專利名稱：一種cyp4a11多肽及抗人cyp4a11多肽抗體的制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種多肽及該多肽抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
CYP4A11是細胞色素P450 4A亞型之一，主要分布在肝臟和腎臟，其可以催化多種脂肪酸(月桂酸等)的代謝，調(diào)節(jié)體內(nèi)脂類代謝平衡。研究發(fā)現(xiàn)，CYP4A11催化內(nèi)源性花生四烯酸代謝生成20-羥基花生四烯酸(20-HETE)，而20-HETE與原發(fā)性高血壓形成有關(guān)。此外，另有研究表明CYP4A11還參與防御紫外線氧化損傷的機制。由于目前使用的基因重組人CYP4A11(#RDI-CYP4A11abrhttp//www.researchd.com/cyp450/cyp4alab.htm提供兔抗人CYP4A11抗體，以純化人肝臟CYP4A11蛋白為抗原，用于免疫印跡試驗。)價格昂貴，制備的抗體成本過高，而且安全度低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決目前使用的人CYP4A11價格昂貴，制備的抗體成本過高，而且安全度低的問題，而提供的一種CYP4A11多肽及抗人CYP4A11多肽抗體的制備方法。CYP4A11多肽的氨基酸序列為ArgLeuArgArgLeuProAsnProCysGluAspLysAspGlnLeu?？谷薈YP4A11多肽抗體按以下步驟制備(一)CYP4A11抗原表位的分析利用DNAStar軟件分析，確定CYP4A11蛋白505～519位15個氨基酸作為合成多肽氨基酸序列；(二)CYP4A11多肽的合成多肽自動合成儀合成，并純化；(三)CYP4A11多肽與載體蛋白交聯(lián)CYP4A11多肽與載體蛋白KLH采用戊二醛連接法，然后用pH值為8.5的硼酸緩沖液透析8～12h，交聯(lián)形成CYP4A11-KLH；(四)制備兔抗CYP4A11多肽抗體將乳化后的CYP4A11-KLH在兔背部皮下注射，并反復加強免疫，直至抗體效價等于、高于1∶10000；(五)收集、分離得到含有兔抗人CYP4A11多肽抗體的血清，采用辛酸-硫酸銨法純化CYP4A11多肽抗體，即得到抗人CYP4A11多肽抗體。本發(fā)明中的CYP4A11多肽具有優(yōu)異的親水性結(jié)構(gòu)(hydrophilicity)、柔性區(qū)(flexibility)、抗原指數(shù)(antigenicity)及表面概率結(jié)構(gòu)(surface probability)。本發(fā)明制備的抗人CYP4A11多肽抗體效價高，特異性好，可與天然人CYP4A11分子發(fā)生特異結(jié)合反應；本發(fā)明抗體制備成本低，只有用重組抗原制備抗體成本的十分之一，并且安全可靠性高于重組抗原制備的抗體；而且本發(fā)明制備的抗人CYP4A11多肽抗體能夠滿足免疫組化、免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗的要求，可用于建立體外免疫分析，為兔抗人CYP4A11分子的研究及相關(guān)疾病的研究提供一個有力工具，具有重要的理論意義和臨床價值。


圖1是DNAstar軟件分析人CYP4A11蛋白序列的數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖；圖2是抗血清相對親和力常數(shù)測定結(jié)果圖，圖中 曲線為濃度是10mg/L的CYP4A11-BSA的OD450值，圖中 曲線為濃度是5mg/L的CYP4A11-BSA的OD450值；圖3是抗體Western blot分析凝膠電泳圖，圖中“M”泳道標樣為Marker，圖中“1和6”泳道標樣為CYP4A11-BSA，圖中“2和5”泳道標樣為BSA，圖中“3和4”泳道標樣為人肝臟微粒體蛋白，“1、2和3”泳道蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后加純化后的抗CYP4A11抗體，“4、5和6”泳道蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后加純化后的抗CYP4A11抗體和CYP4A11多肽；圖4是正常人肝臟組織HE染色圖(×400)；圖5是抗人CYP4All多肽抗體與正常人肝細胞胞漿中的CYP4A11結(jié)合圖(×100)；圖6抗人CYP4A11多肽抗體與正常人肝細胞胞漿中的CYP4A11結(jié)合圖(×400)。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式CYP4A11多肽的氨基酸序列為ArgLeuArgArgLeuProAsnProCysGluAspLysAspGlnLeu。
具體實施方式
二本實施方式抗人CYP4A1l多肽抗體按以下步驟制備(一)CYP4A11抗原表位的分析利用DNAStar軟件分析，確定CYP4A11蛋白505～519位15個氨基酸作為合成多肽氨基酸序列；(二)CYP4A11多肽的合成多肽自動合成儀合成，并純化；(三)CYP4A11多肽與載體蛋白交聯(lián)CYP4A11多肽與載體蛋白KLH采用戊二醛連接法，然后用pH值為8.5的硼酸緩沖液透析8～12h，交聯(lián)形成CYP4A11-KLH；(四)制備兔抗CYP4A11多肽抗體將乳化后的CYP4A11-KLH在兔背部皮下注射，并反復加強免疫，直至抗體效價等于、高于1∶10000；(五)收集、分離得到含有兔抗人CYP4A11多肽抗體的血清，采用辛酸-硫酸銨法純化CYP4A11多肽抗體，即得到抗人CYP4A11多肽抗體。
本實施方式利用DNAStar軟件分析CYP4A11蛋白序列，蛋白序列分析結(jié)果如圖1所示，CYP4A11蛋白505～519位氨基酸(多肽)具有優(yōu)異的親水性結(jié)構(gòu)(hydrophilicity)、柔性區(qū)(flexibility)、抗原指數(shù)(antigenicity)及表面概率結(jié)構(gòu)(surface probability)。本實施方式抗體經(jīng)過純化后純度為96.9％，可作為抗原免疫動物，安全可靠性高。本實施方式中所使用的兔子為健康日本大耳白兔。本實施方式于耳中央動脈采血測定抗體的效價。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
二的不同點是步驟(二)中采用常規(guī)C18的RP-HPLC柱進行純化。其它步驟與實施方式二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
二的不同點是步驟(三)中CYP4A11多肽與載體蛋白KLH采用戊二醛連接法按重量份數(shù)比將4～6份經(jīng)過純化的CYP4A11多肽加入到6～8份載體蛋白KLH中，然后均勻、緩慢地加入0.5～1.5份濃度為3g/L的戊二醛溶液，室溫環(huán)境下作用2±0.5h。其它步驟與實施方式二相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四的不同點是步驟(三)中的戊二醛溶液配制后3h內(nèi)使用。其它步驟與實施方式四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
二的不同點是步驟(四)中取CYP4A11-KLH與等體積的完全福氏佐劑充分乳化后在兔背部皮下注射，注射點為4點，每點注射100μg，首次免疫注射后第2周進行第一次加強免疫注射，以后每隔兩周加強免疫注射一次，每次加強免疫注射劑量與首次免疫注射劑量相同；加強免疫注射CYP4A11-KLH用不完全福氏佐劑乳化；每次加強免疫注射7天后測定抗體效價。其它步驟與實施方式二相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
二的不同點是步驟(四)中反復加強免疫，直至抗體效價等于、高于1∶32000。其它步驟與實施方式二相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
二的不同點是步驟(五)中采用頸動脈取血收集含有兔抗人CYP4A11多肽抗體的兔血。其它步驟與實施方式二相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
二的不同點是步驟(五)中采用辛酸-硫酸銨法純化CYP4A11多肽抗體(1)將含有兔抗人CYP4A11多肽抗體的血清用濃度為60mmol/L、pH值為4.0的醋酸鈉緩沖液稀釋3～4倍，再用濃度為0.1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至4.5；(2)向步驟(1)的混合液中緩慢加入含量為98.5％的辛酸至混合液中辛酸濃度為25mL/L；(3)室溫條件下攪拌混合液30min，在4℃、10000g的條件下離心30min，再用濾孔直徑為0.22μm的濾膜過濾上清液；(4)向濾液中加入濾液1/10體積的10×PBS，并用濃度為0.1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，然后緩慢加入預冷的飽和硫酸銨至濾液中硫酸銨飽和度為45％；(5)加入硫酸銨的濾液在4℃環(huán)境下靜置8～12h，然后在4℃、3000g的條件下離心30min，棄去上清夜，沉淀用濃度0.01mol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液重懸，透析8～12h。其它步驟與實施方式二相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
九的不同點是步驟(五)(2)中辛酸為正辛酸。其它步驟與實施方式九相同。
具體實施方式
十一本實施方式抗人CYP4A11多肽抗體按以下步驟制備(一)CYP4A11抗原表位的分析利用DNAStar軟件分析，確定CYP4A11蛋白505～519位15個氨基酸作為合成多肽氨基酸序列；(二)CYP4A11多肽的合成多肽自動合成儀合成，并純化；(三)CYP4A11多肽與載體蛋白交聯(lián)CYP4A11多肽與載體蛋白KLH和載體蛋白BSA采用戊二醛連接法，將5mg經(jīng)過純化的CYP4A11多肽分別加入到7mg KLH和BSA中，然后均勻、緩慢地加入1mg濃度為3g/L的戊二醛溶液(配制后1h內(nèi)使用)，在室溫環(huán)境下作用2h，之后用pH值為8.5的硼酸緩沖液透析9～11h，交聯(lián)形成CYP4A11-KLH和CYP4A11-BSA，無菌分裝保存于-80℃的環(huán)境中；(四)制備兔抗CYP4A11多肽抗體將乳化后的CYP4A11-KLH在日本大耳白兔背部皮下注射，并反復加強免疫，直至抗體效價等于、高于1∶32000；(五)收集、分離得到含有兔抗人CYP4A11多肽抗體的血清，采用辛酸-硫酸銨法純化CYP4A11多肽抗體，即得到抗人CYP4A11多肽抗體；(六)人肝臟微粒體蛋白制備(1)取10g人正常肝臟(人正常肝臟來自于死亡時間未到24h的意外死亡者或肝臟未發(fā)生病變的死亡者)剪碎，用磷酸鉀鹽緩沖液反復沖洗除去血紅蛋白后加入100～150mL磷酸鉀鹽緩沖液制成肝勻漿，(2)將肝勻漿在4℃、10000g的條件下離心30min，之后取上清液在30000g的條件下離心60min，再在100000g的條件下離心60min，然后取粉紅色沉淀懸浮于磷酸鉀鹽緩沖液(含有200mL/L甘油，5g/L膽酸鈉，2mg/L抑肽酶，2mg/L亮肽素，1mg/L胃酶抑素及1mmol/L苯甲基磺酰氟)中，(3)用Bradford法進行蛋白定量、分裝后置于-80℃環(huán)境中保存。
本實施方式采用ELISA檢測抗血清效價ELISA檢測板用濃度為1mg/L的CYP4A11-BSA包被，每孔包被物100μL，在4℃條件下孵育8～12h，然后每孔加入200μL濃度為100mL/L的牛血清，在37℃的條件下封閉2h后洗滌，加入倍比稀釋2倍的含有兔抗人CYP4A11多肽抗體血清(對照組加入正常兔血清)，37℃條件下孵育30min，經(jīng)過3次洗滌后每孔加入5000倍稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG100μL，再在37℃條件下孵育15min，洗滌3次后進行TMB顯色，37℃條件下孵育15min后用酶標儀測定樣品在A450的吸光值，再用Multiskan Transmit軟件分析可得出抗體效價，本實施方式抗體效價為1∶32000。
本實施方式采用間接ELISA檢測抗血清相對親和常數(shù)ELISA檢測板分別用濃度為5mg/L和10mg/L的CYP4A11-BSA包被，并用濃度為100mL/L的牛血清封閉，然后加入已知蛋白濃度的純化多抗，再加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗后OPD顯色測定OD450值，顯色測定的OD450值如圖2所示，通過公式Kaff＝(n-1)/2(n[Ab’]t-2[Ab]t)(其中[Ab’]t、[Ab]t指的是分別包被5mg/L和10mg/L時抗體半飽和[OD50]時抗體的摩爾濃度，[Ag]t，[Ag’]t指的是包被的抗原濃度，n＝[Ag]t/Ag’]t，本實施方式中n＝2)計算，結(jié)果表明相對親和力常數(shù)在105～106M-1。
本實施方式進行抗體的Western blot分析，采用合成肽競爭法鑒定抗體的特異性，用2×SDS上樣緩沖液懸浮制備的人肝臟微粒體蛋白、CYP4A11-BSA及BSA，先95℃加熱5min，置于冰上冷卻10min，再上樣，上樣量分別為70μg、15μg、15μg，然后以標準蛋白Marker為中心兩側(cè)對稱同時上樣，經(jīng)SDS-PAGE分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；經(jīng)脫脂奶粉封閉(室溫1h)后將凝膠按泳道切割，取出備用，Marker泳道兩邊的凝膠上樣中分別加入1∶1000稀釋純化后抗體和1∶1000稀釋純化后抗體加等量合成肽(4℃過夜，以0.05％Tween-20TBS洗膜3次)，然后加入1∶10000 HRP-山羊抗小鼠IgG(室溫孵育1h，以0.05％Tween-20TBS洗膜3次)；之后所有凝膠用化學發(fā)光劑試劑盒(ECL Plus)處理5min后，于暗室曝光到X光膠片上，顯影、定影。本實施方式抗體Western blot分析凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，抗血清與人肝臟微粒體蛋白在Mr大約為53000處出現(xiàn)1條清晰的帶，與CYP4A11的分子量相符，由于是多克隆抗體，還出現(xiàn)一條非特異性結(jié)合條帶；抗血清與CYP4A11-BSA在Mr大約為69000處出現(xiàn)1條清晰的帶，與BSA分子量相符；抗血清與BSA則無條帶出現(xiàn)；說明所制備的抗體可識別含有半抗原的抗原表位的蛋白并能與天然CYP4A11蛋白結(jié)合。而在加入CYP4A11多肽的“4、5和6”泳道中相應條帶均明顯消失或變淺，這也進一步證實制備的抗體即為抗CYP4A11合成肽的抗體。
本實施方式進行抗體的免疫組化染色，取出用丙酮固定的冰凍人肝臟切片，滴加5％BSA，室溫下5％BSA封閉20min，加入1∶1000稀釋兔抗人CYP4A11多肽抗體，4℃孵育過夜，再用PBS洗片后加入羊抗兔IgG-HRP，37℃孵育20min，PBS洗片后進行DAB顯色，蘇木素復染，返藍后，脫水、透明、封片，鏡檢，放大100倍和400倍拍照記錄結(jié)果。免疫組化染色實驗圖片如圖4～6所示，圖4為正常人肝臟組織HE染色圖(×400)；圖5為抗人CYP4A11多肽抗體與正常人肝細胞胞漿中的CYP4A11結(jié)合圖(×100)，圖5中箭頭所指為肝臟血管內(nèi)皮，無著色；圖6為抗人CYP4A11多肽抗體與正常人肝細胞胞漿中的CYP4A11結(jié)合圖(×400)，圖6中箭頭所指為細胞胞漿中棕黃色顆粒。CYP4A11蛋白位于細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，免疫組化實驗胞漿明顯著色，而細胞核和無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的血管內(nèi)皮沒有著色，由此證明，抗人CYP4A11的抗體可以與正常肝臟組織中的CYP4A11蛋白結(jié)合。
序列表<110>哈爾濱醫(yī)科大學<120>一種CYP4A11多肽及抗人CYP4A11多肽抗體的制備方法<160>1<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CYP4A11多肽，用于制備抗人CYP4A11多肽抗體。
<400>1Arg Leu Arg Arg Leu Pro Asn Pro Cys Glu Asp Lys Asp Gln Leu1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種CYP4A11多肽，其特征在于CYP4A11多肽的氨基酸序列為ArgLeuArgArgLeuProAsnProCysGluAspLysAspGlnLeu。
2.抗人CYP4A11多肽抗體的制備方法，其特征在于抗人CYP4A11多肽抗體按以下步驟制備(一)CYP4A11抗原表位的分析利用DNAStar軟件分析，確定CYP4A11蛋白505～519位15個氨基酸作為合成多肽氨基酸序列；(二)CYP4A11多肽的合成多肽自動合成儀合成，并純化；(三)CYP4A11多肽與載體蛋白交聯(lián)CYP4A11多肽與載體蛋白KLH采用戊二醛連接法，然后用pH值為8.5的硼酸緩沖液透析8～12h，交聯(lián)形成CYP4A11-KLH；(四)制備兔抗CYP4A11多肽抗體將乳化后的CYP4A11-KLH在兔背部皮下注射，并反復加強免疫，直至抗體效價等于、高于1∶10000；(五)收集、分離得到含有兔抗人CYP4A11多肽抗體的血清，采用辛酸-硫酸銨法純化CYP4A11多肽抗體，即得到抗人CYP4A11多肽抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人CYP4A11多肽抗體的制備方法，其特征在于步驟(二)中采用常規(guī)C18的RP-HPLC柱進行純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人CYP4A11多肽抗體的制備方法，其特征在于步驟(三)中CYP4A11多肽與載體蛋白KLH采用戊二醛連接法按重量份數(shù)比將4～6份經(jīng)過純化的CYP4A11多肽加入到6～8份載體蛋白KLH中，然后均勻、緩慢地加入0.5～1.5份濃度為3g/L的戊二醛溶液，室溫環(huán)境下作用2±0.5h。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗人CYP4A11多肽抗體的制備方法，其特征在于步驟(三)中的戊二醛溶液配制后3h內(nèi)使用。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人CYP4A11多肽抗體的制備方法，其特征在于步驟(四)中取CYP4A11-KLH與等體積的完全福氏佐劑充分乳化后在兔背部皮下注射，注射點為4點，每點注射100μg，首次免疫注射后第2周進行第一次加強免疫注射，以后每隔兩周加強免疫注射一次，每次加強免疫注射劑量與首次免疫注射劑量相同；加強免疫注射CYP4A11-KLH用不完全福氏佐劑乳化；每次加強免疫注射7天后測定抗體效價。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人CYP4A11多肽抗體的制備方法，其特征在于步驟(四)中反復加強免疫，直至抗體效價等于、高于1∶32000。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人CYP4A11多肽抗體的制備方法，其特征在于步驟(五)中采用頸動脈取血收集含有兔抗人CYP4A11多肽抗體的兔血。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人CYP4A11多肽抗體的制備方法，其特征在于步驟(五)中采用辛酸-硫酸銨法純化CYP4A11多肽抗體(1)將含有兔抗人CYP4A11多肽抗體的血清用濃度為60mmol/L、pH值為4.0的醋酸鈉緩沖液稀釋3～4倍，再用濃度為0.1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至4.5；(2)向步驟(1)的混合液中緩慢加入含量為98.5％的辛酸至混合液中辛酸濃度為25mL/L；(3)室溫條件下攪拌混合液30min，在4℃、10000g的條件下離心30min，再用濾孔直徑為0.22μm的濾膜過濾上清液；(4)向濾液中加入濾液1/10體積的10×PBS，并用濃度為0.1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，然后緩慢加入預冷的飽和硫酸銨至濾液中硫酸銨飽和度為45％；(5)加入硫酸銨的濾液在4℃環(huán)境下靜置8～12h，然后在4℃、3000g的條件下離心30min，棄去上清夜，沉淀用濃度0.01mol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液重懸，透析8～12h。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗人CYP4A11多肽抗體的制備方法，其特征在于步驟(五)(2)中辛酸為正辛酸。
全文摘要
一種CYP4A11多肽及抗人CYP4A11多肽抗體的制備方法，它涉及一種多肽及該多肽抗體的制備方法。它解決了目前使用的人CYP4A11價格昂貴，而且抗體不能全部滿足用于免疫印跡、免疫組織化學實驗和酶聯(lián)免疫吸附實驗的問題。CYP4A11多肽的氨基酸序列為RLRRLPNPCEDKDQL?？谷薈YP4A11多肽抗體按以下步驟制備(一)CYP4A11抗原表位的分析；(二)CYP4A11多肽的合成；(三)CYP4A11多肽與載體蛋白交聯(lián)；(四)制備兔抗CYP4A11多肽抗體；(五)收集、分離得到含有抗體的血清，純化抗體，即得到抗人CYP4A11多肽抗體。本發(fā)明制備的抗人CYP4A11多肽抗體效價高，可與天然人CYP4A11分子發(fā)生特異結(jié)合反應；本發(fā)明抗體制備成本低；而且本發(fā)明制備的抗體能夠滿足免疫組化、免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗的要求。
文檔編號C07K16/18GK1916019SQ20061001048
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月4日
發(fā)明者朱大嶺, 唐曉波, 楊微, 劉海英, 武正華, 吳紅 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學