專利名稱：一種富勒烯氨基酸衍生物的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種富勒烯衍生物的制備方法。
技術背景
作為碳元素的第三種同素異形體富勒烯家庭的發(fā)現(xiàn)是自然科學發(fā)展史重要的突破之一。富勒烯獨特的三維空間結構賦予了它特殊的物理及化學性質，并使它隱含了許多有待發(fā)現(xiàn)的新性質、新功能，這些為富勒烯科學的發(fā)展提供了廣闊的空間。有關富勒烯的研究目前已涉及到生命及醫(yī)藥科學、物理、化學、材料科學等眾多學科及研究領域。富勒烯的生物學特性為它在生物醫(yī)學方面的應用提供了廣闊的前景。近年來，對富勒烯物理及化學性質的研究發(fā)現(xiàn)其具有強大的與自由基反應的能力，曾報道過單一個富勒烯分子可加成34 個甲基自由基，因此富勒烯被喻為“自由基海綿”。但富勒烯的水溶性及生物相容性問題是富勒烯生物醫(yī)藥領域應用的前提和關鍵問題。富勒烯的化學修飾，在富勒烯表面引入合適的修飾基團是解決這一問題的有效途徑。將富勒烯與其它具有生物功能特性的分子或基團共價連接，合成具有生物學特性的富勒烯衍生物，研究其在生物學上的應用，是富勒烯生物醫(yī)學研究的創(chuàng)新性工作。
細胞凋亡是正常組織細胞更新的過程，是同增殖、分化機制一起共同維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素。凋亡是細胞死亡的一種生理方式，雖然誘導細胞死亡的信號因不同細胞而異，但是對于發(fā)生凋亡的細胞來講其形態(tài)特征卻相同細胞核收縮、細胞膜起泡及凋亡小體的形成。這種共同的特征說明不管細胞種類及凋亡信號如何，凋亡過程本身具有相同的生物化學機理。有機生物體內(nèi)在涉及氧的代謝反應中產(chǎn)生的活性氧自由基所引起的氧化壓力可誘導細胞膜、蛋白質及核酸等重要的生物細胞大分子發(fā)生積累性破壞作用，進而導致細胞凋亡，所以氧化壓力被認為是細胞凋亡的調(diào)節(jié)劑。
富勒烯及其衍生物由于具有缺電子多烯的結構特點，容易與自由基發(fā)生多加成反應，是活性氧自由基的良好捕獲劑。通過對活性氧自由基的清除，富勒烯及其衍生物可以抑制不同刺激誘發(fā)的細胞的凋亡，從而起到保護細胞及組織的作用。但是目前國內(nèi)外富勒烯衍生物的合成品種非常有限，主要的品種有富勒醇、富勒烯丙二酸衍生物等。這些修飾基團由于不具備生物功能特性，僅僅賦予富勒烯水溶性，而使得富勒烯的生物相容性及其生物學特性不盡如人意。考慮到氨基酸既有很強的親水性，又具有一定的生理藥理功能且生物相容性好，所以本發(fā)明將人體必須的氨基酸引入到富勒烯上，這將使它與富勒烯生成的衍生物具有較好的生物相容性、水溶解性及生物特性。本發(fā)明的優(yōu)點是與傳統(tǒng)的富勒醇、富勒烯丙二酸衍生物等相比，富勒烯氨基酸衍生物具有生物相容性好、水溶性好、用量小等優(yōu)點，同時還具有優(yōu)良的抑制細胞凋亡活性。目前，富勒烯氨基酸衍生物通常采用兩種方法制備。一種是通過1，3偶極環(huán)加成反應利用氨基酸修飾富勒烯。這種方法在生成亞胺葉立德活性中間體的過程中，需要脫除氨基酸上的羧基基團，同時氨基與富勒烯上的雙鍵成環(huán)反應，雖然能得到富勒烯氨基酸衍生物，但是完全改變了氨基酸的結構，使其生物活性降低或消失。第二種方法是利用氨基酸上氨基與富勒烯的親核加成反應。親核加成反應雖不會改變氨基酸的結構，但是由于羧基的空間位阻效應，α位的氨基難以與富勒烯發(fā)生親核加成反應，故只含一個α氨基的氨基酸通常反應活性較低。由此可知，通過親核加成反應制備富勒烯氨基酸衍生物可選擇的氨基酸有限，僅僅適用于含多個氨基的氨基酸，所以難以廣泛使用。因此現(xiàn)有技術制備的富勒烯氨基酸衍生物存在生物活性低，可選擇的氨基酸有限的問題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決現(xiàn)有技術制備的富勒烯氨基酸衍生物存在生物活性低，可選擇的氨基酸有限的問題，而提供一種富勒烯氨基酸衍生物的制備方法。
一種富勒烯氨基酸衍生物的制備方法，具體是按以下步驟完成的一、在室溫下將氨基酸和相轉移催化劑溶于去離子水中，并混合均勻，然后加入堿性溴水，并在室溫下混合均勻，即得到混合物；二、在攪拌速度為100轉/min 1000轉/min、室溫下向步驟一制備的混合物中加入富勒烯的甲苯溶液，然后在30°C 80°C、氮氣保護下反應1 3天，即得到反應產(chǎn)物；三、首先采用甲苯萃取出反應產(chǎn)物中剩余的富勒烯，然后采用凝膠色譜法進行洗脫，并收集:3min 30min內(nèi)的洗脫液，最后將得到的洗脫液在溫度為60°C 100°C下濃縮干燥1 Mh，即得到富勒烯氨基酸衍生物；步驟一中所述的氨基酸與相轉移催化劑的摩爾比為1 (0.2 5)；步驟一中所述的相轉移催化劑與去離子水的質量比為1 (0.3 300)；步驟一中所述的堿性溴水與去離子水的體積比為1 (0.06 60)；步驟二中所述加入的富勒烯的甲苯溶液與步驟一制備的混合物的體積比為1 (0.01 0.1)。
本發(fā)明的優(yōu)點一、本發(fā)明制備富勒烯氨基酸衍生物生物活性高；二、本發(fā)明通過制備氨基酸氮烯活性中間體，使氮烯與富勒烯上雙鍵發(fā)生成環(huán)反應，顯著提高氨基酸與富勒烯的反應活性，實現(xiàn)了只含一個α氨基的氨基酸可以與富勒烯反應制備成富勒烯氨基酸衍生物。


圖1是試驗一制備的富勒烯氨基酸衍生物的傅立葉紅外光譜圖；圖2是試驗一制備的富勒烯氨基酸衍生物的核磁共振碳譜圖；圖3是試驗一制備的富勒烯氨基酸衍生物的質譜圖；圖4是試驗一制備的富勒烯氨基酸衍生物的分子結構式圖；圖5是試驗二制備的富勒烯丙氨酸衍生物的核磁共振碳譜圖；圖6是試驗二制備的富勒烯丙氨酸衍生物的質譜圖；圖7是試驗二制備的富勒烯丙氨酸衍生物的分子結構式圖；圖8是試驗三制備的富勒烯精氨酸衍生物的核磁共振碳譜圖；圖9是試驗三制備的富勒烯精氨酸衍生物的質譜圖； 圖10是試驗三制備的富勒烯精氨酸衍生物的分子結構式圖；圖11是試驗四(1) (4)培養(yǎng)后細胞內(nèi)的活性氧自由基相對濃度柱形圖；圖12是試驗五(1) ( 培養(yǎng)后細胞的細胞凋亡率柱形圖。
具體實施方式
具體實施方式
一本實施方式是一種富勒烯氨基酸衍生物的制備方法，具體是按以下步驟完成的
一、在室溫下將氨基酸和相轉移催化劑溶于去離子水中，并混合均勻，然后加入堿性溴水，并在室溫下混合均勻，即得到混合物；二、在攪拌速度為100轉/min 1000轉/ min、室溫下向步驟一制備的混合物中加入富勒烯的甲苯溶液，然后在30°C 80°C、氮氣保護下反應1 3天，即得到反應產(chǎn)物；三、首先采用甲苯萃取出反應產(chǎn)物中剩余的富勒烯，然后采用凝膠色譜法進行洗脫，并收集:3min 30min內(nèi)的洗脫液，最后將得到的洗脫液在溫度為60V 100°C下濃縮干燥1 Mh，即得到富勒烯氨基酸衍生物。
本實施方式步驟一中所述的氨基酸與相轉移催化劑的摩爾比為1 (0.2 5)。
本實施方式步驟一中所述的相轉移催化劑與去離子水的質量比為1 (0.3 300)。
本實施方式步驟一中所述的堿性溴水與去離子水的體積比為1 (0.06 60)。
本實施方式步驟二中所述加入的富勒烯的甲苯溶液與步驟一制備的混合物的體積比為1 (0. 01 0. 1)。
本實施方式制備富勒烯氨基酸衍生物生物活性高。
本實施方式通過制備氨基酸氮烯活性中間體，使氮烯與富勒烯上雙鍵發(fā)生成環(huán)反應，顯著提高氨基酸與富勒烯的反應活性，實現(xiàn)了只含一個α氨基的氨基酸可以與富勒烯反應制備成富勒烯氨基酸衍生物。
采用下述試驗驗證發(fā)明效果
試驗一一種富勒烯氨基酸衍生物的制備方法，具體是按以下步驟完成的
一、在室溫下將氨基酸和四丁基溴化銨溶于去離子水中，并混合均勻，然后加入堿性溴水，并在室溫下混合均勻，即得到混合物；二、在攪拌速度為500轉/min、室溫下向步驟一制備的混合物中加入富勒烯的甲苯溶液，然后在55°C、氮氣保護下反應2天，即得到反應產(chǎn)物；三、首先采用甲苯萃取出反應產(chǎn)物中剩余的富勒烯，然后采用凝膠色譜法進行洗脫， 并收集15min內(nèi)的洗脫液，最后將得到的洗脫液在溫度為80°C下濃縮干燥18h，即得到富勒烯氨基酸衍生物。
本試驗步驟一中所述的氨基酸與四丁基溴化銨的摩爾比為1 2.5。
本試驗步驟一中所述的四丁基溴化銨與去離子水的質量比為1 150。
本試驗步驟一中所述的堿性溴水與去離子水的體積比為1 30。
本試驗步驟一中所述的堿性溴水由H20、Na0H和Br2混合而成，且H2O與NaOH的摩爾比為1 0.5，H2O與Br2的摩爾比為1 0.5。
本試驗步驟一中所述的氨基酸為胱氨酸。
本試驗步驟二中所述加入的富勒烯的甲苯溶液與步驟一制備的混合物的體積比為 1 0. 05。
本試驗步驟二中所述的富勒烯的甲苯溶液中富勒烯的摩爾濃度為lOmmol/L。
本試驗步驟二中所述的所述的富勒烯為C6(1。
對本試驗制備的富勒烯氨基酸衍生物分別采用傅立葉紅外光譜、核磁共振碳譜和質譜進行表征，結果分別如圖1、2和3所示，通過圖1、2和3的測試結果可知，C6tl胱氨酸衍生物的化學結構為氨基酸的氨基與C6tl上碳碳雙鍵形成含氮三元雜環(huán)，同時每一分子C6tl與五分子胱氨酸以共價鍵相連；并且通過圖1至圖3可知本試驗制備的富勒烯氨基酸衍生物為C6tl胱氨酸衍生物，其的分子結構式如圖4所示。
試驗二 本試驗與試驗一不同點是步驟一中所述的氨基酸為丙氨酸。其它與試驗一相同。
對本試驗制備的富勒烯氨基酸衍生物分別采用核磁共振碳譜和質譜進行表征，結果分別如圖5和6所示，通過圖5和6的測試結果可知，C60丙氨酸衍生物的化學結構為丙氨酸的氨基與C6tl上碳碳雙鍵形成含氮三元雜環(huán)，同時每一分子C6tl與七分子丙氨酸以共價鍵相連。本試驗制備的富勒烯氨基酸衍生物為C6tl丙氨酸衍生物，其的分子結構式如圖7所7J\ ο
試驗三本試驗與試驗一或二之一不同點是步驟一中所述的氨基酸為精氨酸。 其它與試驗一相同。
對本試驗制備的富勒烯氨基酸衍生物分別采用核磁共振碳譜和質譜進行表征，結果分別如圖8和9所示，通過圖8和9的測試結果可知，C60精氨酸衍生物的化學結構為精氨酸的氨基與C6tl上碳碳雙鍵形成含氮三元雜環(huán)，同時每一分子C6tl與八分子精氨酸以共價鍵相連。本試驗制備的富勒烯氨基酸衍生物為C6tl精氨酸衍生物，其的分子結構式如圖10 所示。
采用下述試驗檢測試驗一至三制備的富勒烯氨基酸衍生物對細胞內(nèi)活性氧自由基的清除作用
試驗四取處于對數(shù)生長期的PC12細胞用于試驗檢測試驗一至三制備的富勒烯氨基酸衍生物對細胞內(nèi)活性氧自由基的清除作用，具體操作過程如下取處于對數(shù)生長期的PC12細胞，并棄去原培養(yǎng)液，用D-Hanks液清洗2次，然后加入無血清培養(yǎng)液，最后采用下列方式法培養(yǎng)⑴空白對照組不加入任何物質，在室溫下培養(yǎng)24h ； (2) H2O2對照組加 H2O2至濃度為800ymol/L，然后在室溫下培養(yǎng)Mh ;C3)實驗組分別加入C6tl丙氨酸衍生物、 C60胱氨酸衍生物和C6tl精氨酸衍生物至最終濃度分別為50 μ g/mL、5 μ g/mL和0. 5 μ g/mL, 然后在室溫下培養(yǎng)lh，再加H2A至終濃度為800 μ mol/L,繼續(xù)在室溫下培養(yǎng)Mh ； (4)正常對照組分別加入C6tl丙氨酸衍生物、C60胱氨酸衍生物和C6tl精氨酸衍生物至最終濃度分別為50 μ g/mL,然后在室溫下培養(yǎng)Mh。
利用熒光探針2，7-二氯熒光二乙酸酯(DCF-DA)染色，并通過流式細胞儀檢測本試驗(1) (4)培養(yǎng)后細胞內(nèi)的活性氧自由基，檢測結果如圖11所示，通過圖11可以清楚的看出當采用試驗一至三制備的富勒烯氨基酸衍生物作用后，后細胞內(nèi)的活性氧自由基明顯變低，證明試驗一至三制備的富勒烯氨基酸衍生物對細胞內(nèi)活性氧自由基具有清除作用。
檢測H2A對照組培養(yǎng)后細胞內(nèi)DCF的熒光強度為432. 7，檢測實驗組分別加入C6tl 丙氨酸衍生物、C60胱氨酸衍生物和C6tl精氨酸衍生物至最終濃度為5 μ g/mL培養(yǎng)后細胞內(nèi) DCF的熒光強度分別為178. 2、143. 0和M4. 2 ；從熒光強度變化可以證明試驗一至三制備的富勒烯氨基酸衍生物對細胞內(nèi)活性氧自由基具有清除作用，且C6tl胱氨酸衍生物的清除效果最好。同時，單獨加入富勒烯氨基酸衍生物對細胞內(nèi)活性氧自由基濃度無顯著影響，顯示出富勒烯氨基酸衍生物優(yōu)良的生物相容性。
采用下述試驗檢測試驗一至三制備的富勒烯氨基酸衍生物對H2A所致細胞凋亡的抑制作用
試驗五取處于對數(shù)生長期的PC12細胞用于檢測試驗一至三制備的富勒烯氨基酸衍生物對H2A所致細胞凋亡的抑制作用，具體操作過程如下取處于對數(shù)生長期的PC12細胞，并棄去原培養(yǎng)液，用D-Hanks液清洗2次，然后加入無血清培養(yǎng)液，最后采用下列方式法培養(yǎng)(1)空白對照組不加入任何物質，在室溫下培養(yǎng)Mh ;(幻H2O2對照組加H2O2至濃度為800ymol/L，然后在室溫下培養(yǎng)Mh ；⑶實驗組分別加入C6tl丙氨酸衍生物、C6tl胱氨酸衍生物和C6tl精氨酸衍生物至最終濃度分別為50 μ g/mL、5 μ g/mL和0. 5 μ g/mL，然后在室溫下培養(yǎng)lh，再加H2A至終濃度為800 μ mol/L,繼續(xù)在室溫下培養(yǎng)Mh ； (3)維他命E對照組加入維他命E至最終濃度為1 μ mol/L,然后在室溫下培養(yǎng)lh，再加H2A至終濃度為 800 μ mol/L,繼續(xù)在室溫下培養(yǎng)Mh ； (5)正常對照組分別加入C6tl丙氨酸衍生物、C6tl胱氨酸衍生物和C6tl精氨酸衍生物至最終濃度分別為50 μ g/mL,然后在室溫下培養(yǎng)Mh。
利用熒光染料碘化丙啶染色，并采用流式細胞儀檢測本試驗(1) (5)培養(yǎng)后細胞的細胞凋亡率，結果如圖12所示，通過圖12可知經(jīng)800 μ mol/L H2O2損傷后，凋亡細胞的百分率為44. 72% ；正常對照組凋亡細胞百分率為0. 73% ；經(jīng)C6tl丙氨酸衍生物，C60胱氨酸衍生物及C6tl精氨酸衍生物預處理的PC12細胞，凋亡率顯著降低，分別為3. 23%, 7. 17% 及28. 65%,在濃度為5 μ g/mL M 50 μ g/mL范圍內(nèi)，呈劑量相關性；單獨用50 μ g/mL的C60 氨基酸衍生物作用于PC12細胞，細胞凋亡率與正常對照組相差不大，這說明，富勒烯氨基酸衍生物的生物相容性良好，沒有明顯的細胞毒性；以1 μ mol/L維他命E為陽性對照，用 1 μ mol/L維他命E預處理1小時后，細胞凋亡率為10. 68% ；通過圖12可知富勒烯氨基酸衍生物對H2A造成的細胞凋亡有優(yōu)良的抑制作用，且C6tl丙氨酸衍生物和C6tl胱氨酸衍生物在濃度為5 μ g/mL 50 μ g/mL范圍內(nèi)抑制作用優(yōu)于維他命E。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一中所述的堿性溴水由H20、Na0H和Br2混合而成，且H2O與NaOH的摩爾比為1 (0. 01 1)，H2O與Br2 的摩爾比為1 (0.01 1)。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二之一不同點是步驟一中所述的相轉移催化劑為四丁基溴化銨或四丁基氫氧化銨。其它與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同點是步驟一中所述的氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、 脯氨酸、組氨酸或精氨酸。其它與具體實施方式
一至三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同點是步驟二中所述的所述的富勒烯為C6tl或CTO。其它與具體實施方式
一至四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同點是步驟二中所述的富勒烯的甲苯溶液中富勒烯的摩爾濃度為0. 2mmol/L 20mmol/L。其它與具體實施方式
一至五相同。
權利要求
1.一種富勒烯氨基酸衍生物的制備方法，其特征在于富勒烯氨基酸衍生物的制備方法是按以下步驟完成的一、在室溫下將氨基酸和相轉移催化劑溶于去離子水中，并混合均勻，然后加入堿性溴水，并在室溫下混合均勻，即得到混合物；二、在攪拌速度為100轉/min 1000轉/min、 室溫下向步驟一制備的混合物中加入富勒烯的甲苯溶液，然后在30°C 80°C、氮氣保護下反應1 3天，即得到反應產(chǎn)物；三、首先采用甲苯萃取出反應產(chǎn)物中剩余的富勒烯，然后采用凝膠色譜法進行洗脫，并收集:3min 30min內(nèi)的洗脫液，最后將得到的洗脫液在溫度為60 V 100°C下濃縮干燥1 Mh，即得到富勒烯氨基酸衍生物；步驟一中所述的氨基酸與相轉移催化劑的摩爾比為1 (0.2 幻；步驟一中所述的相轉移催化劑與去離子水的質量比為1 (0.3 300)；步驟一中所述的堿性溴水與去離子水的體積比為 1 (0.06 60)；步驟二中所述加入的富勒烯的甲苯溶液與步驟一制備的混合物的體積比為 1 (0. 01 0. 1)。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種富勒烯氨基酸衍生物的制備方法，其特征在于步驟一中所述的堿性溴水由H20、NaOH和Br2混合而成，且H2O與NaOH的摩爾比為1 (0. 01 1)， H2O與Br2的摩爾比為1 (0. 01 1)。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種富勒烯氨基酸衍生物的制備方法，其特征在于步驟一中所述的相轉移催化劑為四丁基溴化銨或四丁基氫氧化銨。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的一種富勒烯氨基酸衍生物的制備方法，其特征在于步驟一中所述的氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、 胱氨酸、脯氨酸、組氨酸或精氨酸。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種富勒烯氨基酸衍生物的制備方法，其特征在于步驟二中所述的所述的富勒烯為C6tl或CTO。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種富勒烯氨基酸衍生物的制備方法，其特征在于步驟二中所述的富勒烯的甲苯溶液中富勒烯的摩爾濃度為0. 2mmol/L 20mmol/L。
全文摘要
一種富勒烯氨基酸衍生物的制備方法，它涉及一種富勒烯衍生物的制備方法。本發(fā)明要解決現(xiàn)有技術制備的富勒烯氨基酸衍生物存在生物活性低，可選擇的氨基酸有限的問題。方法一、將氨基酸和相轉移催化劑混合均勻，然后加入堿性溴水，得到混合物；二、向混合物中加入富勒烯的甲苯溶液，得到反應產(chǎn)物；三、先對反應產(chǎn)物進行萃取，然后采用凝膠色譜法進行洗脫，最后將收集的洗脫液，經(jīng)濃縮干燥即得到富勒烯氨基酸衍生物；本發(fā)明的優(yōu)點一、本發(fā)明制備富勒烯氨基酸衍生物生物活性高；二、實現(xiàn)了只含一個α氨基的氨基酸可以與富勒烯反應制備成富勒烯氨基酸衍生物。本發(fā)明主要用于制備富勒烯氨基酸衍生物。
文檔編號C07D203/02GK102503879SQ20111036526
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權日2011年11月17日
發(fā)明者李群, 李翠云, 胡楨, 趙生俊, 黃玉東 申請人:哈爾濱工業(yè)大學