專利名稱：治療性核糖核酸酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及核糖核酸酶(RNA酶)在疾病的治療或預防中的應用。
背景技術：
在美國人口中，估計僅與15種最常見癌癥類型相關的死亡率每年就為每100，000 人中有接近 170 人死亡(Martin L Brown, Joseph Lipscomb 禾口 Claire Snyder, 2001, THE BURDEN OF ILLNESS OF CANCER =Economic Cost and Quality of Life, Ann. Rev.Public Health, 22 :91-113)。目前，估計每年有1，437，180例新發癌癥和565，650例死亡(American Cancer Society Cancer Facts and Figures 2008)。癌癥的經濟負擔在 1990 年估計超過 $960 億美元(Brown 等人，2001)。術語“化學療法”僅指以化學物質治療疾病。化學療法之父Paul Ehrlich將完美的化學治療劑設想為“魔術子彈”；這種化合物將殺死侵入的生物體或細胞而不傷害宿主。 雖然在確認殺死或抑制癌細胞的化合物方面和確認將這種化合物指向所指定的靶標細胞的方法方面已經取得了顯著進展，但本領域中還需要改善的治療性化合物。有多種不同類型的化學治療劑可以使用，包括小分子和生物制劑，如核酸化合物、 多肽化合物或其衍生物。通常，需要考慮的化學治療劑的性質包括效能、藥代動力學性質和制造的容易性。作為對小分子的替代性方案，蛋白治療劑通常可提供特殊優點；不過，有效的蛋白藥物必須具有包括以下的最佳性質的平衡特異性、細胞毒性、對其靶標的親和性、 安全性、溶解性、有效遞送的順從性、穩定性和體內壽命(清除時間)。這些性質中任何一種性質優異的候選藥物可能不具有作為有效藥物的全部特征的最佳平衡。本領域中需要具有用于治療情況的有效補充特征的另外的抗癌化學治療劑。

發明內容
本發明涉及RNA酶在疾病的治療或預防中的應用。在一些實施方式中，RNA酶用于治療或預防人類疾病，如癌癥。在一些實施方式中，重組人RNA酶1的變體具有用于治療或預防人癌癥的所期望性質的最佳平衡。這些性質包括但不限于穩定性、對病原細胞的細胞毒性、降解包括病毒RNA在內的任何來源的病原RNA的效能、逃避被RNA酶抑制劑結合、 對蛋白酶降解的抵抗性、向靶標細胞的遞送、向細胞中輸入的效率、劑量響應性、藥代動力學性質和在人體內的壽命。在一些實施方式中，本發明的治療性組合物和方法利用了人RNA 酶1的變體，所述變體與野生型酶相比具有如下氨基酸變化R4C、G38R、R39G、N67R、G89R、 S90R和V118C。在一些實施方式中，核糖核酸酶包含SEQ ID NO :1或由SEQ ID N0:1組成， 所述 SEQ ID NO :1 為
KESCAKKFQRQHMDSDSSPSSSSTYCNQMMRRRNMTQRGCKPVNTFVHEPLVDVQNVCFQEKVTCKRGQGNCYKSNSSMHITDCRLTNRRRYPNCAYRTSPKERHII
VACEGSPYVPCHFDASVEDST.在一些實施方式中，所述氨基酸序列包含具有N-末端甲硫氨酸的SEQ ID NO KSEQ ID NO 4)或由具有N-末端甲硫氨酸的SEQ ID NO :1(SEQ ID NO 4)組成，所述具有 N-末端甲硫氨酸的SEQ ID NO :1(SEQ ID NO 4)為MKESCAKKFQRQHMDSDSSPSSSSTYCNQMMRRRNMTQRGCKPVNTFVHEPLVDVQNVCFQEKVTCKRGQGNCYKSNSSMHITDCRLTNRRRYPNCAYRTSPKERHIIVACEGSPYVPCHFDASVEDST.在一些實施方式中，核糖核酸酶重組生成。在一些實施方式中，核糖核酸酶由包含 SEQ ID NO 2的核酸分子編碼，所述SEQ ID NO :2為AAA GAA TCT TGC GCT AAA AAA TTC CAG CGT CAG CAC ATG GAC TCT GACTCT TCT CCG TCT TCT TCT TCT ACT TAC TGC AAC CAG ATG ATG CGT CGCCGT AAC ATG ACT CAG CGT GGT TGC AAA CCG GTT AAC ACT TTC GTT CATGAA CCG CTG GTT GAC GTT CAG AAC GTT TGC TTC CAG GAA AAA GTT ACTTGC AAA CGC GGT CAG GGT AACTGC TAC AAA TCT AAC TCT TCT ATG CATATC ACT GAC TGC CGT CTG ACG AAT CGT CGC CGT TAC CCG AAC TGC GCTTAC CGT ACT TCT CCG AAA GAA CGT CAT ATC ATC GTT GCT TGC GAA GGTTCT CCG TAC GTT CCG TGT CAT TTC GAC GCT TCT GTT GAA GAC TCT ACC在一些實施方式中，編碼核糖核酸酶的表達載體還包含前導序列，例如SEQ ID NO 3 TT GNT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CATATG在一些實施方式中，編碼核糖核酸酶的表達載體還包含一個或多個終止密碼子 (例如，TAA和/或TGA)。在一些實施方式中，RNA酶與作為提供改善的物理性質的要素的水溶性部分綴合。 在一些實施方式中，水溶性部分是聚乙二醇(PEG)分子。在一些實施方式中，RNA酶與將RNA 酶靶向特殊細胞類型(如病態細胞或癌細胞)的部分綴合或融合或締合。因此，在一些實施方式中，本發明提供了包含核糖核酸酶(例如，純化的核糖核酸酶)的組合物(例如，治療性制備物)，所述核糖核酸酶具有帶有如下氨基酸修飾的人RNA 酶 1 序列(例如,包含 SEQ ID NO :1 或由 SEQ ID N0:1 組成):R4C、G38R、R39G、N67R、G89R、 S90R和V118C。在一些實施方式中，本發明提供了包含編碼所述核糖核酸酶的核酸序列(例如，包含SEQ ID NO 2)的表達載體。在一些實施方式中，本發明提供了包含所述表達載體的宿主細胞。在一些實施方式中，本發明還提供了通過將核糖核酸酶單獨施用或與其它試劑組合施用于受試者(例如，患有癌癥或疑似患有癌癥的人受試者)而治療所述受試者的方法。施用可以以治療有效劑量在一個或多個時點進行(例如，以每周0.01 100mg/kg 受試者體重施用一周或多周；以每天0.01 100mg/kg受試者體重施用一天或多天；或者以每次治療0. 01 100mg/kg受試者體重施用一次或多次治療)。如本文所用，術語“核糖核酸酶的變體”是指經修飾的核糖核酸酶，其保留了與其所衍生自的未-經修飾的核糖核酸酶相似的酶活性(例如，保留了至少60%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%的活性)。測定酶活性的試驗在本文中進行了描述并且是本領域已知的。所述變體可以是天然酶的變體或者可以是非-天然酶的變體。例如，可以將具有SEQ ID NO :1的特定非-天然合成核糖核酸酶修飾為包含可導致SEQ ID N0:1的變體的一個或多個氨基酸變化。在一些優選實施方式中，該變體與未-經修飾的核糖核酸酶相比具有一個或有限數量的氨基酸取代(例如，保守或非-保守取代)、添加或缺失(例如，截短)。如本文所用，術語“保留RNA降解活性的核糖核酸酶變體”是指具有其所衍生自的未-經修飾的核糖核酸酶的至少50%、至少60%、至少75%、至少85%、至少95%或至少 99%的RNA降解活性的核糖核酸酶變體(例如，SEQ ID NO :1)。RNA降解活性可以利用任何適當的測試法進行測定，所述測試法包括但不限于利用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳對經降解的RNA樣品進行可視化和定量。在一些優選實施方式中，所述變體與未-經修飾的核糖核酸酶相比具有一個或有限數量的氨基酸取代(例如，保守或非-保守取代)、添加或缺失(例如，截短)。如本文所用，術語“具有基本相同的細胞殺死活性、細胞毒活性、細胞抑制活性或細胞損傷活性的核糖核酸酶變體”是指具有其所衍生自的未-經修飾的核糖核酸酶的至少 50 %、至少60 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %或至少99 %的細胞殺死活性、細胞毒活性、 細胞抑制活性或細胞損傷活性的核糖核酸酶變體(例如，SEQ ID NO :1)。例如，在一些實施方式中，所述活性是殺死或影響癌細胞的能力。在另一些實施方式中，所述活性是減小動物的腫瘤尺寸的能力。在又一些實施方式中，所述活性是減少以異常細胞生長為特征的疾病(例如，癌癥)的癥狀的能力。可以使用任何適當的方法測定活性，所述方法包括但不限于商售細胞成活性測試法、腫瘤尺寸的測定和商售細胞增殖測試法。在一些優選實施方式中，與野生型酶相比所述變體具有一個或有限數量的氨基酸取代(例如，保守或非-保守取代)、添加或缺失(例如，截短)。如本文所用，術語“保留蛋白質折疊性質的核糖核酸酶變體”是指顯示了與其所衍生自的未-經修飾的核糖核酸酶相似的蛋白質折疊性質的核糖核酸酶變體(例如，SEQ ID NO :1)。蛋白質折疊性質包括蛋白質折疊速度和正確結構的折疊(基本保留其所衍生自的未-經修飾的核糖核酸酶的活性的折疊)。在優選的實施方式中，變體以其所衍生自的未-經修飾的核糖核酸酶的速度的至少50 %、至少60 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %或至少99%或更多的速度折疊。蛋白折疊的測試是本領域公知的，包括但不限于光譜測試和酶學(例如RNA降解)測試以及HPLC。在一些優選實施方式中，與野生型酶相比，所述變體具有一個或有限數量的氨基酸取代(例如，保守或非-保守取代)、添加或缺失(例如，截短)。如本文所用，術語“具有相似免疫原性的核糖核酸酶變體”是指這樣的核糖核酸酶變體(例如，SEQ ID NO 1)在一些實施方式中，其展示出與其所衍生自的未-經修飾的核糖核酸酶基本相同或更好的免疫原性。免疫原性包括毒性和動物體內不利的免疫應答(例如，細胞毒性免疫應答)。在優選實施方式中，變體展示出小于100%、優選小于90%、更優選小于80 %、進而更優選小于70 %的其所衍生自的未-經修飾的核糖核酸酶的毒性或不利的免疫應答。可以使用任何適當方法確定毒性或免疫原性的水平，所述方法包括但不限于毒性和免疫應答的商售測試法(例如，細胞因子或T-細胞響應的測定)。在一些優選實施方式中，與野生型酶相比，所述變體具有一個或有限數量的氨基酸取代(例如，保守或非-保守取代)、添加或缺失(例如，截短)。術語“異源核酸序列”或“異源基因”可互換使用，指和天然狀態中不與其連接、或天然狀態中與其在不同位置連接的核酸序列相連接的核苷酸序列。異源DNA對其所引入的細胞不是內源的，而是從另一細胞中獲得。通常，但非必須的是，所述異源DNA編碼RNA和蛋白，而所述RNA和蛋白通常不由表達其的細胞產生。異源DNA的實例包括報告基因、轉錄和翻譯調控序列、可選擇的標記物蛋白(例如，賦予抗藥性或治療益處的蛋白)等。如本文所用，術語“免疫球蛋白，，或“抗體”是指結合特異性抗原的蛋白。免疫球蛋白包括但不限于，多克隆、單克隆、嵌合和人源化抗體、Fab片段、F(ab' )2片段，并且包括以下類別的免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD、IgE和分泌型免疫球蛋白(slg)。免疫球蛋白通常包含2個相同的重鏈和2個輕鏈。不過，術語“抗體”和“免疫球蛋白”還包括單鏈抗體和雙鏈抗體。如本文所用，術語“抗原結合蛋白，，是指結合特異性抗原的蛋白。“抗原結合蛋白，， 包括但不限于包括多克隆、單克隆、嵌合和人源化抗體的免疫球蛋白；Fab片段、F(ab' )2 片段和Fab表達文庫；和單鏈抗體。術語“表位”在本文用于指抗原的與特定免疫球蛋白接觸的部分。當使用蛋白或蛋白片段免疫宿主動物時，所述蛋白的多個區域可以引起抗體生成，所述抗體特異性結合給定區域或蛋白的三維結構；這些區域或結構稱為“抗原決定簇”。 抗原決定簇可以與完整抗原(即，用于引發免疫應答的“免疫原”)競爭結合抗體。述及抗體和蛋白或肽的相互作用而使用的術語“特異結合”或“特異性結合”表示該相互作用取決于蛋白上存在的特定結構(即，抗原決定簇或表位)；即，抗體所識別和結合的是特異蛋白結構，而不是一般性蛋白。例如，如果抗體對表位“A”是特異性的，在含有標記的“A”和抗體的反應中存在含有表位A(或游離的非標記的A)的蛋白將減少與抗體結合的標記的A的量。如本文所用，述及抗體和蛋白或肽的相互作用而使用的術語“非-特異結合”和 “背景結合”是指不依賴于特定結構存在的相互作用(即，抗體與一般性蛋白結合，而不是與如表位等特定結構結合)。如本文所用，術語“受試者”是指任何動物(例如哺乳動物)，所述動物包括但不限于人、非-人靈長類動物和嚙齒類動物等，其是特定治療的接受者。通常，術語“受試者”和 “患者”在本文中述及人受試者時可互換使用。如本文所用，術語“疑似患有癌癥的受試者”是指存在一種或多種指示癌癥的癥狀 (例如，明顯的腫塊或包塊)或進行癌癥篩查(例如，在常規體檢過程中)的受試者。疑似患有癌癥的受試者還可以具有一種或多種風險因素。疑似患有癌癥的受試者一般未接受過癌癥檢測。然而，“疑似患有癌癥的受試者”包括已接受初步診斷(例如，顯示包塊的CT掃描)但未進行確診檢測(例如，活組織檢查和/或組織學檢查)或癌癥階段未知的個體。該術語還包括曾經患癌的受試者(例如，復原中的個體)。“疑似患有癌癥的受試者”有時診斷患有癌癥，有時發現不患有癌癥。如本文所用，術語“診斷患有癌癥的受試者”是指已進行檢測并發現具有癌細胞的受試者。可以利用任何適當方法診斷癌癥，所述方法包括但不限于，活組織檢查、χ-射線、血液檢測和本發明的診斷方法。“初步診斷”是僅基于視覺(例如，CT掃描或存在腫塊)和抗原檢測的診斷。如本文所用，術語“有癌癥風險的受試者”是指具有一種或多種患特定癌癥的風險因素的受試者。風險因素包括但不限于性別、年齡、遺傳傾向、環境接觸和此前的癌癥事件、 已存在的非-癌癥疾病和生活方式。如本文所用，術語“非-人動物”是指所有非-人動物，包括但不限于脊椎動物，例如嚙齒類動物、非-人靈長類動物、綿羊、牛、反芻動物、兔、豬、公山羊、馬、犬、貓、鳥等。“氨基酸序列”和如“多肽”或“蛋白”等術語不意圖將氨基酸序列限制為與所述蛋白分子相關的完整天然的氨基酸序列。術語“測試化合物”和“候選化合物”是指作為用于治療或預防疾病、病患、不適或身體功能紊亂(例如，癌癥)的候選物的任何化學或生物學實體、藥物和藥劑等。測試化合物包括已知的和潛在的治療化合物。利用本發明的篩選方法通過篩選，可將測試化合物確定為治療劑。如本文所用，術語“樣品，，取其最廣泛的含義。在一個含義中，其表示包括從任何來源獲得的樣本或培養物，以及生物和環境樣品。生物樣品可以獲得自動物(包括人)并包括液體、固體、組織和氣體。生物樣品包括血液品，例如血漿、血清等。環境樣品包括環境材料，如表面物、土壤、水和工業樣品。不過，這些實例不應被理解為對適用于本發明的樣品種類的限制。術語“基因”是指包含產生多肽或前體(例如，本發明的核糖核酸酶或核糖核酸酶的綴合物)所必需的編碼序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可以由全長編碼序列或所述編碼序列的任何部分編碼，只要保留了全長或片段的所需活性或功能性質(例如，酶活性等) 即可。該術語還包含結構基因的編碼區，并且包括在5'和3'端以距任一端約11Λ距離的鄰近編碼區的序列，因此該基因對應于全長mRNA的長度。位于編碼區5'并存在于mRNA中的序列稱為5'非翻譯序列。位于編碼區3'或下游并存在于mRNA中的序列稱為3'非翻譯序列。術語“基因”包含cDNA和基因的基因組形式。基因的基因組形式或克隆含有由稱為“內含子”或“間插區”或“間插序列”的非-編碼序列中斷的編碼區。內含子是基因的轉錄為核RNA(hnRNA)的區段；內含子可以含有調控元件，例如增強子。內含子從核或初級轉錄體中去除或“剪接掉”；因此內含子不存在于信使RNA(mRNA)轉錄體中。翻譯過程中mRNA 擔當指導新生多肽中氨基酸序列或順序的功能。術語“片段”在本文中用于指與天然蛋白相比具有氨基-末端和/或羧基-末端缺失、但剩余氨基酸序列與由全長cDNA序列推導出的氨基酸序列相應位置相同的多肽。片段長度通常至少4個氨基酸、優選至少20個氨基酸、通常為至少50個氨基酸或更長，并且覆蓋了該成分與其各種配體和/或底物分子間結合所需的多肽部分。在一些實施方式中， 片段具有天然蛋白的活性。如本文所用，術語“純化的”或“純化”是指去除樣品中的雜質和污染物。例如，通過去除非-免疫球蛋白的蛋白而純化抗體；還可以通過去除不結合指定靶標分子的免疫球蛋白而純化抗體。非-免疫球蛋白的蛋白的去除和/或不結合指定靶標分子的免疫球蛋白的去除使得樣品中靶標反應性免疫球蛋白的百分比增加。在另一實例中，重組多肽在宿主細胞中表達，并通過去除宿主細胞蛋白而純化所述多肽；因此樣品中重組多肽的百分比增加。術語“表達載體”在本文中用于指含有所需編碼序列和適當核酸序列的重組DNA 分子，所述適當核酸序列是在特定宿主生物體中表達所操縱性連接的編碼序列所必需的。 在原核生物中表達所必需的核酸序列通常包括啟動子、操縱子(可選)和核糖體結合位點， 通常還有其他序列。已知真核細胞可利用啟動子、增強子以及終止和多聚腺苷酸化信號。如本文所用，術語“宿主細胞”是指任何真核或原核細胞(例如，細菌細胞如大腸桿菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、兩棲動物細胞、植物細胞、魚類細胞和昆蟲細胞)，而無論這些細胞位于體外還是體內均可。例如，宿主細胞可以位于轉基因動物中。
具體實施例方式本發明提供了核糖核酸酶組合物和方法。發現所述核糖核酸酶可用作藥劑和研究試劑(例如，用于研究或表征細胞、組織或生物體中的生物過程)。例如，在一些實施方式中，提供了包含SEQ ID NO :1的核糖核酸酶。SEQ ID NO :1是具有下述氨基酸修飾的天然人 RNA 酶 1 :R4C、G38R、R39G、N67R、G89R、S90R 和 Vl 18C (X#Y，其中 X 是天然氨基酸，# 是基于人RNA酶1的所認識的編號體系的氨基酸位置，Y是替代X的經修飾的氨基酸)。本發明還提供了 SEQ ID NO 1的變體，所述變體保持了 4C、38R、39G、67R、90R和118C序列，但包括一個或多個額外的氨基酸改變。下面將更詳細描述各種變體。根據產生有效治療分子的多種性質的平衡來確認本發明的核糖核酸酶。所考慮的性質包括穩定性、對病原細胞的細胞毒性、降解包括病毒RNA在內的任何來源的病原RNA 的效能、逃避被RNA酶抑制劑結合、對蛋白酶降解的抵抗性、向靶標細胞的遞送、向細胞中輸入的效率、劑量響應性、藥代動力學性質和在人體內的壽命。例如，SEQ ID N0:1的核糖核酸酶提供了有用的治療分子，所述治療分子具有的性質平衡使其優于此前描述的治療性核糖核酸酶，如美國專利公報序列號20050261232(通過引用將其整體并入本文)描述的 QBI-IlQ0在選擇最佳化合物時可能被認為重要的某些特征(例如，酶活性、逃避核糖核酸酶抑制劑等)方面，SEQ ID NO 1的核糖核酸酶劣于QBI-119和天然人RNA酶1，不過卻提供了整體優異的治療劑。例如，SEQ ID NO :1只具有天然人RNA酶1的核糖核酸酶活性的一部分(小于)，不過具有治療有效性。發現本發明的核糖核酸酶可用于治療多種疾病狀態，包括多種癌癥類型。例如，對 SEQ ID NO 1測試了抗非-小細胞肺癌細胞(A549細胞系)、胰腺癌細胞(BxPC3細胞系) 和前列腺癌細胞(DU145細胞系)的性質，并發現以15mg/kg-100mg/kg的劑量范圍，每天或每周給藥1 5次，抑制超過65% (并且高達94%)的腫瘤生長。在抑制百分比(等于或好于QBI-119)和其可高度有效的癌細胞類型多樣性方面，SEQ ID NO :1均優于QBI-119。可以將本發明的核糖核酸酶配制為含有或不含有其他治療劑、載體、賦形劑或其他組分(例如，靶向部分、水溶性分子等)的任何所需形式。可以將核糖核酸酶作為治療劑或研究試劑包裝在試劑盒中，所述試劑盒含有用于運輸和/或儲存的包裝和適當容器，包括成為用于一個或多個患者的單劑量或多劑量形式的制備物。本發明還提供了包含不顯著改變核糖核酸酶的一個或多個或任何治療相關性質的氨基酸變化的SEQ ID N0:1變體。本文更詳細描述了這些變體的實例。例如，據認為單獨以異亮氨酸或纈氨酸替代亮氨酸、以谷氨酸替代天冬氨酸、以絲氨酸替代蘇氨酸或以一種氨基酸替代結構相關氨基酸的相似替代(即，保守突變)將不對所得分子的生物活性有大的影響。因此，本發明的一些實施方式提供了含有保守替代的本文公開的核糖核酸酶變體。保守替代是在側鏈相關的氨基酸家族內發生的替代。遺傳編碼的氨基酸可分為四個家族(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；( 堿性(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)；C3)非極性(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；和(4)不帶電極性 (甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時統稱芳香族氨基酸。按照相似方式，氨基酸集可分為(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；(幻堿性(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)；C3)脂肪族(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸)，其中可選將絲氨酸和蘇氨酸單獨分為脂肪族-羥基氨基酸；(4) 芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；( 酰胺類(天冬酰胺、谷氨酰胺)；和(6)含硫氨基酸(半胱氨酸和甲硫氨酸)(例如，Stryer ed.，Biochemistry, 17頁-21頁，2nd ed，WH Freeman and Co.，1981)。通過評價變體肽以與野生型蛋白相似的方式發揮功能的能力，可以容易確定肽的氨基酸序列的改變是否得到功能性多肽。具有多于一個替換的肽可容易地通過相同方式檢測。更罕見的是，變體包含“非保守”改變(例如，以色氨酸替代甘氨酸)。相似性最小的變化還可包括氨基酸缺失和/或插入。確定何種氨基酸殘基可以被取代、插入或缺失而不喪失生物活性的指導可以利用計算機程序找到(所述計算機程序包括但不限于， FADE (Mitchell 等人，Q004) · Molec. Simul. 30，97-106) ；MAPS (Ban 等人，Proceedings of the 8th Annual International Conference on Research in Computational Molecular Biology, 2004，205-212)、SYBYL (Tripos, Inc, St. Louis, M0)；和 PyMOL (可在 sourceforge 的互聯網站點獲得))。RNA 酶 1 的晶體結構由例如 Pous 等人(Acta Crystallogr D Biol CrystalIogr. 2001 ；57，498-505)和 Pous 等人(J Mol Biol. 2000 ；303，49-60)有所描述，并且作為選擇變化的基礎。此外，還可獲得其他人胰腺核糖核酸酶的晶體結構，包括嗜酸的衍生的神經毒素(EDN，RNA 酶 2 ；Swaminathan 等人，Biochemistry, 2002,41, 3341-3352，Mosimann 等人 J. Mol. Biol.，1996，260，540-552. ；Iyer 等人 J Mol Biol, 2005，347，637-655)、嗜酸陽離子蛋白(ECP，RNA 酶 3 ；Mohan 等人 Biochemistry2002 ；41， 12100-12106 ；Boix 等人 Biochemistry, 1999，38，16794-16801. ；MalIorqui-Fernandez 等 AJ. Mol. Biol，2000，300，1297-1307)、RNA 酶 4(Terzyan 等人，1999，285，205-214.)和血管生成素(RNA酶 5 ；Leonidas 等人 J. Mol. Biol. 1999,285,1209-1233 ；Leonidas 等人Protein Sci.，2001，10，1669-1676 ；Papageorgiou 等人EMBO J.，1997，16,5162-5177 ；Shapiro 等人 J. Mol. Biol.，2000，302，497-519.)。可以諸如通過定向進化或其他產生變體組合文庫的技術等方法來產生變體，下文有更詳細描述。在本發明的又一些實施方式中，可以對本發明的核苷酸序列進行工程化從而改變人RNA酶編碼序列，包括但不限于改變基因產物的克隆、加工、定位、分泌和/或表達的變化。例如，可利用本領域公知技術引入突變(例如，插入新限制位點、改變糖基化模式或改變密碼子偏好的定點突變等)。在一些實施方式中，在編碼本發明多肽的核酸序列中進行改變，從而根據基因在其中進行表達的生物體進行密碼子優化。下面描述示例性變體，包括但不限于取代、截短、嵌合等。本發明不限于這些具體變體。活性位點和底物結合區域中的變體以及離開活性位點的變體均設想在本發明的范圍內。例如，與正常人RNA酶1相比，SEQ ID NO 1的變體包括R4C、G38R、R39G、N67R、 G89R、S90R和V118C改變，而且還含有影響或不影響所述酶的一個或多個活性或性質的一個或多個額外的改變。可以根據例如實驗數據、計算機建模和合理設計通過與其他核糖核酸酶進行比較，從而選擇變體。可以利用選擇具有所需性質的變體的測試來檢測活性 (例如見，Raines 等人，J. Biol. Chem, 273, 34134 (1998) ；Fisher 等人，Biochemistry 37 12121(1998) ；Guar 等人，J. Biol. Chem. , 276 :24978 (2001) ；Bosch，等人，Biochemistry, 43 2167 (2004, ) ；Lin, J. Biol. Chem.，245 :6726 (1970) ；Bal 等人，Eur. J. Biochem.，245 465(1997) ；Guar 等人，Mol. Cell. Biochem.，275 :95(2005) ；Benito 等人，Protein Eng.， 15 :887(2002) ；Ribo 等人，Biol. Chem. Hoppe-seyler, 375 :357(1994) ；DiGaetano 等人， Biochem. J.，358 :241(2001) ；Trautwein 等人，FEBS Lett.，281 :277(1991) ；Curran 等人， Biochemistry 32 :2307(1993) ；Sorrentino 等人，Biochemistry 42 :10182(2003)；將各篇文獻以引用方式整體并入本文)。下文提供了在變體生成中進行修飾的示例性氨基酸位置。根據需要，可以對一個或多個位點進行修飾。以下的示例性列表提供了基于野生型人RNA酶1的氨基酸編號的各氨基酸位置修飾的效用的評級(例如，表示為修飾的益處(例如，從而得到功能性核糖核酸酶(例如，具有所需性質(例如，癌細胞殺死和/或核糖核酸裂解(ribonucleolytic)活性) 的功能性核糖核酸酶)))。根據需要在核糖核酸酶修飾(例如，缺失、取代或產生核糖核酸酶變體和/或與水溶性聚合物綴合的其他種類突變)后還保留在核糖核酸酶中的本文所述核糖核酸酶的特性(例如，生物活性(例如，核糖核酸裂解活性、癌細胞殺死活性、寡聚反應能力等))，可將“益處位點”表征為“高益處位點”、“中益處位點”或“低益處位點”。例如，高益處位點是那些可被修飾而不顯著干擾核糖核酸酶的一個或多個所需活性或性質的位點 高益處(1-3、13-24、31-39、48-50、60、66-71、75-78、87-94、105、112-115 和 127-128)；中益處(4-11、25、27-30、42-47、51-57、59、61-64、73-74、79-83、85-86、96-104、106-109、111、 116-118 和 120-126)；和低益處(12、26、40_41、58、65、72、84、95、110 和 119)。應當意識到，可以使用一個或多個修飾位點。優選的是，所選位點是高益處位點或中益處位點。不過，一個或多個額外的位點可以根據需要進行改變，并適合于預計的應用。 應當注意的是，在一些實施方式中，(例如，通過用于產生蛋白(例如，重組人核糖核酸酶 (例如，大腸桿菌中產生))的方法)引入甲硫氨酸(例如，甲硫氨酸不是野生型人RNA酶的一部分)作為蛋白的第一個氨基酸的方式制備RNA酶。因此，在一些實施方式中，本文所示的氨基酸殘基的編號可以為1個數值的偏離(例如，如果將甲硫氨酸引入蛋白中，則本文所述人RNA酶的氨基酸殘基的編號偏離1(即，由于在位置1引入甲硫氨酸，所以所述氨基酸編號少1，例如，10號殘基由于位置1處引入甲硫氨酸而實際上成為11號殘基))。類似的是，所述位置還可以適用于其他相關核糖核酸酶的對應數值位置。在一些實施方式中，對本發明中進行修飾(例如，缺失、突變等)的所需殘基進行選擇以避免破壞核糖核酸酶的三級結構和/或穩定性。在一些實施方式中，這些殘基位于蛋白表面(例如，通常接觸溶劑(例如，水或緩沖液)的殘基)。例如，在一些實施方式中， 經修飾的殘基類型包括但不限于，在晶體結構中表現混亂的氨基酸、接觸核糖核酸酶抑制劑蛋白的殘基和三級結構(例如，α螺旋和β片層)不涉及的氨基酸、結構(例如，α螺旋和β片層)之間的環區域中的氨基酸以及蛋白末端(N-末端和C-末端)的氨基酸。在一些實施方式中，在N-末端或C-末端添加額外的氨基酸殘基(例如，用于產生RNA酶類似物和/或用于綴合水溶性聚合物)。在一些實施方式中，本發明提供了核糖核酸酶的聚合物綴合，從而增加其體內循環半衰期，并保留核糖核酸裂解活性或其他所需功能(例如，癌細胞殺死功能)。在一些實施方式中，在核糖核酸酶蛋白的避免核糖核酸酶抑制劑(RI)所涉及的區域中將核糖核酸酶與水溶性聚合物綴合。在一些優選實施方式中，在核糖核酸酶蛋白的避免RI所不涉及的區域(例如，不影響核糖核酸酶與RI結合的區域)中將核糖核酸酶與水溶性聚合物綴合。 不涉及避免RI的區域的實例包括但不限于，包含1、49、75或113位氨基酸殘基的區域。因此，雖然對機理的理解不是實施本發明所必需的，并且本發明不限于任何具體的作用機理， 但在一些實施方式中，即使水溶性聚合物與核糖核酸酶的綴合無助于核糖核酸酶逃避RI， 但該綴合還具有生物活性(例如，癌細胞殺死活性)。在一些實施方式中，本發明在RNA酶中引入了獨特的功能性基團，以便綴合水溶性聚合物。例如，在一些實施方式中，將半胱氨酸分子工程化到RNA酶中(例如，不喪失核糖核酸裂解活性或其他所需功能(例如，癌細胞殺死功能))，從而提供用于綴合水溶性聚合物的游離巰基。在RNA酶中別處沒有發現游離巰基，從而提供了產生均一綴合的能力。在其它實施方式中，利用重組DNA技術來提供經修飾的或新型的密碼子，從而在所研究的RNA 酶中引入具有正交功能的非-天然氨基酸(而例如，不喪失核糖核酸裂解活性)。在一些實施方式中，核糖核酸酶經修飾而包含一個或多個氨基酸殘基，例如賴氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸，從而提供水溶性聚合物的結合位置(例如，與氨基酸側鏈中的原子結合)。本領域普通技術人員公知添加氨基酸殘基的技術(例如見，March, Advanced Organic Chemistry !Reactions Mechanisms and Structure,4th Ed. (New York ffiley-Interscience,1992))。本發明不限于本文所述的對所述核糖核酸酶進行的修飾的種類。在一些實施方式中，通過結合選自葡聚糖、糖類、白蛋白、載體蛋白和抗體(例如，用于延長核糖核酸酶半衰期的非靶向性抗體)的一個或多個部分而改變本發明。本發明不限于本文所述的用于與人核糖核酸酶綴合所用的水溶性聚合物種類。實際上，可以使用任何生物相容性水溶性聚合物。在一些實施方式中，水溶性聚合物是非肽類、無毒性、非-天然存在的和/或生物相容的。如果通過臨床醫師(例如，內科醫生)評估，將聚合物單獨使用或與其他物質(例如，與核糖核酸酶綴合)組合使用(例如，施用于患者)的與活組織有關的有益效果超過任何不利效果，則認為該水溶性聚合物具有生物相容性。對于非-免疫原性，如果聚合物在體內的預定使用并未產生不利的免疫應答(例如， 形成抗體)，或者即使產生免疫應答，這種應答也不被臨床醫師評估為臨床顯著的或重要的，則該聚合物被認為是非免疫原性的。因此，在一些優選實施方式中，所述水溶性聚合物是生物相容的和非免疫原性的。選擇本發明的水溶性聚合物，從而使該聚合物在與人核糖核酸酶結合時在水性環境(例如生理環境)中不沉淀。在一些實施方式中，根據與人核糖核酸酶蛋白的綴合方法選擇聚合物。例如，對于利用還原性烷基化的方法，所選聚合物應具有單一反應性醛從而可以控制聚合度。聚合物可以是枝化的或非枝化的。優選的是，對于終產物制備物的治療應用，聚合物為藥學可接受的。根據對聚合物/蛋白綴合物是否用于治療，以及如果用于治療時的所需劑量、循環時間、對蛋白水解作用的抗性的考慮和其他考慮，本領域技術人員能夠選擇所需聚合物。例如，利用本領域公知方法測試綴合物的體外核糖核酸裂解活性，可以查明這些考慮因素。水溶性聚合物可以選自下組該組包括但不限于聚(烷撐二醇)，如聚乙二醇 (PEG)、聚丙二醇(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化的多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羥烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)、聚 (糖)、聚(α -羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噴唑啉、聚(N-丙烯酰嗎啉)及上述任何物質的組合。所述聚合物可以為直鏈(例如，烷氧基PEG或雙功能PEG)或支鏈。另外，所述聚合物可以是多臂的(例如，分叉PEG或與多醇核結合的PEG)、樹枝的和/或包含可降解的鍵。還設想，聚合物的內部結構可以組織為多種不同模式中的任何模式(例如，包括但不限于均聚物、交替共聚物、隨機共聚物、嵌段共聚物、交替三聚體、隨機三聚體和嵌段三聚體的模式)。此外，聚合物可以由適合于與核糖核酸酶中的所需殘基偶聯的適當的活化基團來“活化”。“活化”聚合物是指具有與核糖核酸酶反應的反應性基團的聚合物。本發明中活化聚合物及其與設想有用的蛋白綴合的方法(例如，用于將水溶性聚合物與人核糖核酸酶綴合)的實例是本領域已知的，并在hlipsky，Bioconjugate Chem 6,150-165(1995)； Kinstler 等人，Advanced Drug Delivery Reviews 54，477—485 (2002)；禾口 Roberts 等人， Advanced Drug Delivery Reviews 54,459-476(2002)中有詳細描述；出于所有目的將上述各篇文獻以參考方式整體并入本文。聚合物可以具有任何分子量。例如，對于聚乙二醇，優選分子量為約2kDa至約 150kDa (術語“約”表示在聚乙二醇制備物中，與標稱分子量相比，一些分子更重，一些分子更輕)。根據所需治療情況(例如，本發明組合物(例如，含有RNA酶蛋白或類似物的組合物)的所需緩釋時間、效果、生物學活性(如果有)、處理的容易性、抗原性的程度或抗原性缺失和聚乙二醇的其它已知效果)，可以使用其他規格。當將聚乙二醇(PEG)用作水溶性聚合物，則PEG的一端可以以惰性基團封端。 例如，PEG分子可以為甲氧基-PEG，也稱為mPEG，是其中聚合物的一端為甲氧基(例如，-0CH3)、而另一端為功能性基團(例如，羥基)的PEG形式，上述功能性基團可化學修飾并用于將反應性基團與靶蛋白(例如，人核糖核酸酶)綴合。在一些實施方式中，使用美國專利申請公開號20040235734中所述的PEG聚合物，通過參考將其整體并入本文。在一些實施方式中，PEG聚合物可以包含一個或多個弱的或可降解的鍵。例如，PEG 聚合物可以包含酯鍵(例如，可以隨時間而水解的酯鍵(例如，當存在于患者體內時))。在一些實施方式中，包含可降解鍵的PEG聚合物的水解產生2個或更多個片段(例如，分子量低于母體分子的片段)。本發明不受可降解鍵類型的限制。實際上，PEG聚合物可以包含各種可降解鍵中的一種或多種，所述可降解鍵包括但不限于碳酸酯鍵；亞胺鍵；磷酸酯鍵；腙鍵；縮醛鍵；原酸酯鍵；酰胺鍵、氨基甲酸乙酯鍵；肽鍵；和寡核苷酸鍵。設想到，在聚合物本身中包含一個或多個可降解鍵提供了控制本發明的綴合物的藥代動力學特性的又一機制。例如，在一些實施方式中，本發明的RNA酶-PEG綴合物可施用于患者，其中所述綴合物在施用時幾乎沒有至根本沒有酶活性，但當暴露于所述鍵降解 (例如，水解)的條件時，所述酶的核糖核酸裂解活性被激活。因此，在一些實施方式中，PEG 分子內的可降解鍵可用于增加綴合物的特異性和效能。設想到，本發明的綴合物可以含有聚合物(例如，PEG)和人核糖核酸酶蛋白之間的鍵。在一些實施方式中，所述鍵為穩定的鍵(例如，酰胺鍵、氨基甲酯鍵、胺鍵、硫醚/硫化物鍵或碳酰胺鍵。在一些實施方式中，所述鍵可水解(例如，從而釋放RNA酶(例如，在 RNA酶上不剩余聚合物(例如，PEG)部分))。本發明不受所用可降解鍵的類型的限制。實際上，本文設想了多種鍵，包括但不限于，羧酸酯、磷酸酯、硫羥酸酯(thiolester)、酐、縮醛、縮酮、酰氧基烷基醚、亞胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。這些鍵可通過(例如，利用本領域已知方法)修飾RNA酶蛋白(例如，位于C-末端羧基或氨基酸側鏈的羥基)和/或聚合物而制得。水溶性聚合物(例如，PEG)與核糖核酸酶蛋白分子的比例可以變化，只要其在反應混合物中的濃度允許。通常，可以(例如，利用所選聚合物(例如，PEG)的分子量、所用綴合化學、所靶向的感興趣位點的數量等)確定最適比例(例如，就反應效率而言(例如，將聚合物綴合至1、2、3、4或更多個位點)其中幾乎沒有至沒有過量的未反應蛋白或聚合物)。 例如，在一些實施方式中，可以進行非-特異性綴合反應(例如，PEG化反應)，然后進行后續純化(例如，從而根據綴合至各RNA酶的聚合物(例如，PEG)的數量來分離RNA酶)。在一些實施方式中，綴合物存在于組合物中。例如，在一些實施方式中，組合物包含多個綴合物，其中每個蛋白包含1-3個與蛋白共價連接的水溶性聚合物。在一些實施方式中，組合物包含多個綴合物，其中每個蛋白包含1、2、3、4、5、6或更多個與蛋白連接的聚合物。在一些實施方式中，組合物包含綴合物的群，其中大多數綴合物(例如，大于65%、 大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于95%、大于97%、大于98%、大于99%)共價連接相同數量(例如，1、2、3或更多個)的聚合物(例如，PEG分子)。在一些實施方式中，1、2、3或更多個聚合物與寡聚的核糖核酸酶綴合。本發明的寡聚物中存在的核糖核酸酶分子的數量不受限制。實際上，多個寡聚物可以與一個或多個水溶性聚合物綴合，包括但不限于，2、3、4、5、6或甚至更多個核糖核酸酶的寡聚物。在一些實施方式中，本發明提供了包含含有單個水溶性聚合物(例如，單PEG化)的多個RNA酶的組合物。在一些實施方式中，所述多個RNA酶包含RNA酶的單體、二聚體、三聚體和/或更高級別的復合物 (即，寡聚物)。在優選實施方式中，本發明的經修飾的人核糖核酸酶蛋白(例如，水溶性聚合物-RNA酶綴合物)保留了大部分的酶(例如，核糖核酸裂解)活性。在一些實施方式中，綴合物具有未經修飾的(例如，未-綴合)核糖核酸酶的約至約95%的酶活性。在一些實施方式中，綴合物具有未經修飾的核糖核酸酶的更大的活性。在一些實施方式中，相對于具有核糖核酸裂解活性的未經修飾的母體核糖核酸酶，經修飾的人核糖核酸酶具有約1 %、 5 %U0 %U5%,20 %,30 %,40 %,50 %,55 %,60%,65 %,70 %,75 %,80 %,85
95%、97%、99%、100%或更大的活性(例如，以本領域技術人員公知的體外測試法測定)。在其它優選實施方式中，本發明的經修飾的人核糖核酸酶蛋白(例如，水溶性聚合物-RNA酶綴合物)保留了大部分的另一種所需性質(例如，核糖核酸裂解活性之外的性質(例如，癌細胞殺死能力))。雖然機理的理解對于實施本發明不是必需的，并且本發明不受任何特定作用機理限制，在一些實施方式中，在沒有(例如，小于70%、小于60%、小于 50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%或小于5%的未經修飾的核糖核酸酶的) 核糖核酸裂解活性的情況下，經修飾的人核糖核酸酶蛋白(例如，水溶性聚合物-RNA酶綴合物)(例如，由于人核糖核酸酶蛋白的其他特性)能夠殺死靶標細胞(例如，癌細胞或微生物(例如，病毒)感染的細胞)。本發明不限制用于將水溶性聚合物與本發明的人核糖核酸酶綴合的方法。多種化學知識是本領域已知的，并可用于制備本發明的組合物。這些方法已被詳細描述 (例如見，Zalipsky, Bioconjugate Chem 6,150-165(1995) ；Kinstler 等人，Advanced Drug Delivery Reviews 54,477—485(2002)；禾口 Roberts 等人，Advanced Drug Delivery Reviews M，459-476Q002))。在一些實施方式中，本發明使用了可用于將本發明的活化聚合物與人核糖核酸酶綴合的綴合化學知識。例如，為了獲得N-末端綴合的RNA酶(例如，N-末端PEG化的RNA酶)，可以使用還原性烷基化。不經聚合物(例如，PEG)和蛋白部分之間的連接基團而進行連接的方法由 Francis 等人在:Stability of protein pharmaceuticals :in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization(Eds. Ahern. , T.禾口 Manning， M. C.) Plenum, N. Y. , 1991)中進行了描述。在一些實施方式中，采用了涉及利用羧甲基mPEG 的N-羥基琥珀酰亞胺酯的方法(例如見，1998年10月20日授予的美國專利第5，824，784 號，通過參考將其整體并入本文)。在一些實施方式中，在綴合之后純化PEG-核糖核酸酶綴合物。本發明所用的純化方法類型不受限制。實際上，可以利用多種方法，包括但不限于，凝膠過濾色譜、離子交換色譜、疏水相互作用色譜、體積排阻色譜和本領域公知的其他方法。例如，在一些實施方式中，可以純化水溶性聚合物-RNA酶綴合物從而獲得一種或多種不同種類的綴合物(例如，與單個聚合物共價結合的綴合物)。在一些實施方式中，對綴合反應的產物進行純化以獲得(例如，平均為)每個人核糖核酸酶有1、2、3、4或更多個聚合物(例如，PEG)。在一些實施方式中，使用凝膠過濾色譜來分離/分級與不同數量的聚合物共價結合的核糖核酸酶或將綴合物與未-綴合蛋白或與未-綴合聚合物分離。凝膠過濾柱是本領域公知的，并且可從多個來源獲得(例如，Amersham Biosciences,Piscataway, NJ 的 SUPERDEX 和 SEPHADEX 柱)。在一些實施方式中，本發明提供了包含水溶性聚合物-人核糖核酸酶綴合物的組合物。在一些實施方式中，將組合物施用于患者以治療癌癥。因此，在一些實施方式中，本發明提供了治療癌癥的方法，所述方法包括施用包含水溶性聚合物-人核糖核酸酶綴合物的組合物。在一些實施方式中，本發明的治療組合物包含抗體和核糖核酸酶。抗體可以提供細胞或組織特異性靶向和/或額外的治療益處。下表列出了一些癌癥治療抗體的機理， 包括攜帶用于淋巴瘤和白血病的毒性載量的3種抗體綴合物。(Drug Discovery Today, Vol. 8, No. 11 June 2003)。所述綴合物中的2種，即^VALIN和BEXXAR，攜帶放射性碘作為毒素，而第三種，即MYL0TARG，攜帶細胞毒性的抗腫瘤抗生素calicheaminin，其分離自細菌發酵物。抗體Mylotarg特異性結合CD33抗原，所述抗原在超過80%的急性骨髓性白血病(AML)患者中可見的白血病母細胞表面上表達。所述綴合物中的抗體的約98. 3%氨基酸序列源自人源。表 權利要求
1.一種包含核糖核酸酶的組合物，所述核糖核酸酶具有帶下述氨基酸修飾的人RNA酶 1 序列R4C、G38R、R39G、N67R、G89R、S90R 和 Vl 18C。
2.如權利要求1所述的組合物，其中所述核糖核酸酶包含SEQID NO :1。
3.如權利要求1所述的組合物，其中所述核糖核酸酶由SEQID N0:1組成。
4.如權利要求1所述的組合物，其中所述核糖核酸酶重組產生。
5.如權利要求1所述的組合物，其中所述核糖核酸酶由包含SEQID NO :2的核酸分子編碼。
6.一種包含如權利要求1所述的核糖核酸酶的治療性制備物。
7.一種包含核酸序列的表達載體，所述核酸序列編碼如權利要求1所述的核糖核酸酶。
8.一種宿主細胞，其包含如權利要求7所述的表達載體。
9.一種治療受試者的方法，所述方法包括對受試者施用如權利要求1所述的組合物。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述核糖核酸酶每周以0.01至100mg/kg受試者體重施用一周或多周。
11.如權利要求9所述的方法，其中所述核糖核酸酶每天以0.01至100mg/kg受試者體 重施用一天或多天。
12.如權利要求9所述的方法，其中所述核糖核酸酶每次治療以0.01至100mg/kg受試者體重施用一次或多次治療。
全文摘要
公開了用于治療或預防疾病的核糖核酸酶(RNA酶)。所述核糖核酸酶包括具有帶下述氨基酸修飾的人RNA酶1序列的核糖核酸酶R4C、G38R、R39G、N67R、G89R、S90R和V118C。所述核糖核酸酶可重組制備，以用作治療性制備物。所述核糖核酸酶可以是宿主細胞中所含表達載體中的核酸序列。
文檔編號C07H21/00GK102227443SQ200980147889
公開日2011年10月26日 申請日期2009年10月1日 優先權日2008年10月1日
發明者J·金克, L·斯特隆, T·克林克 申請人:昆特森斯生物科學公司