專利名稱：一種連續分離唾液酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種連續分離唾液酸的方法，屬于生物制品分離純化技術領域。
技術背景
唾液酸(Sialic Acid，SA)是九碳糖神經氨酸酰化物的總稱，它廣泛存在于多種生物組織中。在大部分哺乳動物組織中發現的唾液酸主要是N-乙酰神經氨酸，所以通常把 N-乙酰神經氨酸稱為唾液酸。唾液酸在自然界分布很廣，已經發現許多生物體內存在唾液酸，它通常位于細胞膜最外層的糖類部分和分泌的糖復合物(糖脂、糖蛋白和脂多糖)的關鍵位置，是糖復合物結構和功能多樣化的重要物質基礎。
唾液酸的生物學功能有兩大類，即唾液酸本身能被識別的受體作用和掩蓋其它分子的掩蔽作用。近年來也發現，唾液酸及其衍生物在各種生命活動調節中起著重要的作用， 與許多疾病密切相關，在抑制唾液酸轉移酶和抗癌轉移、促進神經細胞增長與抗老年癡呆癥、抑制唾液酸酶與抗病毒、抑制白細胞薪附與抗炎等方面，此外唾液酸在控制細胞黏液濃度、抗識別、抗腫瘤等生理功能上也具有很大作用。
關于唾液酸的工業化制備方法主要有天然物抽提法和酶法合成。由于唾液酸在天然原料中含量比較低，天然物抽提法的分離提純過程比較復雜，收率較低，同時需要一些特殊的設備，造成的污染較大，這必然影響到唾液酸衍生物的開發和利用。酶法生產唾液酸具有轉化率高、提取簡單、產品純度高等優點，但對合成所用原料要求高，價格較為昂貴，與此同時唾液酸醛縮酶不易獲得，限制了生產規模的擴大。
在唾液酸酶法轉化液中，除了反應底物丙酮酸鈉、N-乙酰葡萄糖(GlcNAc)胺以及反應產物唾液酸，N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)等主要成分外，還有微生物細胞及其碎片、雜蛋白、無機鹽和色素等多種成分。因此選擇經濟合理的唾液酸的提取工藝對提高唾液酸的市場競爭力十分重要。已有報道的提取方法和分離方法主要有
1韓孝清(專利02110607. χ)發明了一種從蛋黃粉中提取唾液酸的方法。首先將蛋黃粉水解，水解液經加熱和絮凝除去蛋白，用強酸、弱堿樹脂除離子；再以強堿樹脂吸附唾液酸，甲酸做洗脫劑；最后洗脫液經濃縮結晶，烘干得到唾液酸成品。
2韓孝大(專利03115456. 5)選用乳清粉做原料，用超濾的方法除蛋白，后續提取步驟與韓孝清的類似。
3許平(專利200410024222. 3)等發明了一種以廉價乳酸鈉為前體，經多步耦聯生物轉化合成唾液酸以及通過離子交換分離純化唾液酸的方法。轉化液經酸化離心等預處理后，直接采用離子交換柱分離唾液酸，所用樹脂為ΗΖ201χ8，330和717等商業化強堿樹脂。 樹脂需先用1Ν-2Ν的NaOH溶液處理；再水洗；最后用1Ν-3Ν的甲酸溶液處理使樹脂轉成甲酸型。洗脫時，先用水，再用0. 5-3Ν的甲酸溶液進行梯度洗脫，收集1Ν-3Ν的洗脫流出液。 流出液經真空冷凍結晶得到唾液酸成品。
但從操作工藝和提取的經濟性分析，以上方法具有一定的缺陷。首先在現有的唾液酸生產工藝中，采用固定床離子交換技術，所采用的是間歇式操作方式，該技術存在多種弊端，由于該過程不連續，造成產率低，上柱樹脂的利用率低，洗脫劑消耗大，樹脂用量大， 廢水排放量大等缺點。同時，選用甲酸型樹脂做分離介質，樹脂預處理和再生步驟繁瑣，且甲酸具有腐蝕性，易污染唾液酸。因此發展高效率、低成本的唾液酸提取方法對促進唾液酸的產業化顯得至關重要。發明內容
本發明主要目的是克服現有技術中使用固定床離子交換技術分離唾液酸過程中存在生產成本大、操作繁瑣、分離純化效果不佳、不易規模化、只能間歇操作、不適宜工業化生產的不足。擬選用一種新型的分離介質，并基于這種介質開發一種連續分離唾液酸的方法。該工藝可以提高樹脂的利用率(接近95%)、減少洗脫劑的消耗，同時避免了樹脂的活化、再生，節約了酸堿的消耗，減少了廢液的排放。從而實現低成本、高收率、連續生產唾液酸的目的。
為達到上述目的，本發明所采用的技術方案如下
一種連續分離唾液酸的方法，所述的唾液酸是以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸鈉為底物通過微生物發酵制得，將發酵液通過過濾、超濾處理后得唾液酸清液，泵入裝有OH-型陰離子交換樹脂的連續離子交換系統中進行吸附，去離子水進行洗雜，氯化鈉溶液進行洗脫，氫氧化鈉溶液進行樹脂再生，收集含有唾液酸的洗脫液用乙醇水溶液浸取后再加入乙酸乙酯溶析結晶，晶體減壓干燥后即得唾液酸純品。
其中，所述的唾液酸的微生物發酵制備方法，是通過對含有sir (表達異構酶)的重組大腸桿菌和含有NanA(表達醛縮酶)的重組大腸桿菌的分別進行高密度培養，獲得兩種高表達的大腸桿菌菌體。37°C下，以N-乙酰葡萄糖胺(GlcNac)和過量的丙酮酸鈉為底物，加入獲得的兩種重組大腸桿菌混合培養3 催化合成唾液酸，具體參考文獻(Yinan Zhang, Fei Tao, Miaofen Du et al (2010) An efficient method for N-acetyl-D-neuraminic acid production using coupled bacterial cells with a safe temperature-induced system Appl Microbiol Biotechnol 86 :481-489)。
其中，所述的乳清酸水解液中，唾液酸的濃度為1 20g/L。
其中，所述的超濾處理，截留分子量為1萬 8萬道爾頓。
其中，所述的陰離子交換樹脂以苯乙烯-二乙烯苯共聚物為骨架，以季胺基 (-N+R3)為功能基團。
其中，所述的陰離子交換樹脂粒度為0. 315-1. 25mm，濕視密度為0. 66-0. 75g/ml， 含水量為42-48%。
其中，所述的連續離子交換系統是由6-60根離子交換柱串聯的連續操作的離子交換系統，通過組合式閥門將離子交換過程中的吸附、洗雜、洗脫和再生四個工段之間按順序切換，將吸附段離子交換柱在樹脂吸附飽和后立刻移出吸附段送入洗雜段進行洗雜，洗雜結束后立刻移出洗雜段進入洗脫段進行洗脫，洗脫完成后立刻移出洗脫段送入再生段進行再生，再生清洗完成后立刻移出再生段送入吸附段再進行吸附，如此循環的操作過程，且每個工段的第1根離子交換柱的狀態切換同步進行，并保證至少有一根離子交換柱處于吸附階段。
上述連續離子交換系統優選5-40根離子交換柱串聯，更優選8-M根離子交換柱串聯。
所述的連續離子交換系統中，吸附段、洗雜段、洗脫段和再生段的陰離子交換柱各自為1-20根，優選1-10根，更優選2-6根。
所述的連續離子交換色譜技術是采用轉盤帶動樹脂柱連續旋轉，并通過不同的分離區。樹脂柱連續變址通過每個槽口，通過槽口的物料及流量由各槽口分別控制。分配閥隨之同步轉動，將液體分配至樹脂柱中，并收集最終的產品。當吸附飽和的樹脂柱離開吸附區時，經再生和洗滌的新鮮樹脂床即隨即進入吸附區。在試驗中可以采用串聯方式來調整樹脂柱的數量，以確保出料質量和濃度的連續穩定。
其中，所述的氯化鈉溶液濃度為0. 001-2M，優選地0. 1-0. 8M ；所述的氫氧化鈉溶液濃度為0. 001-2M，優選地0. 1-2M。
其中，所述的乙醇水溶液濃度為5_40g/L，乙醇水溶液的加入量為洗脫液體積的 1-2 倍。
其中，乙酸乙酯加入量為乙醇水溶液與洗脫液混合體積的0. 1-1倍。
有益效果本發明所述的利用連續離子交換分離純化唾液酸的方法具有如下優占.^ \\\ ·
1)與傳統的離子交換系統相比，其設備緊湊，系統簡化，管道縮減，減少了 40%的占地面積，具有更好的靈活性，減少移動部件。
2)樹脂用量節約了 65%。其中樹脂總處于執行一項功能狀態。20%的樹脂總是處在吸附再生狀態，20%再生，30%洗雜/洗脫。
3)采用了堿類再生劑，提高了利用率而用量減少了 40%以上，產品收率達到99% 以上。
4)減少了 30-40%的再生液，40-50%的洗脫液，減少了 60%的廢液量。洗脫產率提高2-3倍，洗脫液的濃度提高了 5-10倍。
因此本發明的分離純化方法簡便易行，效果好，不僅其設備投資、運行成本低廉， 而且可以根據分離量的多少，實現從公斤級到噸級的分離，通過本發明所得產品在收率和產品質量方面都獲得了極好的結果，保證了產品品質。同時最大限度的減少再生液，洗雜液和洗脫液的用量。同時提高了分離產物的濃度，可以直接進行結晶純化。


圖1是本發明的連續離子交換系統處于狀態1的示意圖。
圖2是本發明的連續離子交換系統處于狀態2的示意圖。
圖3是pH值對唾液酸吸附量的影響示意圖。
圖4唾液酸的洗脫圖。
圖5唾液酸的生物合成圖。其中，兩種高表達的大腸桿菌菌體分別為E. coli K12/ pBVS, E. coli K12/pVN，差向異構酶為GlcNAc 2-異構酶，酸縮酶為Neu5Ac酸縮酶。
具體實施方式
根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
唾液酸的純度是通過高效液相色譜檢測得到。唾液酸的高效液相色譜分離的最佳條件為色譜柱a Bio-Rad Aminex HPX-87H column (300 X 7. 8mm)，流動相IOmM H2SO4,流速0. 4ml/min,檢測波長210nm，柱溫55°C，進樣體積為20 μ L。采用外標法定量。
以下實施例所用的陰離子交換樹脂以苯乙烯-二乙烯苯共聚物為骨架，以季胺基為功能基團，粒度為0. 315-1. 25mm，濕視密度為0. 66-0. 75g/ml，含水量為42-48%，由南京同凱兆業生物技術有限公司合成。
以下實施例所用的連續離子交換系統是由6-60根離子交換柱串聯的連續操作的離子交換系統，通過組合式閥門將離子交換過程中的吸附、洗雜、洗脫和再生四個工段之間按順序切換，將吸附段離子交換柱在樹脂吸附飽和后立刻移出吸附段送入洗雜段進行洗雜，洗雜結束后立刻移出洗雜段進入洗脫段進行洗脫，洗脫完成后立刻移出洗脫段送入再生段進行再生，再生清洗完成后立刻移出再生段送入吸附段再進行吸附，如此循環的操作過程，且每個工段的第1根離子交換柱的狀態切換同步進行，并保證至少有一根離子交換柱處于吸附階段。例如，采用吸附區為4根、洗雜區為4根、洗脫區為6根，再生區為4根的工藝形式。圖1、2表示了這種工藝形式的連續離子交換系統的運行過程，其中分別標注了吸附區，洗雜區，洗脫區，再生區，在圖1中，吸附區的離子交換柱中的第四根離子交換柱能保護整個離子交換柱的吸附區不會被上柱液穿透而造成損失，當吸附區的第一根離子交換柱即柱4吸附飽和后就會被移出吸附區，進入洗雜區進行洗雜，成為洗雜區的最后一根柱 (即圖2的狀態)，而洗雜區的第一根離子交換柱8此時在洗雜流速的控制下剛好洗雜完成，進入洗脫區，成為洗脫區的最后一根柱(即圖2的狀態)并且通過控制洗脫流速使得洗脫區的第一根柱14也洗脫結束，移入再生區的最后一根進行樹脂再生(即圖2的狀態)，再生段的第一根即柱18也再生完畢，移入吸附區的最后一根進行吸附(即圖2的狀態)。這樣通過控制各區的流速和閥門的切換，可以實現四個區保持同樣的節奏進行工作。各區的流速受各工段條件的影響，原則上是保證各工段同步運行，本領域普通技術人員可根據樹脂的狀態調整流動相的流速。通過控制各區流速及各區離子交換柱的根數來確定進出口切換時間，最終使整個系統各個區達到同步切換。
以下實施例唾液酸發酵液的制備方法如下
培養大腸桿菌的發酵培養基為普通的LB培養基(基于培養基的重量百分比計，胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉1%，PH值為7. 5，同時有必要的話可以添加0. lg/L 的青霉素)。培養方法E. coli K12來自于美國菌種保藏中心(簡稱ATCC-2M04，將其作為初始菌種構建重組的質粒，這些大腸桿菌菌種在37°C下培養)然后對通過對含有sir (表達異構酶)的重組大腸桿菌和含有NanA (表達醛縮酶)的重組大腸桿菌的分別進行高密度培養，獲得兩種高表達的大腸桿菌菌體，37°C下，以44. 24g/L N-乙酰葡萄糖胺(GlcNac)和過量的2. 2M的丙酮酸鈉作為底物和碳源，加入獲得的兩種重組大腸桿菌混合培養3 催化合成唾液酸。上述反應中唾液酸的產量為21. 2g/L。
實施例1
將發酵液經過過濾后再經截留分子量為1萬道爾頓的超濾膜去除大部分蛋白質， 將清液稀釋至唾液酸濃度為5g/L左右，泵入裝入陰離子交換樹脂的連續離子交換系統中。 采用由12根陰離子交換柱構成的連續離子交換系統，吸附區為3根，洗雜區為3根，洗脫區為4根，再生區為2根。其中每個區都可以采用串聯方式，以此來提高目標產物流出液的濃度。每根離子交換柱裝填IOOg樹脂。吸附流速為3ml/min，吸附容量為0. 341g/g濕樹脂； 洗雜液為去離子水，流速為;3ml/min，洗雜到流出液無雜質為止(用HPLC檢測確定洗雜區的第一根離子交換柱無雜質流出)；洗脫液為0. lmol/L的氯化鈉溶液，洗脫流速為-l/min， 洗脫完全(用HPLC檢測確定洗脫區的第一根離子交換柱洗脫完全)；同時將向位于再生區的離子交換柱中泵入濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液進行再生，再生完成后用去離子水淋洗至中性。唾液酸的洗脫液用10g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的體積為洗脫液的1倍， 浸取后用0. 2倍體積乙酸乙酯溶析結晶，得到純度為96%的唾液酸，收率為97. 2%。其中樹脂再生用去1. Omol/L的氫氧化鈉216ml，相對于單柱節約了 40%的再生液，同時洗脫用去0. IN氯化鈉210ml，相對于單柱節約了 30%的洗脫液。洗脫產率為0. 055g (唾液酸)/ g (樹脂的量)*min，相對于單柱洗脫產率提高了 1. 375倍，洗脫出來的唾液酸的濃度為原溶液的4倍。
實施例2
將發酵液經過過濾后再經截留分子量為3萬道爾頓的超濾膜去除大部分蛋白質， 將清液稀釋至唾液酸濃度為10g/L左右，泵入裝入陰離子交換樹脂的連續離子交換系統中。采用由14根陰離子交換柱構成的連續離子交換系統，吸附區為4根，洗雜區為3根，洗脫區為4根，再生區為3根。其中每個區都可以采用串聯的方式，以此來提高目標產物流出液的濃度。每根離子交換柱裝填400g樹脂。吸附流速為15ml/min，吸附容量為0. M4g/g濕樹脂；洗雜液為去離子水，洗雜流速為25ml/min，洗雜到流出液無雜質為止(用HPLC檢測確定洗雜區的第一根離子交換柱無雜質流出)；洗脫液為0. 5mol/L的氯化鈉溶液，洗脫流速為15ml/min，洗脫完全(用HPLC檢測確定洗脫區的第一根離子交換柱洗脫完全)；同時將向位于再生區的離子交換柱中泵入濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液進行再生，再生完成后用去離子水淋洗至中性。唾液酸的洗脫液用15g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的體積為洗脫液的1. 2倍，浸取后用0. 5倍體積乙酸乙酯溶析結晶，得到純度為97. 5%的唾液酸， 收率為98. 1%。其中樹脂再生用去1. Omol/L的氫氧化鈉208ml，相對于單柱節約了 42%的再生液，同時洗脫用去0. IN氯化鈉200ml，相對于單柱節約了 34%的洗脫液。洗脫產率為 0. 075g (唾液酸)/g (樹脂的量)*min，相對于單柱洗脫產率提高了 1. 875倍，洗脫出來的唾液酸的濃度為原溶液的5倍。
實施例3
將發酵液經過過濾后再經截留分子量為4萬道爾頓的超濾膜去除大部分蛋白質， 將清液稀釋至唾液酸濃度為15g/L左右，泵入裝入陰離子交換樹脂的連續離子交換系統中。采用由14根陰離子交換柱構成的連續離子交換系統，吸附區為4根，洗雜區為3根，洗脫區為4根，再生區為3根。其中每個區都可以采用串聯的方式，以此來提高目標產物流出液的濃度。每根離子交換柱裝填1. 2Kg樹脂。吸附流速為60ml/min，吸附容量為0. 244g/ g濕樹脂；洗雜液去離子水，洗雜流速為50ml/min，洗雜到流出液無雜質為止(用HPLC檢測確定洗雜區的第一根離子交換柱無雜質流出)；洗脫液為0. 8mol/L的氯化鈉溶液，洗脫流速為60ml/min，洗脫完全(用HPLC檢測確定洗脫區的第一根離子交換柱洗脫完全)；同時將向位于再生區的離子交換柱中泵入濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液進行再生，再生完成后用去離子水淋洗至中性。唾液酸的洗脫液用20g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的體積為洗脫液的1. 5倍，浸取后用0. 8倍體積乙酸乙酯溶析結晶，得到純度為98%的唾液酸，收率為98. 1%。其中樹脂再生用去1. Omol/L的氫氧化鈉200ml，相對于單柱節約了 44%的再生液，同時洗脫用去0. IN氯化鈉19^11，相對于單柱節約了 36%的洗脫液。洗脫產率為 0. 085g (唾液酸)/g (樹脂的量)*min，相對于單柱洗脫產率提高了 2. 125倍，洗脫出來的唾液酸的濃度為原溶液的6倍。
實施例4
將發酵液經過過濾后再經截留分子量為6萬道爾頓的超濾膜去除大部分蛋白質， 將清液稀釋至唾液酸濃度為20g/L左右，泵入裝入陰離子交換樹脂的連續離子交換系統中。采用由16根陰離子交換柱構成的連續離子交換系統，吸附區為4根，洗雜區為4根，洗脫區為4根，再生區為4根。其中每個區都可以采用串聯的方式，以此來提高目標產物流出液的濃度。每根離子交換柱裝填4Kg樹脂。吸附流速為200ml/min，吸附容量為0.308g/ g濕樹脂；洗雜液為去離子水，洗雜流速為160ml/min，洗雜到無雜質為止(用HPLC檢測確定洗雜區的第一根離子交換柱無雜質流出)；洗脫液為0. 5mol/L的氯化鈉溶液，洗脫流速為200ml/min，洗脫完全(用HPLC檢測確定洗脫區的第一根離子交換柱洗脫完全)；同時將向位于再生區的離子交換柱中泵入濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液進行再生，再生完成后用去離子水淋洗至中性。唾液酸的洗脫液用30g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的體積為洗脫液的1.8倍，浸取后用1倍體積乙酸乙酯溶析結晶，得到純度為99.4%的唾液酸，收率為98. 8%。其中樹脂再生用去1. Omol/L的氫氧化鈉IMml，相對于單柱節約了 46%的再生液，同時洗脫用去0. IN氯化鈉185ml，相對于單柱節約了 38. 5%的洗脫液。洗脫產率為 0. 105g (唾液酸)/g (樹脂的量)*min，相對于單柱洗脫產率提高了 2. 265倍，洗脫出來的唾液酸的濃度為原溶液的8倍。
實施例5
將發酵液經過過濾后再經截留分子量為8萬道爾頓的超濾膜去除大部分蛋白質， 將清液稀釋至唾液酸濃度為10g/L左右，泵入裝入陰離子交換樹脂的連續離子交換系統中。采用由18根陰離子交換柱構成的連續離子交換系統，吸附區為4根，洗雜區為4根，洗脫區為6根，再生區為4根。其中每個區都可以采用串聯的方式，以此來提高目標產物流出液的濃度。每根離子交換柱裝填8Kg樹脂。吸附流速為400ml/min，吸附容量為0. 328g/g濕樹脂，洗雜液為去離子水，洗雜流速為320ml/min ；洗雜到流出液無雜質為止(用HPLC檢測確定洗雜區的第一根離子交換柱無雜質流出)；洗脫液為0. 8mol/L氯化鈉的溶液，洗脫流速為400ml/min，洗脫完全(用HPLC檢測確定洗脫區的第一根離子交換柱洗脫完全)；同時將向位于再生區的離子交換柱中泵入濃度為1.5mol/L的氫氧化鈉溶液進行再生，再生完成后用去離子水淋洗至中性。唾液酸的洗脫液用40g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的體積為洗脫液的2倍，浸取后用0. 8倍體積乙酸乙酯溶析結晶，得到純度為99. 5%的唾液酸， 收率為99. 1%。其中樹脂再生用去1. Omol/L的氫氧化鈉180ml，相對于單柱節約了 50%的再生液，同時洗脫用去0. IN氯化鈉180ml，相對于單柱節約了 40%的洗脫液。洗脫產率為 0. 125g (唾液酸)/g (樹脂的量)*min，相對于單柱洗脫產率提高了 3. 125倍，洗脫出來的唾液酸的濃度為原溶液的10倍。
對比例1
與實施例5對比，進行單柱固定床吸附，洗雜和洗脫實驗，樹脂的填充量100g。唾液酸的發酵液上柱濃度5g/L，吸附流速為3mL/min，吸附容量為0. ^9g/g濕樹脂；洗雜區洗雜溶液為去離子水，流速為3ml/min，洗雜至無雜質為止(用HPLC檢測確定洗雜無雜質流出)；洗脫液為0. lmol/L氯化鈉溶液，洗脫流速為％il/min，洗脫完全(用HPLC檢測確定洗脫無唾液酸流出)；最后泵入濃度為1. Omol/L的氫氧化鈉溶液到需再生的離子交換柱進行再生，再生完成后用去離子水淋洗。唾液酸的洗脫液用10g/L無水乙醇浸取后用0. 2倍體積乙酸乙酯溶析結晶，得到純度為98. 6%的唾液酸，收率為97. 9%。而且實施例5樹脂再生用去1. Omol/L的氫氧化鈉200ml，對比例用去360ml，同時實施例5中洗脫用去0. IN氯化鈉 180ml，對比例中用去300ml。此時單柱的洗脫產率為0. 04g(唾液酸)/g (樹脂的量)*min。
權利要求
1.一種連續分離唾液酸的方法，所述的唾液酸是以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸鈉為底物通過微生物發酵制得，其特征在于，將發酵液通過過濾、超濾處理后得唾液酸清液，泵入裝有OH—型陰離子交換樹脂的連續離子交換系統中進行吸附，去離子水進行洗雜，氯化鈉溶液進行洗脫，氫氧化鈉溶液進行樹脂再生，收集含有唾液酸的洗脫液用乙醇水溶液浸取后再加入乙酸乙酯溶析結晶，晶體減壓干燥后即得唾液酸純品。
2.根據權利要求1所述的連續分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的唾液酸清液中， 唾液酸的濃度為1 20g/L。
3.根據權利要求1所述的連續分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的超濾處理去除大部分蛋白質，采用截留分子量為1萬 8萬道爾頓。
4.根據權利要求1所述的連續分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的陰離子交換樹脂以苯乙烯-二乙烯苯共聚物為骨架，以季胺基為功能基團。
5.根據權利要求1或4所述的連續分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的陰離子交換樹脂粒度為0. 315-1. 25mm，濕視密度為0. 66-0. 75g/ml，含水量為42-48 %。
6.根據權利要求1所述的連續分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的連續離子交換系統是由6-60根離子交換柱串聯的連續操作的離子交換系統，通過組合式閥門將離子交換過程中的吸附、洗雜、洗脫和再生四個工段之間按順序切換，將吸附段離子交換柱在樹脂吸附飽和后立刻移出吸附段送入洗雜段進行洗雜，洗雜結束后立刻移出洗雜段進入洗脫段進行洗脫，洗脫完成后立刻移出洗脫段送入再生段進行再生，再生清洗完成后立刻移出再生段送入吸附段再進行吸附，如此循環的操作過程，且每個工段的第1根離子交換柱的狀態切換同步進行，并保證至少有一根離子交換柱處于吸附階段。
7.根據權利要求6所述的連續分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的連續離子交換系統中，吸附段、洗雜段、洗脫段和再生段的陰離子交換柱各自為1-20根。
8.根據權利要求1所述的連續分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的氯化鈉溶液濃度為0. 001-2M ；所述的氫氧化鈉溶液濃度為0. 001-2M。
9.根據權利要求1所述的連續分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的乙醇水溶液濃度為5-40g/L，乙醇水溶液的加入量為洗脫液體積的1-2倍。
10.根據權利要求1所述的連續分離唾液酸的方法，其特征在于，乙酸乙酯加入量為乙醇水溶液與洗脫液混合體積的0.1-1倍。
全文摘要
本發明公開了一種連續分離唾液酸的方法，所述的唾液酸是以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸鈉為底物通過微生物發酵制得，將發酵液通過過濾、超濾處理后得唾液酸清液，泵入裝有OH-型陰離子交換樹脂的連續離子交換系統中進行吸附，去離子水進行洗雜，氯化鈉溶液進行洗脫，氫氧化鈉溶液進行樹脂再生，收集含有唾液酸的洗脫液用乙醇水溶液浸取后再加入乙酸乙酯溶析結晶，晶體減壓干燥后即得唾液酸純品。本發明的分離純化方法簡便易行，效果好，不僅運行成本低廉，而且可以根據分離量的多少，實現從公斤級到噸級的分離，通過本發明所得產品在收率和產品質量方面都獲得了極好的結果，保證了產品品質。
文檔編號C07H7/033GK102532208SQ20121000265
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者吳菁嵐, 應漢杰, 柏建新, 王裴, 胡亞南, 謝婧婧, 陳勇, 陳曉春 申請人:南京工業大學