專利名稱：：環烯酮類化合物及其在制備抗腫瘤藥中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及環烯酮類化合物領域，具體涉及一類具有抗腫瘤活性的環烯酮類化合物及其制備方法與應用。
背景技術：
：惡性腫瘤是嚴重危害人類生命的疾病，其死亡率僅次于心腦血管疾病，且發生率有逐年上升的趨勢。其中，肺癌是發病率和死亡率最高的腫瘤(Miller2005)。在女性腫瘤中，乳腺癌發病率和死亡率均居第一位。研究開發具有抗腫瘤活性的藥物具有重要的意義。海洋是一個高鹽、寡營養，甚至低溫、高壓的環境，為了適應特殊的環境，海洋微生物以其獨特的代謝途徑，能夠產生結構新穎的活性代謝產物(Zhang，Anetal.2005;Saleem,Alietal.2007)。海洋微生物種類繁多，為尋找新的抗癌物質提供了更多的可能。海洋真菌作為海洋微生物的重要組成部分，其天然產物的研究始于20世紀90年代，1998年進入鼎盛時期，至2002年從海洋真菌中分離出來的新化合物有272個(BugniandIreland2004)，其中不乏具有抗腫瘤活性的物質。聚酮類化合物中有許多是重要的藥用天然產物，例如紅霉素、制霉菌素、阿維菌素、雷帕霉素、柔毛霉素等(Saleem,Alieta1.2007)。但是，關于環烯戊酮類活性物質的報道并不多。土曲霉酮(二羥基丙烯基環烯戊酮)發現于1935年，近年來的研究表明，它具有抑制細菌、抑制黑色素的生物合成、抑制表皮增殖等活性(Malmstrom,Christophersenetal.2002;Park,Kimetal.2004;Kim,Choetal.2007)。另外，美國國家癌癥研究所(NCI)的數據表明，土曲霉酮具有中等抑癌活性，GI50為10—4M。2002年，土曲霉酮及其衍生物也在海洋真菌五mm'ce〃aiw7'eco/or中被發現。從海洋真菌//(3//(^0"6^7'o^ac/a/禾口7>^/0^/-附"Aflrz/a"ww中發5見的環烯戊酮類物質trichodenones具有抑制淋巴癌細胞P388的活性，ED50為0.211.45ug/ml(BugniandIreland2004)。本發明中所涉及的環烯戊酮類化合物為新結構化合物，并對腫瘤細胞的殺傷具有較好的選擇性，其在抗腫瘤方面的應用為首次報道。
發明內容本發明的目的在于提供一種來源于海洋真菌的具有抗腫瘤活性的環烯酮類化合物。本發明的另一個目的是提供上述環烯酮類化合物的制備方法。本發明的進一步目的是提供上述環烯酮類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發明從海洋真菌7Wc/odermflsp.GIBH-Mf082(以下簡稱真菌GIBH-MfD82)的發酵培養物中提取分離得到一種淺黃色的環烯酮類化合物(GIBH022)，其化學名稱為3-Ethyl隱4R,5S-dihydroxy-cyclopent-2-enone(3—乙基一4R,5S—二羥基一2—環烯戊酮)，其結構式如(I):本發明所用的真菌GIBH-MfD82已保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國武漢大學校內)，保藏號為CCTCCNO:CCTCCM208080，保藏日期為2008年5月29日。本發明的環烯酮類化合物GIBH022可從真菌GIBH-Mf082的發酵培養液中提取分離得到，制備方法具體如下(1)真菌7WcAWemasp.GIBH-MfD82CCTCCNO:CCTCCM208080的種子培養配制種子培養基IOO毫升。種子培養基MHB液體培養基，購于廣東省環凱生物科技公司，按說明書進行配制，12rc高壓滅菌20分鐘。取一80。C保藏菌種，于37"水浴鍋迅速溶解后，吸取O.l毫升菌液于種子培養基，置于搖床上，轉速為100rpm，27'C培養3天。(2)真菌7Wc/wc/ermasp.GIBH-MfD82的CCTCCNO:CCTCCM208080的發酵培養發酵培養基成分取大米20克、酵母浸膏O.l克、葡萄糖0.1克、水30毫升于250毫升三角瓶，12rC高壓滅菌20分鐘。取種子培養液1毫升于發酵培養基，27'C靜置培養10天。共發酵10升，目卩333瓶。(3)將固體發酵物用IO升95%乙醇萃取3次，濃縮此乙醇萃取液至膠狀，加入2升蒸餾水，用1/3體積的石油醚分別萃取3次后，再用1/3體積的三氯甲垸萃取3次，濃縮三氯甲垸萃取液，濃縮物(3.4g)在硅膠柱中進行色譜分離，以三氯甲烷-甲醇為洗脫劑，按100:0—0:100的比例進行梯度洗脫。(4)分別收集比例為100:0，98:2,95:5，90:10，80:20，0:100的三氯甲烷-甲醇洗脫液，共6個部位，其中95:5部位再以反相硅膠柱進行分離，以60%的甲醇水溶液為洗脫劑，得到黃色油狀物GIBH022。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明經實驗證明，環烯酮類化合物GIBH022能抑制腫瘤細胞株的生長，能用于開發抗腫瘤藥物，應用前景廣闊。具體實施例方式實施例l化合物GIBH022的制備(1)真菌7V/cWe薩sp.GIBH-M鍵CCTCCNO:CCTCCM208080的種子培養配制種子培養基IOO毫升。種子培養基MHB液體培養基，購于廣東省環凱生物科技公司，按說明書進行配制，12rc高壓滅菌20分鐘。取一8(TC保藏菌種，于37"C水浴鍋迅速溶解后，吸取O.l毫升菌液于種子培養基，置于搖床上，轉速為100rpm，27。C培養3天。(2)真菌7Wc/ot/emwsp.GIBH-MfD82CCTCCNO:CCTCCM208080的發酵培養發酵培養基成分取大米20克、酵母浸膏O.l克、葡萄糖0.1克、水30毫升于250毫升三角瓶，121。C高壓滅菌20分鐘。取種子培養液1毫升于發酵培養基，27'C靜置培養10天。共發酵10升，即333瓶。(3)將固體發酵物用IO升95%乙醇萃取3次，濃縮此乙醇萃取液至膠狀，加入2升蒸餾水，用1/3體積的石油醚分別萃取3次后，再用1/3體積的三氯甲烷萃取3次，濃縮三氯甲烷萃取液，濃縮物在硅膠柱中進行色譜分離，以三氯甲烷-甲醇為洗脫劑，按100:0—0:100的比例進行梯度洗脫。(4)分別收集比例為100:0，98:2,95:5,90:10,80:20,0:100的三氯甲烷-甲醇洗脫液，共6個部位，其中95:5部位再以反相硅膠柱進行分離，以60%的甲醇水溶液為洗脫劑，得到黃色油狀物GIBH022。GIBH022的試驗數據ES-MS:143(M+1).[a]20D=隱4.838。(CH3C1).1HNMR(400Mz,CDC13,TMS):5.99(brs,H-2)，4.66(brs,H-4),4.23(brs,H-5)，2.42(m，H-6a),2.63(m,H-6b),L2(t,7.2Hz,CH3-7).13CNMR(CDC13,TMS):202.8(C-l)，125.6(C-2),180.1(C-3),77.7(C-4)，81.8(C陽5)，23.0(C-6),10.9(C陽7).實施例2MTT還原法檢測化合物GIBH022的抗腫瘤活性實驗1、材料(1)細胞培養基(1640完全培養基)RPMI1640培養基(HyClone)、10%小牛血清(HyClone)、100IU/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素。(2)細胞株人肺癌細胞系A549、NCI-H460，人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-435s，人宮頸癌細胞系Hela，人前列腺癌細胞系DU-145，正常的人胚肺細胞系HLF，上述細胞均購自美國典型培養物中心ATCC。G)其他0.25n/。胰蛋白酶一EDTA消化液(北京索萊寶科技有限公司)；MTT(四脞鹽)溶液用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解MTT(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3，5-diphenytetrazoliumromide)，濃度2.5mg/ml，過濾除菌，分裝后4'C避光保存。2、方法(1)細胞貼壁取對數生長期的HLF、A549、NCI-H460、MCF-7、MDA-MB-435s、Hela、DU-145細胞，胰蛋白酶消化后，用1640完全培養基稀釋至2Xl()Scell/ml;以100ul/we11接種至96孔細胞培養板，至于細胞培養箱，37°C(5%C02)培養24小時。(2)待測化合物的配制用DMSO(二甲基亞砜)溶解化合物GIBH022，濃度為10ug/ul;用1640培養基完全培養基稀釋至0.1ug/ul;用1640完全培養基以l:3進行梯度稀釋。(3)去除培養液，以100ul/we11加入配好的待測化合物，每個濃度設三個復孔；對照組，以100ul/we11加入1640完全培養基；至于細胞培養箱，37°C(5%C02)培養48小時。(4)MTT檢測以10ul/wdl將MTT溶液加至上述細胞，37°C(5%CO2)培養4小時，去除培養液；每孔加入100ulDMSO，充分振蕩3—5min，溶解；采用酶聯免疫檢測儀(Bio-TekSynergyHT)檢測每孔的吸光度(OD值)，設定波長570nm、參比波長630nm。(5)計算抑制率腫瘤細胞抑制率％=[(對照組OD570值一加藥組OD570值)/對照組OD570值]X100X(6)計算IC50:以抑制率對藥物濃度的對數作圖(Sigmaplot)，求得IC50值。3、結果試驗結果顯示化合物GIBH022對人肺癌細胞系A549和NCI-H460、人乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-435s、人宮頸癌細胞系Hela、人前列腺癌細胞系DU-145均有抑制，但是在濃度為7.02mM時對正常的人胚肺細胞HLF仍無抑制，化合物GIBH022對腫瘤細胞的細胞毒有較好的選擇性(選擇指數〉100)。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權利要求1、環烯酮類化合物GIBH022，其化學名稱為3-Ethyl-4R，5S-dihydroxy-cyclopent-2-enone(3-乙基-4R，5S-二羥基-2-環烯戊酮)，其結構式如(I)2、權利要求l所述化合物的制備方法a.真菌GIBH-MfD82的種子培養配制種子培養基100毫升；取一8(TC保藏菌種，于37。C水浴鍋迅速溶解后，吸取0.1毫升菌液于種子培養基，置于搖床上，轉速為100rpm，27。C培養3天；b.真菌GIBH-MfD82的發酵培養發酵培養基成分取大米20克、酵母浸膏0.1克、葡萄糖0.1克、水30毫升于250毫升三角瓶，12rC高壓滅菌20分鐘；取種子培養液l毫升于發酵培養基，27'C靜置培養10天;共發酵10升，即333瓶;c.將固體發酵物用10升95y。乙醇萃取3次，濃縮此乙醇萃取液至膠狀，加入2升蒸餾水，用l/3體積的石油醚分別萃取3次后，再用l/3體積的三氯甲烷萃取3次，濃縮三氯甲烷萃取液，濃縮物在硅膠柱中進行色譜分離，以三氯甲垸-甲醇為洗脫劑，按100:0—0:100的比例進行梯度洗脫；d.分別收集比例為lOO:O,98:2,95:5，90:10,80:20，0:100的三氯甲烷-甲醇洗脫液，共6個部位，其中95:5部位再以反相硅膠柱進行分離，以60%的甲醇水溶液為洗脫劑，得到黃色油狀物GIBH022。3、環烯酮類化合物及其在制備抗腫瘤藥中的應用。全文摘要本發明涉及一類具有抗腫瘤活性的環烯酮類化合物及其制備方法與應用。該化合物(GIBH022)的化學名稱為3-Ethyl-4R，5S-dihydroxy-cyclopent-2-enone(3-乙基-4R，5S-二羥基-2-環烯戊酮)，其結構式如(I)。環烯酮類化合物GIBH022能抑制腫瘤細胞株的生長，能用于開發抗腫瘤藥物，應用前景廣闊。文檔編號C07C49/00GK101613264SQ20081002910公開日2009年12月30日申請日期2008年6月27日優先權日2008年6月27日發明者劉廣杰,張立新,游劍嵐,陳小平,陳志輝申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院