專利名稱：紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法
技術領域：
本發明涉及關于紅樹植物的蛋白組學，尤其涉及其總蛋白的提取以及雙向電泳方法。
背景技術：
紅樹林(mangrove)是一種稀有的木本胎生植物。它生長于熱帶和亞熱帶陸地與海洋交界帶的灘涂淺灘，是陸地向海洋過度的特殊生態系統。紅樹林肩負優化環境和促進經濟社會發展的雙重使命，有著無可比擬的生態價值，在防風消災、提高生物多樣性、凈化大氣和水體環境等方面具有重要的生態意義和巨大經濟價值，也是中國南部沿海區域生態平衡最重要的生態安全保障體系之一。尤其紅樹林生態系統產生的生態、經濟、社會、文化、 再造功能及其他價值，已在中國和世界受到廣泛重視。隨著全球氣候的變暖，產生了應對氣候變化紅樹林北移現象。隨著科技的進步，人們發現基因表達產物——蛋白質的變化，是導致生命功能失常的直接因素。因此對紅樹植物耐寒性蛋白的研究對于應對氣候變化紅樹林北移的研究具有重要意義。雙向電泳是研究蛋白質表達變化最有效的工具之一。它利用等電點和分子量兩個性質對蛋白質進行分離，可以使樣品中的數千種蛋白質得到很好的分離。而蛋白質的樣品制備是雙向電泳的關鍵步驟，但是由于植物組織由于富含色素、多酚、多糖、有機酸等次生代謝物質和蛋白酶，其蛋白樣品制備一直較為困難。紅樹植物又生長在陸地與海洋交界帶的灘涂淺灘，因其特殊的生長環境，在其化學成分和生理活性方面都具有很多特殊性，其體內除含有多種次生代謝物質外還含有大量鹽分和單寧，鹽離子的存在嚴重干擾等電聚焦的進行，單寧根據結構的不同可分為水解單寧和縮合單寧，縮合單寧能與蛋白質結合并形成復合物，嚴重影響蛋白質的提取分離。因此，紅樹植物蛋白質提取較其他植物更為困難， 具有其特殊性和復雜性。而雙向電泳技術在植物中的應用主要集中在水稻、小麥或其他一些草本植物上，在紅樹植物中的應用報道較少。

發明內容
為方便對紅樹植物蛋白質做進一步的研究和分析，本發明提供經濟、簡便、易行、 快速的適用于紅樹植物的總蛋白的提取以及雙向電泳方法，經反復實驗證明該方法樣品制備的重復性好且圖譜清晰。本發明提供的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，技術方案是依次進行下列步驟
a、將定量的紅樹植物葉片置于液氮中研磨充分，將粉末轉至離心管中，加入4倍體積 20%的TCA-丙酮溶液，渦旋混勻后，置于低溫下沉淀；
b、離心后收集沉淀，將該沉淀用預冷的丙酮洗滌，于低溫高速渦旋離心后收集沉淀，再將沉淀置于室溫晾干；
C、向步驟b得到的沉淀加入裂解緩沖液，低溫下溶解后離心，取上清液為蛋白提取樣品 ；
d、用Bradford法測定步驟c得到的蛋白提取樣品的蛋白質含量；
e、進行第一向固定pH梯度等電聚焦電泳將步驟c得到的蛋白提取樣品以及含電泳指示劑的上樣緩沖液加入聚焦盤中，將IPG膠條膠面朝下放入蛋白提取樣品溶液，加蓋礦物油，設置好等電聚焦程序；
f、進行膠條平衡等電聚焦后的IPG膠條依次在第一平衡緩沖液和第二平衡緩沖液中平衡，然后轉移至SDS-聚丙烯酰胺凝膠的上端，瓊脂糖封膠液封頂；
g、進行第二向SDS-PAGE電泳先用低電流的恒流電泳，再加大電流直至電泳指示劑到達膠的底端即可停止電泳。h、取步驟g電泳后得到的凝膠進行高靈敏度染色。本發明所提供的技術方案可專門適用于紅樹植物的蛋白質提取以及雙向電泳方法。因為TCA和丙酮可用于沉淀蛋白質和雙向電泳樣品制備過程中去除單寧和鹽分，但是過高的TCA濃度在酸性條件下與蛋白質形成不溶性鹽，且TCA可能滲入高豐度蛋白質分子內部而難以完全除去，也會影響高分子蛋白的提取，不易被丙酮徹底抽提，因此TCA的濃度是影響紅樹植物蛋白質提取的主要因素，過高或過低的TCA濃度都將影響到蛋白質的提取及其后續電泳的效果。本發明步驟a使用20%TCA-丙酮溶液提取蛋白質，20%的TCA可以更好的去除鹽離子，其中80%濃度的丙酮則對蛋白質與縮合單寧的復合物的分離作用效果顯著，可較好分離該復合物，去除單寧，提高蛋白質濃度，用20% TCA-丙酮所提取的紅樹植物蛋白質含量較高，2-DE電泳圖譜清晰，且操作簡單，重復性好，試劑毒性較低。本發明提供改進的紅樹植物的蛋白質提取以及雙向電泳方法，在上述技術方案的基礎上，步驟e的等點聚焦程序包括依次進行下列步驟無電壓慢速水化4小時，250伏電壓慢速水化0. 5小時，500伏電壓慢速除鹽0. 5小時，1000伏電壓快速除鹽1. 5小時，1000 伏電壓線性升高至10000伏電壓3小時，10000伏電壓聚焦65000總電壓時間積，500伏電壓保持18小時。此改進方案是對第一向固定pH梯度等電聚焦電泳的優化，專門適用于紅樹植物的雙向電泳方法第一步無電壓泡脹即被動水化4小時，目的使大部分蛋白進入IPG 膠條。但高分子蛋白很難進入IPG膠條，故選用低電壓250V主動水化0. 5小時，使大分子蛋白進入膠內。由于蛋白質樣品含鹽量較高，故選用除鹽500伏0.5小時和除鹽1000伏 1.5小時，減少鹽離子對樣品聚焦的影響。因為IPG的導電性較弱，需要使用2000伏以上的高電壓才能使蛋白聚焦，故我們設定1000伏線性上升3小時，使電壓緩慢升高至10000伏， 避免電壓過高燒膠膠條。本發明提供改進的紅樹植物的蛋白質提取以及雙向電泳方法，步驟c中的裂解緩沖液包括 2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS,40mmol/L Tris,2mmol/L ΤΒΡ,Ο. 2% Bio-lyte。該配方提供了專用于紅樹植物的蛋白質提取的裂解緩沖液，其中各試劑作用分別是尿素用于破壞蛋白高級結構，打斷非共價連接的離解劑；硫脲不僅對膜蛋白有極為明顯的增溶效果，而且對核蛋白等微溶性蛋白質以及對等電點附近蛋白沉積都有改善，還可抑制蛋白酶活性，但其水中溶解度低，只在高濃度尿素中才溶解，因此濃度為2mol/L硫脲，7mol/L尿素；CHAPS用于兩性離子型去污劑，可打斷蛋白質分子或亞基間的疏水作用， 增加蛋白溶解性，CHAPS與尿素、硫脲同時使用，對膜蛋白的增溶作用突出；TBP是非離子型還原劑，打開二硫鍵，保持蛋白處于還原狀態，較低濃度既可提高蛋白溶解性，而且不會電場中遷移。在等電聚焦過程中保持蛋白還原狀態，同時簡化了兩向轉移間的平衡操作； Bio-Lyte是兩性電解質，具有在聚焦過程中不改變pH梯度前提下提供穩定導電的能力。因兩性電解質會在電場中遷移聚焦，故濃度不應過高。本發明提供改進的紅樹植物的蛋白質提取以及雙向電泳方法，步驟e中的上樣緩沖液包括 2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris,2mmol/L TBP, 0. 2% Bio-lyte,0. 001%溴酚藍，上樣緩沖液中的溴酚藍在電泳里起指示作用，其余試劑與前述裂解緩沖液保持一致，使蛋白質提取以及電泳環境一致，提高蛋白質電泳效果得到清晰電泳圖譜。本發明提供改進的紅樹植物的蛋白質提取以及雙向電泳方法，其步驟f中的第一平衡緩沖液包括 l%DTT，6mol/L 尿素，2%SDS，50mol/LTris_HCl，Ph8. 8 的 20% 甘油，步驟 f 中的第二平衡緩沖液包括2. 5%碘乙酰胺，6mol/L尿素，2%SDS，50mol/LTris-HCl，Ph8. 8的 20%甘油。該第一和第二平衡緩沖液是針對紅樹植物特性所做出的試劑配方，能提高蛋白質電泳效果并得到清晰電泳圖譜。本發明提供改進的紅樹植物的蛋白質提取以及雙向電泳方法，步驟c得到蛋白提取樣品后用clean-up試劑盒純化。經clean-up試劑盒純化后的蛋白樣品中所含雜質大幅減少，其電泳圖譜背景清晰，蛋白點分離較好。本發明提供改進的紅樹植物的蛋白質提取以及雙向電泳方法，步驟e使用的IPG 膠條規格為PH3-10NL，紅樹植物蛋白質pH大都分布在4_7左右，其酸性端和堿性端蛋白分布較少，為了保證大部分蛋白得到很好的分離且不丟失酸堿兩端的少量蛋白，采用PH 3-10 NL的IPG膠條。此種膠條的pH非線性分布，在pH 4_7范圍分布較寬，在pH 3_4和7_10范圍分布較窄，這樣既保證了紅樹植物大多數蛋白點的較好分離，又不會丟失酸堿兩端蛋白， 真正做到蛋白質的完全分離。本發明所稱的紅樹植物包括木欖、秋茄、桐花等品種。下面結合附圖、具體實施例以及對比例對本發明作進一步詳細說明。


圖1為實施例一紅樹植物秋茄蛋白質提取以及雙向電泳方法所獲的圖譜。圖2為實施例二紅樹植物秋茄蛋白質提取以及雙向電泳方法所獲的圖譜。圖3為實施例三紅樹植物桐花蛋白質提取以及雙向電泳方法所獲的圖譜。
具體實施例方式實施例一
采用Eppendorf超速離心機、雙向電泳PROTEANIIXi/XL Cell (美國BIO-RAD公司)
(1)采集秋茄新鮮葉片(倒二對嫩葉)；
(2)稱取Ig葉肉，置于液氮中研磨充分；將粉末轉至離心管中，加入4倍體積20%的 TCA-丙酮中溶液中，渦旋，4°C沉淀過夜；
(3)4°C,12000r/min離心30min后收集沉淀，將該沉淀用4°C預冷的丙酮(含2%β -巰基乙醇)洗滌，渦旋，4°C，12000r/min離心IOmin后收集沉淀，重復三次，沉淀置室溫晾干；
(4)向步驟(3)得到的紅樹植物秋茄葉片全蛋白粗提物中加入裂解緩沖液(2mol/L硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris,2mmol/L TBP, 0. 2% Bio-lyte)后，4°C溶解過夜，4°C，12000r/min離心30min，取上清即為秋茄葉片蛋白溶液；
(5)用clean-up試劑盒純化蛋白，得到紅樹植物秋茄葉片全蛋白雙向電泳樣品液；
(6)蛋白質定量用Bradford法測定蛋白質含量，用吸光光度計測量波長595nm，做標準曲線，測定蛋白濃度；
(7 )測得蛋白濃度為11. 5μδ/μ ,樣品進行雙向電泳試驗；
(8)第一向固定ρΗ梯度等電聚焦電泳采用低電壓膠內泡漲法，將400ug蛋白樣品與上樣緩沖液(2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris,2mmol/L TBP, 0. 2% Bio-lyte, 0. 001%溴酚藍)共300ul混合后加入聚焦盤中，選用pH3_10 NL、17cm膠條，IPG 膠條膠面朝下放入水化液，加蓋3mL礦物油。聚焦參數見下列表1 : 表1 IEF電泳參數
權利要求
1.一種紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于依次進行下列步驟a、將定量的紅樹植物葉片置于液氮中研磨充分，將粉末轉至離心管中，加入4倍體積 20%的TCA-丙酮溶液，渦旋混勻后，置于低溫下沉淀；b、離心后收集沉淀，將該沉淀用預冷的丙酮洗滌，于低溫高速渦旋離心后收集沉淀，再將沉淀置于室溫晾干；C、向步驟b得到的沉淀加入裂解緩沖液，低溫下溶解后離心，取上清液為蛋白提取樣Pm ；d、用Bradford法測定步驟c得到的蛋白提取樣品的蛋白質含量；e、進行第一向固定pH梯度等電聚焦電泳將步驟c得到的蛋白提取樣品以及含電泳指示劑的上樣緩沖液加入聚焦盤中，將IPG膠條膠面朝下放入蛋白提取樣品溶液，加蓋礦物油，設置好等電聚焦程序；f、進行膠條平衡等電聚焦后的IPG膠條依次在第一平衡緩沖液和第二平衡緩沖液中平衡，然后轉移至SDS-聚丙烯酰胺凝膠的上端，瓊脂糖封膠液封頂；g、進行第二向SDS-PAGE電泳先用低電流的恒流電泳，再加大電流直至電泳指示劑到達膠的底端即可停止電泳；h、取步驟g電泳后得到的凝膠進行高靈敏度染色。
2.根據權利要求1所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于所述步驟e的等電聚焦程序包括依次進行下列步驟無電壓慢速水化4小時，250伏電壓慢速水化0. 5小時，500伏電壓慢速除鹽0. 5小時，1000伏電壓快速除鹽1. 5小時，1000伏電壓線性升高至10000伏電壓3小時，10000伏電壓聚焦65000總電壓時間積，500伏電壓保持18 小時。
3.根據權利要求1或2所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于所述步驟c中的裂解緩沖液包括2mol/L硫脲，7mol/L尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris,2mmol/L ΤΒΡ,Ο. 2% Bio-Iyte0
4.根據權利要求1或2所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于 所述步驟e中的上樣緩沖液包括2mol/L硫脲，7mol/L尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris， 2mmol/L TBP, 0. 2% Bio_lyte，0. 001% 溴酚藍。
5.根據權利要求3所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于 所述步驟e中的上樣緩沖液包括2mol/L硫脲，7mol/L尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris, 2mmol/L TBP, 0. 2% Bio-lyte,0. 001% 溴酚藍。
6.根據權利要求1或2所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于 所述步驟f中的第一平衡緩沖液包括l%DTT，6mol/L尿素，2%SDS，50mol/LTris-HCl，Ph8. 8 的20%甘油，所述步驟f中的第二平衡緩沖液包括2. 5%碘乙酰胺，6mol/L尿素，2%SDS， 50mol/LTris-HCl, Ph8. 8 的 20% 甘油。
7.根據權利要求1或2所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于 所述步驟c得到蛋白提取樣品后用clean-up試劑盒純化。
8.根據權利要求1或2所述的紅樹植物總蛋白的提取以及雙向電泳方法，其特征在于 所述步驟e使用的IPG膠條規格為PH3-10NL。
全文摘要
本發明提供經濟、簡便、易行、快速的適用于紅樹植物的總蛋白的提取以及雙向電泳方法，經反復實驗證明該方法樣品制備的重復性好且圖譜清晰，其技術方案可專門適用于紅樹植物的蛋白質提取以及雙向電泳方法。本發明使用20%TCA-丙酮溶液提取蛋白質，20%的TCA可以更好的去除鹽離子，其中80%濃度的丙酮則對蛋白質與縮合單寧的復合物的分離作用效果顯著，可較好分離該復合物，去除單寧，提高蛋白質濃度，用20%TCA-丙酮所提取的紅樹植物蛋白質含量較高，2-DE電泳圖譜清晰，且操作簡單，重復性好，試劑毒性較低。
文檔編號C07K1/14GK102321149SQ20111027552
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月16日 優先權日2011年9月16日
發明者于馮, 仇建標, 劉偉成, 周志明, 施夢茄, 李尚魯, 艾為明, 謝起浪, 鄭春芳, 陳少波, 陳驍, 馬小偉, 黃麗 申請人:浙江省海洋水產養殖研究所