本發明涉及乳液技術領域，尤其涉及一種絲素蛋白乳狀液滴及其制備方法。

背景技術：

表面活性劑是分子中具有親水基與疏水基，能富集或吸附于界面，使界面性質發生顯著改變而出現界面活性的物質。近年來，乳液在化工、食品、醫藥、化妝品、組織工程修復以及生物檢測等領域發揮了很大的作用。而對于人工合成的高聚物乳化所形成的乳液，往往存在合成方法復雜、副產物多、后處理復雜、毒性大、穩定性差以及尺寸可控性差等特點，從而使其應用領域受限。

近年來，利用多肽分子在互不相容的水油界面自組裝形成網絡結構已有初步的探索，但仍存在尺寸難以調控、穩定性差等特點。而絲素蛋白由于具有良好的生物相容性、優良的機械性能及可調節的降解速度、在水溶液中可加工處理、可再生形成可注射的納米顆粒、微球、水凝膠和粘合劑以及固定位置植入的薄膜和支架等各種形態，使其作為一種天然材料在生物醫用領域具有廣泛的應用。另外，由于絲蛋白具有良好的親疏水性的特點，使其在表面活性劑領域的應用越來越引起關注。但新鮮的再生絲蛋白溶液由于其高濃度下有嚴重的皂化現象且有機相高于60％時，體系流動性顯著下降。現有技術中，還未有直接利用絲蛋白納米纖維經過一定條件的乳化過程制備尺寸可調、穩定性好且表面為介孔結構的乳液的先例。

因此，針對上述技術問題，有必要提供一種穩定的絲素蛋白乳狀液滴的制備方法，該方法還可通過改變乳化條件使絲素蛋白乳狀液滴尺寸可調、穩定性好且具有復雜的納米纖維-介孔結構。

技術實現要素：

本發明解決的技術問題在于提供一種尺寸可調，穩定性好且表面具有介孔結構的絲素蛋白乳狀液滴及其制備方法。

有鑒于此，本申請提供了一種絲素蛋白乳狀液滴，所述絲素蛋白乳狀液滴的直徑為200nm～100μm，其結構為beat-sheet結構，表面具有介孔結構。

優選的，所述絲素蛋白乳狀液滴的乳化類型為水包油型。

本申請還提供了上述方案所述的絲素蛋白乳狀液滴的制備方法，包括以下步驟：

a)，將生絲或蠶繭脫膠，再溶解透析得到絲素蛋白原溶液，然后依次進行濃縮、稀釋和孵育，得到絲素蛋白納米纖維；

b)，將所述絲素蛋白納米纖維進行分散，得到絲素蛋白納米纖維溶液；

c)，將得到的絲素蛋白納米纖維溶液與水油混合溶劑混合，乳化后得到絲素蛋白乳狀液滴。

優選的，在步驟a)中，所述溶解的溶劑包括溴化鋰、氯化鈣-乙醇-水三元溶液與硝酸鈣水溶液。

優選的，在步驟a)中，所述絲素蛋白納米纖維的直徑為10～20nm，長度為100nm～2μm，結構為beat-sheet結構。

優選的，在步驟b)中，所述絲素蛋白納米纖維的濃度為0.1～3wt％。

優選的，在步驟b)中，所述分散的轉速為500～30000rpm，時間為1～60min。

優選的，在步驟c)中，所述水油混合溶劑中水相與油相的體積比為1:9～9:1。

優選的，在步驟c)中，所述水油混合溶劑中的油相選自十二烷、正己烷、正己醇和丁酸丁酯中的一種或多種。

優選的，在步驟c)中，所述乳化的轉速為500～30000rpm，時間為1～60min。

本申請提供了一種絲素蛋白乳狀液滴的制備方法，在制備絲素蛋白乳狀液滴的過程中，本申請首先將生絲或蠶繭經過脫膠、溶解透析、濃縮、稀釋與孵育，得到了絲素蛋白納米纖維；再將得到的絲素蛋白納米纖維進行分散，得到絲素蛋白納米纖維溶液，最后將絲素蛋白納米纖維溶液與水油混合溶劑混合，乳化后得到絲素蛋白乳狀液滴。在上述過程中，本申請利用再生的絲素蛋白原溶液制備了高結晶的絲素蛋白納米纖維，其具有疏水性能夠在油水界面分布，促進乳化的產生，得到乳狀液滴；同時高結晶的絲素蛋白納米纖維使得絲素蛋白能夠相互纏繞，形成穩定的包覆層，進一步的，其具有更高的電荷密度，則提供了更強的電荷斥力，避免了乳滴聚集，進一步提高了乳狀液滴的穩定性；另一方面，絲素蛋白乳狀液滴的尺寸可根據水油混合溶劑的比例進行調節，而使絲素蛋白乳狀液滴的尺寸可調；納米纖維之間的物理纏繞及靜電斥力的平衡，使其表面具有復雜的介孔結構。

附圖說明

圖1為本發明實施例1制備的不同水油比例的絲素蛋白乳狀液滴的宏觀照片；

圖2為本發明實施例1制備的不同水油比例的絲素蛋白乳狀液滴的熒光顯微鏡圖；

圖3為本發明實施例1制備的水油比例為9:1的下層液體的熒光顯微鏡圖；

圖4為本發明實施例1制備的絲素蛋白納米纖維溶液的掃描電鏡圖；

圖5為本發明實施例1制備的絲素蛋白乳化前后的紅外光譜圖；

圖6為本發明實施例1制備的絲素蛋白乳狀液滴的穩定性試驗結果照片；

圖7為本發明實施例1制備的絲素蛋白乳狀液滴凍干后的微觀照片；

圖8為本發明實施例1中s1步驟中濃縮前后的絲蛋白形貌afm照片；

圖9為本發明對比例1制備的不同水油比例的絲素蛋白乳狀液滴的宏觀圖；

圖10為本發明對比例1制備的不同水油比例的不同尺寸的絲素蛋白乳狀液滴的熒光顯微鏡圖；

圖11為本發明對比例1在水油比例1:9以及高濃度下形成的絲素蛋白彈性凝膠的圖片。

具體實施方式

為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明優選實施方案進行描述，但是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發明的特征和優點，而不是對本發明權利要求的限制。

本發明實施例公開了一種絲素蛋白乳狀液滴，所述絲素蛋白乳狀液滴的直徑為200nm～100μm，其結構為beat-sheet結構，表面具有介孔結構。

本申請提供的絲素蛋白乳狀液滴其尺寸可調，其直徑在200nm～100μm范圍內可調，具有高beta-sheet含量的穩定結構，乳化類型為水包油型。本申請提供的絲素蛋白乳狀液滴表面具有復雜的納米纖維-介孔結構。

為了得到上述絲素蛋白乳狀液滴，本發明提供了所述絲素蛋白乳狀液滴的制備方法，包括以下步驟：

a)，將生絲或蠶繭脫膠，溶解透析得到絲蛋白原溶液，再依次進行濃縮、稀釋和孵育，得到絲素蛋白納米纖維；

b)，將所述絲素蛋白納米纖維進行分散，得到絲素蛋白納米纖維溶液；

c)，將得到的絲素蛋白納米纖維溶液與水油混合溶劑混合，乳化后得到絲素蛋白乳狀液滴。

在上述過程中，首先將生絲或蠶繭脫膠，溶解透析得到絲素蛋白原溶液，再將所述絲素蛋白原溶液依次進行濃縮、稀釋與孵育，得到絲素蛋白納米纖維。在此過程中，所述絲素蛋白為本領域技術人員熟知的原料，本申請對其來源沒有特別的限制。所述脫膠與溶解透析的過程為本領域技術人員熟知的技術手段，此處對其技術手段不進行特別的限制。所述溶解透析的溶劑體系為本領域技術人員熟知的溶劑，示例的，所述溶劑選自溴化鋰、氯化鈣-乙醇-水三元溶液以及硝酸鈣水溶液。得到絲素蛋白原溶液之后，將其依次進行濃縮、稀釋與孵育，得到的絲素蛋白為納米纖維結構，其直徑為10～20nm，長度為100nm～2μm，主要為beat-sheet結構。上述濃縮、稀釋和孵育(熱處理)的過程是為了通過調控絲蛋白分子的親疏水作用、濃度、分子運動性等等因素，使絲蛋白納米顆粒自組裝成納米纖維。

上述制備的絲素蛋白納米纖維為一種高結晶的絲素蛋白納米纖維，其納米纖維結構的形成使得絲素蛋白能夠相互纏繞，形成穩定的包覆層，以提高絲素蛋白乳狀液滴的穩定性，同時絲素蛋白納米纖維還具有更高的電荷密度，則提供了更強的電荷斥力，以避免形成的絲素蛋白納米纖維乳狀液滴的聚集，進一步提高乳滴的穩定性，納米纖維之間的物理纏繞及靜電斥力的平衡，使其表面具有復雜的介孔結構。

本申請然后以絲素蛋白納米纖維作為乳化劑，以制備得到絲素蛋白乳狀液滴。上述制備的絲素蛋白納米纖維具有疏水性，其能夠在油水界面分布，促進乳化的產生，得到乳狀液滴。按照本發明，將絲蛋白納米纖維分散均一，得到絲素蛋白納米纖維溶液。所述絲素蛋白納米纖維的濃度為0.1～3wt％，在具體實施例中，所述絲素蛋白納米纖維的濃度為0.2～2wt％。所述分散在一定的轉速、一定的時間下進行分散，所述轉速為500～30000rpm，時間為1～60min；在具體實施例中，所述轉速為10000～15000rpm，時間為10～30min。

最后將所述絲素蛋白納米纖維溶液再水油混合溶劑中進行乳化，得到絲素蛋白乳狀液滴。所述絲素蛋白乳狀液滴的尺寸主要取決于水油相比例，隨著油相的減少，粒徑尺寸先增大后減少，乳狀液滴在200nm～100μm范圍內可調，所述水油混合溶液中水相與油相的體積比為1:9～9:1。所述乳化的轉速為500～30000rpm，時間為1～60min；在具體實施例中，所述乳化的轉速為2500～15000rpm，時間為10～30min。所述水油混合溶劑中的油相需要為疏水性的有機溶劑，示例的，所述油相選自十二烷、正己烷、正己醇和丁酸丁酯中的一種或多種。

本發明的關鍵在于采用高結晶的絲蛋白納米纖維作為乳化劑，其疏水性使其能夠在油水界面分布，促進乳化的產生，而絲素蛋白納米纖維的結構則使乳化的乳滴具有穩定性。普通的絲蛋白溶液無法達到相似效果，因此，本技術的核心在于具有疏水性、高結晶的絲蛋白納米纖維的形成，才可獲得高質量的乳狀液滴。本發明采取直接利用已經beta-sheet化的絲素蛋白納米纖維形成乳液，通過改變乳化過程中的水油混合溶劑的比例，制得一種尺寸可調、穩定性好，表面為介孔結構的乳滴粒子。進一步的，由于高結晶的絲蛋白納米纖維具有更高的電荷密度，從而能夠提供更強的靜電斥力，使得乳狀液滴穩定分散；絲蛋白納米纖維的高結晶性使得絲蛋白分子的親疏水片段的分布更為規律，在水油界面上，疏水部分能更好的分散到油相，親水部分則更多的在水相分布，分散性得到更好的提高。

本申請在制備絲素蛋白乳狀液滴的過程中，通過對絲素蛋白纖維質量、乳化速度及乳化時間的控制，實現對絲素蛋白纖維尺寸剪切破壞程度的控制，隨后通過加入不同極性的有機溶劑及不同的水油配比進行乳化處理，最終獲得尺寸可調、穩定性好，表面為介孔結構的絲素蛋白納米纖維組成的乳狀液滴。在上述過程中，通過對絲素蛋白纖維質量的控制，最終獲得不同尺寸的絲素蛋白乳液；通過調控轉速和時間，最終獲得不同尺寸的絲素蛋白乳液；通過改變不同極性的有機溶劑，最終獲得不同尺寸的絲素蛋白乳液；通過調控不同的水油配比，最終獲得不同尺寸的絲素蛋白乳液。同以往的其他多肽分子自組裝形成的乳液相比，本發明所制備的絲素蛋白乳狀液滴尺寸可調，為高beta-sheet含量的穩定結構，負電性高、穩定性好，且分散性好、不易聚集，有利于以此為藥物載體構建不同功能和釋放行為的載藥絲素蛋白顆粒，以及在化工、食品、化妝品、組織工程、生物檢測等領域有更廣泛的應用；同時本申請絲素蛋白乳狀液滴的制備方法，工藝簡單、可批量生產、凍干處理后材料強度高、生物相容性好。

為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明提供的絲素蛋白乳狀液滴的制備方法進行詳細說明，本發明的保護范圍不受以下實施例的限制。

實施例1

s1：將生絲脫膠，溴化鋰溶解透析制備原溶液，再經過可控濃縮、稀釋和孵育的方法制得絲蛋白納米纖維；

s2：將0.1％的絲蛋白納米纖維在500rpm、10min下分散成均一的納米纖維溶液；

s3：將所述納米纖維溶液中分別加入不同配比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)的水油混合溶劑，在2800rpm、10min的乳化作用下形成絲素蛋白乳狀液滴。

圖1為本發明實施例1制備的不同水油比例的絲素蛋白乳狀液滴的宏觀圖；圖2為本發明實施例1制備的不同水油比例的不同尺寸的絲素蛋白乳狀液滴的熒光顯微鏡圖；圖3為本發明實施例1水油比例為9:1的下層液體的熒光顯微鏡圖；圖4為本實施例s2制備得到的絲蛋白納米纖維水溶液的掃描電鏡圖；圖5為本發明絲蛋白納米纖維乳化前后的紅外光譜圖。由圖可知，本發明中的絲素蛋白乳狀液滴，其直徑在200nm～100μm之間，穩定性好，乳化類型為水包油型。

圖6為本發明實施例1制備的絲素蛋白乳狀液滴室溫與60℃下存儲狀態的照片，圖中rt中的d0、d36與d110分別表示第0、36與110天的存儲狀態照片，60℃中的d0、d36與d90分別表示第0、36與90天的存儲狀態照片；由圖6可知，室溫或高溫的存儲條件本申請制備的絲素蛋白乳狀液滴的狀態未發生變化。

檢測本實施例制備的絲素蛋白乳狀液滴的強度，afm測得，本實施例制備得到的絲素蛋白乳狀液滴的彈性模量為25.4mpa；圖7為絲素蛋白乳狀液滴凍干后的表面形貌，由圖可知，絲素蛋白乳狀液滴凍干后樣品表面無大面積破損，且表面形成介孔結構。

圖8為本實施例s1步驟中濃縮前后的絲蛋白形貌afm照片。

實施例2

s1：將絲蛋白脫膠，溴化鋰溶解透析制備原溶液，再經過可控濃縮、稀釋和孵育的方法制得絲蛋白納米纖維；

s2：將0.2％的絲蛋白納米纖維在10000rpm、1min下分散成均一的納米纖維溶液；

s3：將所述納米纖維溶液中分別加入不同配比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)的水油混合溶劑，在10000rpm、10min的乳化作用下形成絲素蛋白乳狀液滴。

實施例3

s1：將絲蛋白脫膠，氯化鈣-乙醇-水三元溶液溶解透析制備原溶液，再經過可控濃縮、稀釋和孵育的方法制得絲蛋白納米纖維；

s2：將0.5％的絲蛋白納米纖維在15000rpm、30min下分散成均一的納米纖維溶液；

s3：將所述納米纖維溶液中分別加入不同配比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)的水油混合溶劑，在15000rpm、30min的乳化作用下形成絲素蛋白乳狀液滴。

實施例4

s1：將絲蛋白脫膠，硝酸鈣水溶液溶解透析制備原溶液，再經過可控濃縮、稀釋和孵育的方法制得絲蛋白納米纖維；

s2：將3％的絲蛋白納米纖維在30000rpm、10min下分散成均一的納米纖維溶液；

s3：將所述納米纖維溶液中分別加入不同配比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)的水油混合溶劑，在30000rpm、60min的乳化作用下形成絲素蛋白乳狀液滴。

實施例5

s1：將絲蛋白脫膠，硝酸鈣水溶液溶解透析制備原溶液，再經過可控濃縮、稀釋和孵育的方法制得絲蛋白納米纖維；

s2：將3％的絲蛋白納米纖維在30000rpm、20min下分散成均一的納米纖維溶液；

s3：將所述納米纖維溶液中分別加入不同配比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)的水油混合溶劑，在20000rpm、60min的乳化作用下形成絲素蛋白乳狀液滴。

對比例1

s1：將0.2％的普通絲蛋白原溶液分別加入不同配比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)的水油混合溶劑，在2800rpm、10min的乳化作用下形成絲素蛋白乳狀液滴。

圖9為本發明對比例制備的不同水油比例的絲素蛋白乳狀液滴的宏觀圖；圖10為本發明對比例制備的不同水油比例的不同尺寸的絲素蛋白乳狀液滴的熒光顯微鏡圖；圖11為本發明對比例在水油比例1:9以及高濃度下形成的絲素蛋白彈性凝膠圖片。由圖9～圖11可知，采用普通絲素蛋白原溶液形成的乳液在水油比例為1：9下及高濃度下都不會形成乳液，而是為彈性凝膠；且尺寸不好調控，分散性及乳化性能不好；這是由于與絲蛋白納米纖維乳化機理不同，普通絲蛋白原溶液是在乳化的過程中進行自組裝，使乳滴間分散不好或者有粘連。

本申請利用采用上述實施例1～5的方法了制備尺寸可調、穩定性好、表面為介孔結構的絲素蛋白乳狀液滴，制備工藝簡單，且得到的產物為水包油型，強度高、生物相容性好。

本發明提出一種尺寸可調、穩定性好、表面為介孔結構的絲素蛋白乳狀液滴及其制備方法，絲素蛋白乳狀液滴的直徑在200nm～100μm之間，穩定性好，表面為介孔結構，乳化類型為水包油型。該絲素蛋白乳狀液滴的尺寸均一性較高，分散性好、不易聚集，且為高beta-sheet含量的穩定結構，有利于以此為藥物載體構建不同功能和釋放行為的載藥絲素蛋白顆粒，以及在化工、食品、化妝品、組織工程等領域有更廣泛的應用。在制備絲素蛋白乳狀液滴的過程中，通過對溶劑類型、絲素蛋白纖維質量、乳化速度、乳化時間及水油配比的調控，最終形成尺寸可調、穩定性好、表面為介孔結構的絲素蛋白乳狀液滴，同時，該種制備方法，工藝簡單，可批量生產，生物相容性好。

以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。

對所公開的實施例的上述說明，使本領域專業技術人員能夠實現或使用本發明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現。因此，本發明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。