)的己烷。隨后形成結晶。使該混合物在2-8℃保持過夜以使其充分結晶。使結晶在空氣或真空下干燥。
所得結晶的干重為約10g±0.2g。HPLC分析表明紫杉醇含量約為80％或高于80％。通過低壓硅膠色譜的第三次純化將結晶再次溶于75ml二氯甲烷中并將其溶于75g硅膠混合。使包含了提取物的硅膠經通風或者真空干燥。將干燥的硅膠加載到裝有1.5kg硅膠(230-400目)的柱(142×7.6cm內徑)上。硅膠用二氯甲烷和異丙醇的混合液(98∶2％，體積/體積)洗脫和平衡。使用Dynamax溶劑遞送系統，用相同的溶劑進行洗脫。在10-30psi壓力下，洗脫液流速約為50ml/分?；旌先軇┑捏w積約為30L，并以1L溶劑每份收集各級分。HPLC分析表明所得的第11-22號的12份級分含有紫杉醇。通過HPLC測得這些級分中的紫杉醇含量分別為80；97；99.50；99.70；99.70；99.30；98.60；97.30；94；92；89和85％。同樣，含紫杉醇的級分在不同次的純化之間可偏離到其它級分。第三次結晶據其純度合并含紫杉醇的級分并蒸發至干。將12-16號級分溶于100ml甲醇(HPLC級)，17-18號級分溶于45ml甲醇(HPLC級)，19-22號級分溶于75ml甲醇(HPLC級)。
1)將預先冷至2-8℃的700ml水(HPLC級)加到在冰中冷卻的該甲醇溶液中(12-16號)。立即出現白色結晶。
2)將預先冷至2-8℃的300ml水(HPLC級)加到在冰中冷卻的該甲醇溶液中(17-18號)。立即出現白色結晶。
3)將預先冷至2-8℃的500ml水(HPLC級)加到在冰中冷卻的該甲醇溶液中(19-22號)。立即出現白色結晶。
分別過濾和用空氣或真空干燥該結晶。結晶的干重和經HPLC分析的純度如下12-16號級分3.40g-純度99.30％17-18號級分1.40g-純度98.85％19-22號級分1.60g-純度92.70％將純度低于98％的結晶放在一邊，并一起再次以與上述第三次純化步驟相同的條件通過色譜進行純化。再次純化獲得的純度高于99％的結晶占結晶總量的約75％。
實施例2實施例2中公開的方法類似于實施例1公開的方法，不同的是如下進行第一次和第二次沉淀步驟。第一次沉淀回收提取濃縮物并用2L甲醇稀釋。將提取物加到20mM HCl溶液中通過沉淀分離生物質。提取物加入時形成非常細微的沉淀。提取物與酸性溶液的比例為約1∶10。該細微沉淀非常難過濾。只有高速(15000-20000rpm)離心才能回收生物質。因此，為使沉淀更加凝聚，以50g/L溶液的比率往該溶液中加入氯化鈉。然后在20℃下以4200rpm的速度離心30分鐘(J6MC Beckman離心機，4.2JS轉子)。
將回收的沉淀在空氣或真空下干燥或者凍干。沉淀的重量為約500-520g。將該沉淀溶于2L丙酮中，過濾并在0-2℃下以4200rpm速度離心，除去其中包含的不溶性顆粒。第二次沉淀然后將油相蒸發至干。殘余物溶于2L甲醇中。將該甲醇溶液加到20mM NaOH溶液中通過沉淀第二次分離生物質。提取物加入時形成非常細微的沉淀。提取物與堿性溶液的比例為約1∶5。該細微沉淀非常難過濾。只有高速(15000-20000rpm)離心才能回收生物質。因此，為使沉淀更加凝聚，以50g/L溶液的比率往該溶液中加入氯化鈉。然后在20℃下以4200rpm的速度離心30分鐘(J6MC Beckman離心機，4.2JS轉子)。
實施例2獲得的紫杉醇的產率和純度與實施例1相同。
上述實施例表明與現有技術已知的各種方法相比，本發明方法明顯降低了紫杉醇的生產成本。這種成本降低的原因是由于可治療用純度的紫杉醇收率的提高以及顯著地節省了不可回收產品(溶劑、硅膠…)和生產時間。除了上述優點外，本發明提供了一種非常簡單、快速和容易的方法，該方法可以工業規模使用并且不受所處理生物質中紫杉醇的低含量的限制。
權利要求
1.從含有待提取的紫杉醇的天然紫杉烷原料提取和純化紫杉醇的方法，所述方法包括下列步驟a)用有機溶劑從所述天然紫杉烷原料提取含紫杉醇的粗提物；b)將所述粗提物用堿或酸處理，通過沉淀得到生物質，分離所述生物質并將其干燥；c)通過除去其中含有的樹脂和天然色素，脫去如此分離的生物質的顏色，將所述生物質溶于丙酮后，往其中加入至少一種非極性溶劑直至獲得富含紫杉醇的油相；d)用堿或酸處理上步回收的富含紫杉醇的油相中包含的生物質，通過沉淀獲得另一種生物質，分離所述的另一種生物質并將其干燥；e)上步獲得的分離的另一種生物質在揮發性溶劑中的溶液經色譜純化至少一次，并使經色譜得到的純化的溶液進行至少一次的結晶。
2.權利要求1的方法，特征在于含紫杉醇的天然紫杉烷原料包括選自下列的松柏類植物短葉紅豆杉、歐洲紅豆杉、加拿大紅豆杉、喜馬拉雅紅豆杉、云南紅豆杉、Taxus densiformis、Taxus hicksii、Taxus wardii、東北紅豆杉、Taxus capitata、Taxus brownii。
3.權利要求1或2的方法，特征在于在步驟(a)中，處理松柏類植物的所有各部分。
4.權利要求1-2任一項的方法，特征在于在步驟(a)中，處理松柏類植物的樹皮。
5.權利要求1或2任一項的方法，特征在于在步驟(a)中，同時處理松柏類植物的樹枝和針葉。
6.權利要求1-5任一項的方法，特征在于在步驟(a)中，有機溶劑選自醇類、鹵代烴以及醇類和鹵代烴的混合物。
7.權利要求6的方法，特征在于在步驟(a)中，溶劑是甲醇和二氯甲烷的混合物或者甲醇和三氯甲烷的混合物。
8.權利要求6或7的方法，特征在于醇和鹵代烴以9∶1～1∶9的體積比存在。
9.權利要求8的方法，特征在于醇與鹵代烴的體積比為約1∶1。
10.權利要求1-9任一項的方法，特征在于在步驟(b)中，在選自下列的堿性鹽溶液組成的堿性介質中沉淀生物質乙酸鈉、乙酸鉀、氫氧化鈉和三(羥甲基)氨基甲烷。
11.權利要求10的方法，特征在于-堿性鹽是氫氧化鈉；-氫氧化鈉的使用濃度為10mM-80mM/升溶液；和-溶液的pH為8.5-11。
12.權利要求10和11任一項的方法，特征在于溶液的pH為9-10。
13.權利要求1-10任一項的方法，特征在于在步驟(b)中，在由無機酸溶液或有機酸溶液構成的酸性介質中沉淀生物質。
14.權利要求13的方法，特征在于所述酸選自鹽酸、乙酸和檸檬酸。
15.權利要求13-14任一項的方法，特征在于所述溶液的酸濃度為10mM-50mM/升溶液。
16.權利要求15的方法，特征在于所述酸濃度為20mM-30mM/升溶液。
17.權利要求13-16任一項的方法，特征在于溶液的pH為2-4。
18.權利要求1-17任一項的方法，特征在于在步驟(b)中，使生物質沉淀的所述堿或酸溶液與步驟(a)中提取的粗提物的所說溶液的體積比為1-10。
19.權利要求1-18任一項的方法，特征在于在沉淀的生物質分離和干燥前，通過往其中加入氯化鈉使其鹽化，氯化鈉以25-200g/升用于沉淀的溶液的濃度加入。
20.權利要求19的方法，特征在于氯化鈉以50-100g/升用于沉淀的溶液的濃度加入。
21.權利要求1-20任一項的方法，特征在于沉淀的生物質經過濾或離心分離，然后經通風干燥或凍干。
22.權利要求1-21任一項的方法，特征在于用于步驟(c)的所用的至少一種非極性溶劑選自己烷或庚烷。
23.權利要求1-22任一項的方法，特征在于在步驟(c)中，通過加入2倍于步驟(a)提取的粗提物體積的丙酮使步驟(b)獲得的干燥的生物質重新形成溶液。
24.權利要求1-22任一項的方法，特征在于通過加入丙酮，然后加入水，使步驟(b)獲得的干燥的生物質重新形成溶液。
25.權利要求24的方法，特征在于每100體積的加入的丙酮，加入2-10體積比率的水。
26.權利要求1-25任一項的方法，特征在于在步驟(d)中-將步驟(c)獲得的富含紫杉醇的油相蒸發至干并使其重新形成甲醇溶液；和-然后，當步驟(b)所述第一次沉淀步驟在酸性介質中進行時，在堿性介質中沉淀所述甲醇溶液；或者當步驟(b)所述第一次沉淀步驟在堿性介質中進行時，在酸性介質中沉淀所述甲醇溶液；-由此獲得含紫杉醇的生物質，所述紫杉醇是沉淀形式的。
27.權利要求1-16任一項的方法，特征在于在步驟(d)獲得的生物質分離和干燥前，通過往其中加入氯化鈉使其鹽化，氯化鈉以30-200g/升用于沉淀的溶液的濃度加入。
28.權利要求27的方法，特征在于氯化鈉以50-100g/升用于沉淀的溶液的濃度加入。
29.權利要求1-28任一項的方法，特征在于步驟(e)包括下列亞步驟e1)第一次色譜純化，包括將步驟(d)分離的沉淀溶于揮發性溶劑中，制備所得溶液與硅膠的混合物，在包含硅膠的色譜柱上處理所述混合物并回收富含紫杉醇的級分；e2)第二次色譜純化，包括將上步回收的富含紫杉醇的級分蒸發干至獲得殘余物，通過在揮發性溶劑中溶解所述殘余物制備混合物，將所述混合物在與上亞步驟相同的條件下進行再次純化，得到其它富含紫杉醇的級分；e3)第一次結晶，包括將上亞步驟獲得的其它富含紫杉醇的級分蒸發干至獲得殘余物，制備所述殘余物在丙酮中的混合物并用非極性溶劑使該混合物中所含的紫杉醇結晶；e4)第二次結晶，包括在丙酮中溶解上亞步驟獲得的紫杉醇結晶并在與上亞步驟相同的條件下使紫杉醇重結晶；e5)第三次色譜純化，包括將上亞步驟重結晶得到的結晶溶于揮發性溶劑中得到溶液，制備所述溶液與硅膠的混合物并經包含硅膠的色譜柱用洗脫溶劑處理該混合物，獲得進一步的富含紫杉醇的級分；和e6)第三次結晶，包括將上亞步驟獲得的進一步的富含紫杉醇的級分蒸發干至獲得殘余物，將該殘余物溶于醇、酮或醇-酮混合溶劑中獲得另一種混合物，用水使所述另一種混合物中的紫杉醇結晶。
30.權利要求29的方法，特征在于在步驟(e1)中-使步驟(d)獲得的生物質在揮發性溶劑中重新形成溶液；-將如此獲得的溶液與硅膠混合并在通風下干燥；-將從該生物質中回收的硅膠加載到包含硅膠的色譜柱上；和-用含30-40％丙酮和60-70％己烷的洗脫混合液純化生物質。
31.權利要求30的方法，特征在于洗脫混合液含約40％的丙酮和約60％的己烷。
32.權利要求29-31任一項的方法，特征在于在步驟(e2)中-重新組合通過步驟(e1)色譜獲得的富含紫杉醇的級分，蒸發至干后重新在揮發性溶劑中形成溶液；-將所得溶液與硅膠混合并在通風下干燥；-將從該生物質中回收的硅膠加載到含硅膠的色譜柱上；和-通過包含30-40％丙酮和60-70％己烷的有機溶劑混合物再次純化紫杉醇。
33.權利要求32的方法，特征在于所述有機溶劑混合物包含約40％的丙酮和約60％的己烷。
34.權利要求29-31任一項的方法，特征在于在步驟(e3)中-重新組合通過步驟(e2)經色譜獲得的含紫杉醇的級分并將其蒸發至干，并使其重新形成丙酮溶液，同時調整丙酮的量，以使根據HPLC分析的對應于紫杉醇的峰的溶液的吸光度為1.0-1.5 D.O.；和-然后將3-4倍體積的已烷加到該丙酮溶液中，使紫杉醇結晶。
35.權利要求29-34任一項的方法，特征在于在步驟(e4)中-過濾分離步驟(e3)獲得的結晶并使其重新形成丙酮溶液，調整丙酮的體積，以使根據HPLC分析的對應于紫杉醇的峰的溶液的吸光度為1.0-1.5D.O.；和-然后將3-4倍體積的己烷加到該丙酮溶液中，使紫杉醇結晶。
36.權利要求29-35任一項的方法，特征在于在步驟(e5)中-過濾步驟(e4)獲得的結晶并使其重新形成二氯甲烷溶液；-將所得溶液與硅膠混合并在通風下干燥；-將包有紫杉醇的硅膠加載到含硅膠的色譜柱上；和-然后用有機溶劑基的洗脫混合液對紫杉醇進行第三次再純化。
37.權利要求36的方法，特征在于洗脫混合液含有95-98％的二氯甲烷和2-5％的異丙醇。
38.權利要求29-37任一項的方法，特征在于在步驟(e6)中-根據其純度重新組合通過步驟(e5)經色譜獲得的富含紫杉醇的級分并將其蒸發至干，并使其重新形成甲醇溶液，調整加入甲醇的體積，以使根據HPLC分析的對應于紫杉醇峰的溶液的吸光度為1.0-1.5D.O.；和-然后將2-10倍體積的水加到該甲醇溶液中，使紫杉醇進行第三次重結晶。
39.權利要求38的方法，特征在于將4-7倍體積的水加到所述甲醇溶液中，使紫杉醇進行第三次重結晶。
40.權利要求29-39任一項的方法，特征在于步驟(e1)、(e2)和(e3)中使用的揮發性溶劑優選選自丙酮、C1-C3輕質醇類、乙酸乙酯、二氯甲烷和這些溶劑的混合物。
41.權利要求29-40任一項的方法，特征在于，在步驟(e6)中，紫杉醇在水中結晶后，過濾獲得紫杉醇混合物，然后干燥。
42.權利要求1-41任一項的方法，特征在于在整個方法中使用的水是通過去離子和/或蒸餾純化的。
43.通過權利要求1-42任一項的方法獲得的紫杉醇結晶的混合物。
44.通過權利要求29-41任一項的方法獲得的紫杉醇結晶的混合物，特征在于過濾和干燥結晶后，所述混合物包含-約53％的純度高于99％的結晶；-約22％的純度高于98％的結晶；和-約23％的純度高于92％的結晶。
全文摘要
一種從天然紫杉烷原料提取和純化紫杉醇的方法。該方法包括下列步驟:a)用有機溶劑從上述天然紫杉烷原料提取含紫杉醇的粗提物;b)將所述粗提物用堿或酸處理,通過沉淀得到生物質,分離所述生物質并將其干燥;c)通過除去其中含有的樹脂和天然色素,脫去所分離的生物質的顏色,將所述生物質溶于丙酮后,往其中加入至少一種非極性溶劑直至獲得富含紫杉醇的油相;d)用堿或酸處理上步回收的富含紫杉醇的油相中包含的生物質,通過沉淀獲得另一種生物質,分離所述的另一種生物質并將其干燥;e)上步獲得的分離的另一種生物質在揮發性溶劑中的溶液經色譜純化至少一次,并使經色譜得到的純化溶液進行至少一次的結晶。該方法包括有限的步驟,且經過濾和干燥后可得紫杉醇結晶混合物,由以下組成:約53%的純度高于99%的結晶,約22%的純度高于98%的結晶,和約23%的純度高于92%的結晶。
文檔編號C07D305/14GK1356992SQ00809326
公開日2002年7月3日 申請日期2000年5月25日 優先權日1999年6月22日
發明者T·布－卡克, N·杜皮斯 申請人:沙徹姆制藥國際公司