專利名稱：對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽與分離方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽，尤其是涉及一種對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽與分離方法及其對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽在制備雜草種子萌發生抑制劑或除草劑的應用。
背景技術：
化學除草劑的廣泛使用對于控制雜草對農田和城市草坪的侵入和危害發揮了重要作用。公開號為CN1181184A的發明專利申請公開一種非耕地用高效除草組合物，是一種含有對雜草種子、幼芽、幼草有殺滅作用的嘧黃隆以及對雜草地上綠色部分有殺滅作用的百草枯、茅草粘、環嗪酮等復配而成的系列高效除草組合物。公開號為CN1687086A的發明專利申請公開一種具有殺菌除草活性的取代苯氧乙酰氧基芳雜環基烴次膦酸酯鹽及制備方法。公開號為CN1631156的發明專利申請公開了一種除草劑，它由N-(膦羧基甲基)甘氨酸、1，1-二甲基-4，4’-聯吡啶陽離5-三嗪-2-基)-N-甲基氨碳酰]氨基磺酰]苯甲酸甲酯、3-異丙基-2，1，3-苯并噻二嗪酮-(4)-理組成。公開號為CN1679396的發明專利申請提供了對禾谷類作物具有選擇性的除草組合物。然而傳統化學農藥的大量使用導致雜草的抗藥性并造成環境污染，如土壤、地下水和農產品中的化學除草劑殘留逐年增多，危害了人類及動物的安全。因此，研制出天然、無毒副作用、可降解的除草劑有著重要的生態效益和廣泛的應用前景。20世紀90年代初，美國Iwoa州立大學的園藝學家N.E Christians(.Liu，D.L.-Y.and N.E.Christians.Isolation and identification of root-inhibiting compounds fromcorn gluten hydrolysate.J.Plant Grown Regul.，1994，13227-230)發現玉米蛋白粉能抑制植物種子萌發時根系的形成，并開發出玉米蛋白粉萌前除草劑，但玉米蛋白粉為固體粉末，不溶于水，因而它不能象液體除草劑那樣能噴施和易于滲入土壤發揮功效，后來N.E.Christans(.Christians，N.E.，J.T.Garbutt and D.Liu.Preemergence weed control using plant proteinhydrolysate.U.S.PatentNo.5,290,749，1994a)等人用堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉制備的水解物比玉米蛋白粉有更高的除草活性，并進而分離純化出除草活性肽單體；在實驗室培養皿內的除草活性實驗表明，除草活性肽單體比玉米蛋白粉水解粗提物對植物種子萌發生根的抑制作用更為顯著。他們從玉米蛋白粉的水解物中分離出5個具有除草活性的的2肽和一個除草活性更強的5肽，并分別申請兩項專利。這些多肽的序列分別是Gln-Gln，Ala-Asa，Ala-Gln，Gly-Ala，Ala-Ala和Leu-Ser-Pro-Ala-Gln。活性多肽的除草機制是通過阻斷種子根系分生組織的有絲分裂來抑制種子根系的形成，這種抑制作用不論是雙子葉植物雜草還是單子葉植物雜草都有效果，而對萌后的成熟根系則沒有影響，且對環境不產生任何的污染作用并可作為草坪植物的肥源。他們的研究還推測，玉米水解物中還可能存在其他具有除草活性的多肽單體。但此后，此研究領域的進展卻十分緩慢。

發明內容
本發明的目的在于提供一種對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽；本發明的另一目的在于提供一種對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽分離方法；本發明的另一目的在于將對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽用于制備雜草萌發生根抑制劑或除草劑。
本發明所述的對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽其氨基酸序列為Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser，其分子量為986.5822，理論等電點為5.24，為白色粉末，易溶于水，可配成不同濃度來噴施土壤來防除雜草種子萌發。
所述的玉米蛋白粉多肽均不來自于玉米醇溶蛋白，而是來自于其它的蛋白。
本發明所述的對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽的分離方法，其步驟為1)原料玉米蛋白粉經粉碎后，收集篩下的淡黃色粉末作為酶解底物；2)在玉米蛋白粉中加入堿性蛋白酶水解得水解液，玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶(0.03～0.05AU)，pH為7～9，水解溫度為50～70℃，水解時間為7～8h；3)水解液經離子交換層析，分離得到活性組分；4)將分離得到的活性組分經凝膠層析得高對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽活性組分；5)將分離得到的高對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽活性組分經兩次反相高效液相色譜，篩選出具有高抑制活性的組分，經過測定，其序列為Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser。
在步驟1)中，原料玉米蛋白粉經粉碎后最好過200目篩。
在步驟2)中，玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶0.042AU，pH為8.0，水解溫度為60℃，水解時間為6h，堿性蛋白酶選自Alacalase 2.4L。
本發明所述的對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽具有高抑制雜草萌發生根活性或除草活性，可用于制備雜草萌發生根抑制劑或除草劑。
通過對本發明獲得的對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽與已報道的玉米醇溶蛋白的氨基酸序列進行比對表明，本發明得到的多肽均不來自于玉米醇溶蛋白，而是來自于其它的蛋白，而且該多肽序列目前尚未見到報道。
具體實施例方式
以下實施例將對本發明作進一步的說明。
實施例11)以玉米蛋白為原料，其為較大的褐色片狀顆粒，為了便于酶解反應時酶與底物能夠充分接觸，原料按如下方式進行預處理將原料玉米蛋白粉經粉碎機粉碎后過200目篩，收集篩下的淡黃色粉末作為酶解底物。
2)在玉米蛋白粉中加入堿性蛋白酶水解，玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶0.042AU，pH為8.0，水解溫度為60℃，水解時間為6h，堿性蛋白酶選自Alacalase 2.4L。
3)水解液經離子交換層析，離子交換填料為QAE-A25，工藝步驟為填料預處理→裝柱→上樣→梯度洗脫，工藝條件為(1)填料預處理稱取7g QAE-A25陰離子交換樹脂粉末于燒杯中，加入一定體積的洗脫液A，于沸水浴中溶脹2h，冷卻后倒掉液面上漂浮的細小顆粒，用洗脫液A反復清洗幾次，配成75％的懸浮液，然后在真空箱中抽真空趕掉懸浮液中的氣泡備用。(2)裝柱將層析柱(C16/40，內徑16mm，長40cm)用去離子水清洗干凈后垂直放于鐵架臺上，加入一定量的洗脫液A，打開出水口以趕走底部的氣泡，當柱底部的緩沖液約有2cm高時關閉層析柱底部出水口。將溶脹好的、攪拌均勻的凝膠懸浮液一次性的倒入層析柱中，然后迅速的接上蠕動泵，打開出水口，以2mL/min的流速將洗脫液A泵入層析柱中使填料迅速沉降，待填料全部沉降完全后再用5mL/min的流速擠壓填料，待柱床高度不再變化后停泵，迅速將Adaptor接上并適當壓緊，使床表面無多余空間和洗脫液，此時床體積高度約為13cm。用洗脫液A平衡2個床體積后即可使用。(3)上樣蠕動泵上樣，上樣量為300mg，上樣速度為0.5mL/min。(4)梯度洗脫洗脫液A為30mmol/LpH8.0Tris-HCl，洗脫液B的離子強度為2mol/LNaCl，離子強度梯度(NaCl)為0.024mol/L.min、洗脫流速為0.9mL/min、。
4)由步驟3)分離得到的高對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽活性組分經凝膠層析，填料為Superdex 30p.g.。工藝步驟為填料預處理→裝柱→上樣→洗脫。工藝條件為(1)填料預處理填料已經在20％乙醇中預溶脹好，因此在使用時只需要先將乙醇除去即可使用。用經0.45μm濾膜濾過的去離子水反復清洗填料，直至將乙醇完全除去，然后放入真空干燥箱中抽真空即可裝柱。(2)裝柱將水去離子水清洗干凈的層析柱(XK16/70，內徑16mm，長70cm)垂直放置于鐵架臺上。先向柱內加入一定量的洗脫液，將柱底端的氣泡排出，然后關閉柱出口，并在柱的頂端接上Revisior。將已經處理好的填料用去離子水調至體積約475mL的均勻的懸濁液，然后沿玻璃棒一次性倒入層析柱中，迅速將蠕動泵連上，用洗脫液以1mL/min的速度沖洗柱子2h，以加速填料的沉降并使填料均勻沉降。待填料沉降完全后小心取下Revisior，接上Adaptor，再以4mL/min的速度沖壓柱子，待柱高不再發生變化時即可停泵。將Adaptor向下稍微用力壓緊，使之與床表面緊密接觸不留空隙。再用緩沖液平衡兩個床體積即可使用。用該法裝柱有很好的重復性。(3)上樣蠕動泵上樣，上樣量為床體積的2％，上樣速度為0.5mL/min。(4)洗脫洗脫液為pH6.050mol/Lm乙酸-乙酸銨緩沖溶液，洗脫流速為0.9mL/min。
5)由步驟4)所分離得到的高對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽活性組分經兩次反相高效液相色譜，色譜柱為Everest C18反相柱(4.6mm×250mm，238TP54)，采用梯度洗脫，流動相A為為5％乙腈+0.1％三氟乙酸，B相為純乙腈+0.1％三氟乙酸。色譜分離條件為見表1。篩選出具有高抑制活性的組分，經過測定，其序列為Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser。
表1色譜分離條件

實施例2與實施例1類似，其區別在于玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶0.05AU，pH為7～9，水解溫度為50℃，水解時間為8h，堿性蛋白酶選自Alacalase2.4L。
實施例3與實施例1類似，其區別在于玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶0.03AU，pH為7～9，水解溫度為70℃，水解時間為7h，堿性蛋白酶選自Alacalase2.4L。
實施例4以下給出對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽抑制雜草萌發生根或除草活性的檢測方法與結果。
取雜草野菊(Dendranthema indicum)種子用75％酒精殺菌并用蒸餾水沖洗3次后放在雙層濾紙上置于6cm的培養皿中，先加入1ml去離子水，蓋上上蓋培養5天后，對所設置實驗處理分別加入1ml相應濃度的多肽液后用Parafilm封口膠封口培養。培養條件每天光照16h，溫度25℃，光照強度1500lx。培養時間共7天。對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽各設4個濃度處理，分別為0.5mg/ml，1.0mg/ml，1.5mg/ml，2.0mg/l，以去離子水為對照，各處理和對照選用20粒種子，重復3次。培養時間結束后用數顯游標卡尺測量各幼苗根系中最長根的長度作為統計標準。
以下給出實驗結果及應用。
抑制率如下式計算抑制率(％)＝(對照組根長-處理組根長)/對照組根長×100％所有定量指標均用x±s表示。
實驗結果見表1，不同濃度的多肽溶液對野菊種子萌發生根均有明顯的抑制作用，多肽Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser濃度在2mg/ml時抑制率約為91％。此外，進一步的實驗還表明該多肽還對4種單子葉植物和5種雙子葉植物雜草種子萌發時根系的形成也有明顯的抑制作用。由于多肽物對雜草萌發時根系形成有抑制作用，而且對植物的成熟根系沒有任何影響，因此它可作為一種天然萌前除草劑應用在農田，特別是在有機轉換型蔬菜、城市草坪的雜草防治上有著重要的應用，這樣可以減少使用化學除草劑對環境產生的污染，具有良好的經濟效益、生態效益和社會效益。
表1 不同濃度的多肽溶液對野菊種子萌發生根抑制作用

實施例5～13以下給出本發明所述的對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽抑制單子葉植物狗牙根(Cynodon dactylon(L.)Pers)、光鱗水蜈蚣(Kyllinga brevifolia Rottb.var.leiolepis(Franch.et Savat.)Hara)、牛筋草(Eleucine indica L.Gaertn)和早熟禾(Poa annu L.)以及雙子葉植物綠莧(Amaranthus viridis L.)、一點紅(Emilia sonchifolia(L.)DC.)、勝紅薊(Ageratum conyzoides L)、馬蹄金(Dichondra repens Fors)和羽芒菊(Tridaxprocumbens L)等雜草種類的實驗結果，詳見表2。
表2 2mg/ml多肽對不同雜草種子生根抑制效果(％)

由此可見，由于對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽對成熟根系不產生任何副作用，而對植物不論是雙子葉植物還是單子葉植物雜草的種子萌發生根有抑制作用，因此可開發成無公害、能降解的萌前除草劑。該產品為白色粉末，易溶于水，可配成不同濃度來噴施土壤來防除雜草種子萌發。
權利要求
1.對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽，其特征在于其氨基酸序列為Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser，其分子量為986.5822，理論等電點為5.24，為白色粉末，易溶于水，可配成不同濃度來噴施土壤來防除雜草種子萌發。
2.對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于其步驟為1)原料玉米蛋白粉經粉碎后，收集篩下的淡黃色粉末作為酶解底物；2)在玉米蛋白粉中加入堿性蛋白酶水解得水解液；3)水解液經離子交換層析，分離得到活性組分；4)將分離得到的活性組分經凝膠層析得高抑制雜草萌發生根玉米蛋白粉多肽活性組分；5)將分離得到的高抑制雜草萌發生根玉米蛋白粉多肽活性組分經兩次反相高效液相色譜，篩選出具有高抑制活性的組分，經過測定，其序列為Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser。
3.如權利要求1所述的對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于在步驟1)中，原料玉米蛋白粉經粉碎后過200目篩。
4.如權利要求1所述的對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于在步驟2)中，玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶0.03～0.05AU，pH為7～9。
5.如權利要求4所述的對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶0.042AU，pH為8.0。
6.如權利要求1所述的對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于在步驟2)中，玉米蛋白粉中加入堿性蛋白酶水解，水解溫度為50～70℃，水解時間為7～8h。
7.如權利要求6所述的對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于水解溫度為60℃，水解時間為6h。
8.如權利要求1所述的對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于堿性蛋白酶選自Alacalase 2.4L。
9.如權利要求1所述的對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽用于制備雜草萌發生根抑制劑或除草劑的應用。
全文摘要
對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽與分離方法及其應用，涉及一種多肽，尤其是涉及一種對雜草萌發生根具有抑制作用的對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽與分離方法及其對雜草種子萌發生根具抑制作用多肽用于制備雜草種子萌發生抑制劑或除草劑。其氨基酸序列為Ser－Leu－Leu－Pro－Pro－Tyr－Leu－Pro－Ser，分離時收集玉米蛋白粉粉碎后篩下的粉末作為酶解底物，加堿性蛋白酶水解得水解液，水解液經離子交換層析得活性組分后經凝膠層析得高抑制雜草萌發生根玉米蛋白粉多肽活性組分，經兩次反相高效液相色譜篩選出具有高抑制活性組分。具有抑制雜草萌發生根活性，用于制備雜草種子萌發生抑制劑或除草劑。
文檔編號C07K1/14GK1800205SQ200510136698
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月30日 優先權日2005年12月30日
發明者楊劍, 張麗君, 劉冬, 李世敏, 黃國清, 于興娜 申請人:深圳職業技術學院