專利名稱：一種用于治療糖尿病的融合蛋白及其制備方法
技術領域：
本發明涉及糖尿病治療藥物技術領域，特別涉及一種用于治療糖尿病的融合蛋白及其制備方法。
背景技術：
糖尿病是一種嚴重的自身代謝紊亂性疾病，可引起嚴重的心血管功能紊亂，具有高發病率和高死亡率等特點，嚴重危害人類健康和生存質量，給病人和社會造成了沉重的經濟負擔。據流行病學調查統計，目前全球糖尿病患者總數已逾1. 2億，其中90%左右為II 型糖尿病，而此數字還將不斷上漲，估計到2025年，世界范圍將有3億人患上糖尿病。因此， 特效糖尿病藥物的開發具有很高的社會效益和市場前景。目前I型糖尿病主要靠注射胰島素來進行治療，II型糖尿病的治療則以口服降糖藥為主，包括磺脲素藥物、雙胍類藥物、α-葡萄糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮衍生物類、以及注射用胰島素等，這些藥物的主要缺點是不良反應較大，長期使用會產生藥物耐受，如胰島素會引起低血糖的危險，其它口服藥物會引起肝、腎等主要臟器損傷，而且最終病人會對藥物產生耐受導致治療失敗，并且現在多是兩種或三種藥物聯合用藥，增加了患者的身體和經濟負擔。因此，利用新靶點和新治療方法開發出更加安全、有效的糖尿病藥物，如不引起低血糖且能改善病人β細胞功能等，是糖尿病藥物研究的熱點。目前，作為一種新機制及靶點，以腸促胰島素為基礎的新型糖尿病藥物被越來越多的生物研究機構及制藥公司關注。胰高血糖素樣肽(incretin-Glucagon-like-p ^tide-1，GLP-1)是體內穩定胰島素水平和胰高血糖素水平的關鍵調控因子之一。Exendin-4是從南美大毒蜥(Gila monster Heoderma suspectrum) 口腔分泌物中分離出的一種含有39 個氨基酸的多肽，與內源GLP-I具有53%的同源性，生物活性與內源性GLP-I相似。而且， 由于Exendin-4第2位為甘氨酸，而不是GLP-I的丙氨酸，Exendin-4進入體內后不受二肽基肽酶(DPP-IV)分解的影響，GLP-I在體內半衰期僅1 2分鐘，即被DPP-IV分解，相比于GLP-I，Exendin-4的藥效時間更長。在糖尿病動物模型上，無論口服、舌下含服、肺部、氣道還是鼻腔給予Exendin-4均有效。GLP-I受體激動劑Exendin-4在治療糖尿病方面具有獨特的作用機制它是以糖依賴方式調控血糖水平的，即高血糖時刺激胰島素的分泌，而低血糖時不刺激胰島素的分泌。因此，與其他糖尿病類藥物相比具有很多優勢①可以顯著降低糖化血紅蛋白水平和控制血糖水平；②由于其調控功能依賴血糖水平，因此不會導致低血糖的發生；③增強飽食感，降低食物過量攝入及減肥；④改善β細胞功能；⑤控制餐后高血糖的發生。從目前臨床數據反饋來看，不良反應輕微，大大提高了用藥安全。該靶點研究較為突出的如禮來公司的Byetta (合成Exendin-4)于2005年經FDA批準上市，諾和諾德公司的利拉魯肽 (Liraglutide，其為GLP-I模擬肽)于2010年1月經FDA批準上市。大量實驗資料及臨床數據已經證實，GLP-I及其類似物Exendin-4作為新型糖尿病治療藥物是安全、有效的。雖然，Exendin-4具有和GLP-I相同的生物學活性和優點(如前所述)，且具有較長于GLP-I的半衰期，但其半衰期仍較短，病人需要每天注射兩次，在實際使用中給病人帶來不便。因此，基于GLP-I及GLP-I受體激動劑Exendin-4開發出更為長效的糖尿病藥物是目前該領域研究的熱點。藥物長效化研究近年來被生物技術領域科學家廣泛關注。人們通過各種方式來延長多肽藥物的體內半衰期，常用方法如生物可降解材料緩釋制劑、氨基酸突變/修飾抗蛋白酶突變體、多肽PEG化修飾、重組融合蛋白如與人血清白蛋白融合、與免疫球蛋白Fc片斷融合等。IgG類免疫球蛋白(immunoglobulin G，IgG)是人體血液中最豐富的蛋白之一，其半衰期可達21天?，F已證實，IgG分子在體內半衰期長與其Fc段和新生Fc受體(Fcfoi)以 PH依賴的方式結合后再循環有關。目前，以與IgG分子Fc段融合來延長蛋白質藥物半衰期已經有許多成功例子上市,如Nplate, Orencia, Enbrel, Arcalyst, Amevive等。我國 SFDA也批準了一種Enbrel的類似藥品(益賽普)用來治療類風濕性關節炎及其相關疾病。 這些都進一步證實了蛋白質與IgG分子Fc段融合表達是提高藥物半衰期行之有效的方法。IgG類免疫球蛋白主要分為四個亞型，分別為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，其中尤以 IgGl型在人體內含量最高，其分子結構圖如說明書附1所示?，F有技術中也有采用胰高血糖素類似肽GLP-1、GLP-1突變體或與其至少50%同源性的同功因子(Exendin-4)與IgG Fc的融合蛋白用于預防和治療I型和II型糖尿病。然而，人免疫球蛋白的Fc區域在體內具有重要的生物學活性，如(1)與細胞表面的Fc受體 (FcyRs)結合，導致通過抗體依賴性細胞毒性作用(ADCC效應)，來有效的殺傷病原體或者惡性細胞；(2)與第一補體成分Clq部分結合，引發補體依賴的細胞毒性作用(CDC效應)來有效殺傷病原體；(3)通過與新生Fc受體(Fcfoi)以pH依賴的方式結合后再循環從而獲得長半衰期。作為藥物融合模式來提高半衰期時，IgG Fc片段的生物學效應中ADCC效應和 CDC效應是無用的，甚至是有害的，往往會造成不良反應的發生。另外，現有技術中GLP-I受體激動劑GLP-I或者Exendin-4與IgG的融合采用的是一個目的肽段與IgG融合，其比活性相對較低，有效劑量偏大，易造成不良反應風險提高，同時生產成本也較高。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種具有長效化特征的2-8個 Exendin-4-Linker柔性肽段與人IgG Fc突變體重組成的用于治療糖尿病的融合蛋白，其半衰期明顯延長，依從性好，有效減少病人的生理和心理負擔，使用安全且實用性強。本發明的另一目的是針對現有技術的不足而提供一種具有長效化特征的2個 Exendin-4-Linker柔性肽段與人IgG Fc突變體重組成的用于治療糖尿病的融合蛋白的制備方法，其工藝成熟，有利于實現產業化生產和銷售，制得的融合蛋白半衰期明顯延長，依從性好，有效減少病人的生理和心理負擔，使用安全且實用性強。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案。提供一種用于治療糖尿病的融合蛋白，所述融合蛋白為N個Exendin-4-Linker與人IgG Fc突變體重組成的融合蛋白N(Exendin-4-Linker)-人IgG Fc突變體；
其中，Linker為一組由疏水氨基酸組成的柔性肽段，其氨基酸的個數少于25個； 其中，人IgG Fc突變體為IgGl Fe、IgG2 Fc或IgG4 Fc突變體；
4其中，N為2-8個。Exendin-4，其為執行治療糖尿病的主要藥效靶點，其生物活性較穩定，不易分解， 通過和體內的GLP-I受體結合來促進胰島素的釋放，從而達到治療糖尿病的目的。Exendin-4的核酸序列如SEQ ID NO 1所示。Exendin-4的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。Linker (連接肽)為一組由疏水氨基酸組成的柔性肽段，其主要作用是將 Exendin-4分子和IgG Fc突變體連接且更好地降低Exendin-4功能區和IgG Fc突變體功能區之間的空間位阻，避免由于直接連接造成的空間位阻效應而使Exendin-4的活性下降，從而最大程度地保證Exendin-4與受體結合而發揮其生物學活性。Linker，通俗地講即為5_15個氨基酸(或者少于25個氨基酸)的柔性肽段，Linker 的存在是為了防止各活性區域直接連接后，由于空間位阻效應而使各活性區不能很好地與相應受體結合，而造成的活性下降，因此Linker的存在理論上要比沒有Linker更能很好地保留各活性區的活性功能，那么Linker的長短也是有一定限制的，該領域已經發表的文獻普遍支持氨基酸長度為小于25個氨基酸范圍內。IgG Fc突變體是本發明達到長效目的的主要功能區，其主要作用是通過 Exendin-4與其連接后，增大多肽的分子量，從而減少腎小球的濾過作用；同時由于Fc段可以與人體內Fcfoi受體結合而有效地延長Exendin-4的半衰期，同時為了降低天然IgG Fc 段帶來的不必要的ADCC效應和CDC效應，本發明根據IgG亞型中裂解活性最低的(即ADCC 效應和CDC效應最低)IgG2型Fc段的氨基酸序列進行了相應的突變。本發明的作用機理為EXendin-4與IgG Fc突變體融合可以有效提高多肽的分子量，避免了不必要的ADCC效應和⑶C效應，同時IgG Fc段可以通過和體內的Fcfoi受體結合而延長其在體內的半衰期。進一步地，所述融合蛋白為2個Exendin-4-Linker與人IgGl Fc突變體重組成的融合蛋白。由于有2個Exendin-4-Linker分子，在同等摩爾濃度下，該融合蛋白表現出比單個Exendin-4-Linker更高的生物學活性。其中，由于IgGl是人體中含量最多，從安全的角度考慮，所述人IgG Fc突變體優選為IgGl Fc突變體；IgGl Fc突變體的氨基酸的突變位置為Glu233ftx)/Leu234Val/ Leu235Ala/ Δ Gly236/Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser 中的一個突變位置或者至少兩個位置的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU編號系統(氨基酸殘基編號是按Kabat 等人所述的 EU 編號體系《SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST》第五版， United States Department of Health and Human Services,1991)。具體地，人IgGl Fc突變體的突變位置可以是Glu233Pro/Leu234Val/Leu2;35Ala/ Δ Gly236四個位置的組合突變位置，其能有效避免天然IgG Fc段帶來的不必要的ADCC效應。人IgGl Fc突變體的突變位置也可以是Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser三個位置的組合突變位置，其有效避免天然IgG Fc段帶來的不必要的⑶C效應。進一步優選地，人IgGl Fc突變體的突變位置是Glu233ftx)/Leu2;MVal/ Leu235Ala/AGly236 ；Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser 七個位置的組合突變位置，其能有效避免天然IgG Fc段帶來的不必要的ADCC效應和⑶C效應。其IgGl Fc突變體的核酸序列為如SEQ ID NO 3所示。
氨基酸突變位置的密碼子位置是按照和天然的IgGl Fc的核酸序列對比，但是，由于本序列是經過密碼子優化之后的序列，雖然每個密碼子對應翻譯出來的氨基酸還和天然的相同(突變位置除外)，但是整體核苷酸已經優化為最適宜于在哺乳動物類細胞CHO中表達。那么按照本行業所熟知的技術，即使上述各個功能區的天然核酸序列或者通過不同方式適度優化密碼子后的核酸序列，或者針對不同表達宿主如大腸桿菌、酵母、昆蟲和其它哺乳動物細胞而進行的密碼子優化，只要其對應的氨基酸未改變，都應視為和本發明相同，都屬于本發明的保護范圍。其IgGl Fc突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。突變后的氨基酸及其位置為Glu233ftO/Leu2;MVal/Leu2;35Ala/ Δ Gly236 ； Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser,其中突變位置編號依照EU編號系統。當然，人IgG Fc突變體的突變位置可以是上述七個位置中的任意一個位置或任意兩個位置或任意兩個位置以上結合的組合突變位置。本發明的融合蛋白的氨基酸序列以4個Exendin-4-Linker分子來表示時，該融合蛋白為4 (Exendin-4-Linker)-人IgG Fc突變體，當連接肽Linker分別為(Gly4Ser)3和 (Gly4Ser)I時，且人IgG Fc突變體為IgGl Fc突變體，其氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。本發明的融合蛋白的氨基酸序列以6個Exendin-4-Linker分子來表示時，該融合蛋白為6 (Exendin-4-Linker)-人IgG Fc突變體，當連接肽Linker分別為(Gly4Ser)3和 (Gly4Ser)I時，且人IgG Fc突變體為IgGl Fc突變體，其氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。因此，可以按照上面的示例依此類推出本發明所保護的融合蛋白N (Exendin-4-Linker)-人 IgG Fc 突變體的結構式，N=2_8。其中，所述Linker 為柔性肽段(Gly4Ser)n，n=l_5 或柔性肽段(AlaJer2)n, n=l_5。 當然，本發明中采用的柔性肽段Linker還可以是本領域的其他常用的Linker。Linker為柔性肽段GlyJer時，其氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示。Linker為柔性肽段AliiJer2時，其氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示。其中，所述融合蛋白為2個Exendin-4-Linker與人IgGl Fc Fc突變體重組成的融合蛋白；Linker為柔性肽段(GlyJer) n，n=l-5 ；IgGl Fc突變體的氨基酸的突變位置為 Glu233Pro/Leu234Val/Leu235Ala/ Δ Gly236 ；Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser 的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU編號系統。通過Linker柔性多肽鏈將Exendin-4 二聚體和IgGl Fc突變體連接，最大程度保留了 Exendin-4的生物學活性，同時最大程度降低了 Fc段的裂解活性造成的不良反應。利用作用靶點明確的Exendin-4 二聚體通過柔性肽Linker與人IgG FclFc突變體連接，通過基因工程的方法高效表達該融合蛋白，用于I型、II型糖尿病治療。通過IgGl Fc突變體可以有效的延長藥物半衰期的作用，避免不必要的ADCC效應和CDC效應帶來的不良反應，提高病人的依從性，減少病人的給藥次數，治療效果好。其作用機理為EXendin-4與IgGl Fc突變體融合可以有效提高多肽的分子量，從而減少腎小球的濾過作用；同時IgG Fc段可以通過和體內的Fcfoi受體結合而延長其在體內的半衰期。IgG Fc段是執行延長該融合蛋白半衰期的重要活性區域，該片段可以與體內的 Fcfoi受體結合通過再循環的方式來延長藥物的半衰期，理論上天然的IgG Fc (四個亞型)均具有該功能，然而由于天然IgG Fc片段還具有ADCC效應和CDC效應(該效應通常在治療性抗體上是關鍵的)，所以本發明對天然的IgG Fc片段進行了突變，以降低其ADCC效應和 CDC效應所帶來的不良反應。另外，IgGl Fc是目前使用最多的，研究也是最透徹的，而且它在體內的含量最高，所以在藥物使用方面也是最安全的，因此本發明采用人IgGl Fc進行突變。其中，所述融合蛋白為2個Exendin-4-Linker與人IgGl Fc突變體重組成的融合蛋白；其中，兩端分別與Exendin-4連接的Linker為柔性肽段(GlyJer)n, n=3 ；其中， 一端與Exendin-4連接且另一端與人IgGl Fc突變體連接的Linker為柔性肽段(GlyJer) η, η=1 ；其中，IgGl Fc突變體的氨基酸的突變位置為Glu233ftO/Leu2;MVal/Leu2;35Ala/ AGly236 ；Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU 編號系統。該融合蛋白 Exendin-4-Linker-Exendin-4-Linker-IgGl Fc 突變體的核苷酸序列如 SEQ ID NO 9 所示。該融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 10所示。其中，所述融合蛋白的表達載體為pOptiVEC-TOPO，所述融合蛋白在哺乳動物細胞中表達，所述細胞選自CHO細胞、HeLa細胞、BHK細胞。pOptiVEC-TOPO TA cloning Kit (Invitrogen /feBnn, catalog no. 12744—017)。優選地，所述CHO細胞為CHO DG44細胞(Invitrogen產品，catalog no.12609-012)。其中，所述融合蛋白在治療I型、II型糖尿病的應用。利用基因工程的方法制備了一種具有明顯長效化特征的治療I型、II型糖尿病的重組蛋白質藥物，該藥物能夠有效地降低糖尿病人的血糖和糖化血紅蛋白(HbAlc)，同時明顯延長其半衰期，擬定一周用藥一次，比現有市場上的糖尿病藥物(每天注射1-2次)具有更好的依從性，可以減少病人的心理和生理負擔。同時該融合蛋白具有突變的Fc片段，能夠最大程度降低天然IgG Fc所帶來的ADCC效應和CDC效應，從而有效降低藥物的不良反應。該發明與現有技術相比，具有更高的安全性和實用性。與其他糖尿病類藥物相比具有很多優勢①可以顯著降低糖基化血紅蛋白水平和控制血糖水平；②由于其調控功能依賴血糖水平，因此不會導致低血糖風險； ③增強飽食感，降低食物過量攝入及減肥；④改善β細胞功能；⑤控制餐后高血糖的發生。為實現上述另一目的，本發明采用如下技術方案。提供一種用于治療糖尿病的融合蛋白的制備方法，該方法包括在適于表達該融合蛋白的條件下培養權利要求6的宿主細胞，宿主細胞經細胞培養、離心后，上清液分別用親和層析、離子交換層析和分子篩層析純化；其中，親和層析中使用的是rProtein A Sepharose FF親和填料；其中，離子交換層析中使用的是Q Sepharose FF填料；其中，分子篩層析中使用的是Superdex 200填料。具體地，該融合蛋白的制備方法包括以下步驟
步驟(1)目的基因的獲得將Exendin-4的DNA序列、Linker的DNA序列和IgGl Fc突變體的DNA序列采用全基因合成的方式獲得目的基因DiExendin-4-Ig ；
步驟(2)克隆到合適的表達載體上目的基因DiExendin-4-Ig合成后，經PCR擴增后將其克隆入表達載體pOptiVEC-TOPO中；步驟(3)轉染合適的宿主細胞，進行表達宿主細胞為CHO DG44細胞，待PCR、雙酶切和測序鑒定正確后，將正確的克隆大量擴增并進行線性化以進行CHO DG44細胞轉染；
步驟(4)分離純化目的蛋白依次通過表達上清液預處理、親和層析、離子交換層析和分子篩層析相結合的純化工藝，經SDS-PAGE和HPLC檢測，其純度大于98%。本發明中采用的技術手段均參照《分子克隆實驗指南》和相關產品的《操作手冊》， 試劑均采用該領域所認可的生物試劑公司，如NEB、invitrogen、上海生工等。本發明中 Exendin-4的DNA序列、Linker的DNA序列和IgGl Fc突變體的DNA序列均采用全基因合成的方式獲得，并進行了密碼子優化以利于在宿主細胞CHO DG44細胞中高效表達。本發明的有益效果為
本發明的一種用于治療糖尿病的融合蛋白，融合蛋白為N個Exendin-4-Linker與人 IgG Fc突變體重組成的融合蛋白；Linker為一組由疏水氨基酸組成的柔性肽段，其氨基酸的個數少于25個；人IgG Fc突變體為IgGl Fe、IgG2 Fc或IgG4 Fc突變體；N為2_8個。 通過Linker柔性多肽鏈將Exendin-4和IgGl Fc突變體連接，最大程度保留了 Exendin-4 的生物學活性，其不僅具有Exendin-4可刺激胰島素的分泌、抑制餐后胰高血糖素的釋放的生物活性，同時最大程度降低了 Fc段的裂解活性造成的不良反應，具有延長其在血清中半衰期的特點，用于I型和II型糖尿病的治療，病人可以一周用藥一次，依從性好，有效減少病人的心理和生理負擔，使用安全且實用性強。本發明的用于治療糖尿病的融合蛋白的制備方法，該方法包括在適于表達該融合蛋白的條件下培養權利要求6的宿主細胞，宿主細胞經細胞培養、離心后，上清液分別用親和層析、離子交換層析和分子篩層析純化；其中，親和層析中使用的是rProtein A Sepharose FF親和填料；其中，離子交換層析中使用的是Q Sepharose FF填料；其中，分子篩層析中使用的是Superdex 200填料。本發明的工藝成熟，有利于實現產業化生產和銷售，制得的融合蛋白不僅具有 Exendin-4可刺激胰島素的分泌、抑制餐后胰高血糖素的釋放的生物活性，還具有延長其在血清中半衰期的特點，用于I型和II型糖尿病的治療，病人可以一周用藥一次，依從性好， 有效減少病人的心理和生理負擔，使用安全且實用性強。本發明的優點在于(1)本發明對融合的IgG Fc段基因進行突變修飾從而降低 ADCC效應、CDC效應，降低其裂解活性，有效避免天然IgG Fc帶來的不良反應。提高病人的依從性，減少病人給藥次數。(2)本發明利用作用靶點明確機制清楚的多聚Exendin-4通過柔性肽Linker與人IgG Fc突變體連接，通過基因工程的方法高效表達該融合蛋白，用于I型、II型糖尿病治療。最大程度保留了 Exendin-4的生物學活性，其不僅具有Exendin-4可刺激胰島素的分泌、抑制餐后胰高血糖素的釋放的生物活性，還具有延長其在血清中半衰期的特點，用于I 型和II型糖尿病的治療。(3)本發明創造了一種針對糖尿病治療的具有明顯長效化特征的基因工程重組蛋白藥物，該藥物能夠有效地降低糖尿病人的血糖和糖化血紅蛋白(HbAlc)，同時具有明顯延長的半衰期，擬定一周用藥一次，比現有市場上的糖尿病藥物(每天注射1-2次)具有更好的依從性，可以減少病人的心理和生理負擔。(4)本發明的用于治療糖尿病的融合蛋白的制備方法，工藝成熟，原料來源廣泛，有利于實現規?；a和銷售，具有廣泛的社會價值，經濟價值高，生產安全且實用性強。(5)本發明制得的用于治療糖尿病的融合蛋白具有①可以顯著降低糖基化血紅蛋白水平和控制血糖水平；②由于其調控功能依賴血糖水平，因此不會導致低血糖的危險； ③增強飽食感，降低食物過量攝入及減肥；④改善β細胞功能；⑤控制餐后高血糖的發生。


圖1是IgG分子的結構和主要功能區圖。圖2是本發明一種用于治療糖尿病的融合蛋白的四種融合蛋白的結構簡圖。圖3是本發明一種用于治療糖尿病的融合蛋白的pOptiVEC-DiExendin-4-Ig質粒 PCR驗證產物電泳圖，其中，1 :DL2000 Marker ；2 陰性對照(未加質粒)；3-10分別是編碼 1-8質粒的PCR結果。圖4是本發明一種用于治療糖尿病的融合蛋白的質粒pOptiVEC-DiExendin-4-Ig 雙酶切電泳結果圖，其中，1:DL2000 Marker ；2 Ikbp ladder marker ；3 pOptiVEC-DiExendin-4-Ig未酶切質粒；4-11分別是編號為1-8質粒雙酶切結果。圖5是本發明一種用于治療糖尿病的融合蛋白的重組DiExendin-4-Ig融合蛋白 HPLC純度分析圖。圖6是本發明一種用于治療糖尿病的融合蛋白的重組DiExendin-4-Ig融合蛋白 SDS-PAGE分析圖，從左至右依次為蛋白MARKER、還原電泳和非還原電泳。圖7是本發明一種用于治療糖尿病的融合蛋白的重組DiExendin-4-Ig融合蛋白刺激RIN-5F細胞cAMP生成圖。圖8是本發明一種用于治療糖尿病的融合蛋白的融合蛋白DiExendin-4-Ig對正常ICR小鼠血糖曲線下面積的第1天的影響。圖9是本發明一種用于治療糖尿病的融合蛋白的融合蛋白DiExendin-4-Ig對正常ICR小鼠血糖曲線下面積的第2天的影響。圖10是本發明一種用于治療糖尿病的融合蛋白的融合蛋白DiExendin-4-Ig對正常ICR小鼠血糖曲線下面積的第3天的影響。圖11是本發明一種用于治療糖尿病的融合蛋白的融合蛋白DiExendin-4-Ig對正常ICR小鼠血糖曲線下面積的第4-6天的影響。圖12是本發明一種用于治療糖尿病的融合蛋白的融合蛋白DiExendin-4-Ig對正常ICR小鼠血糖曲線下面積的第7-9天的影響。圖13是本發明一種用于治療糖尿病的融合蛋白的融合蛋白DiExendin-4-Ig對正常ICR小鼠血糖曲線下面積的第10-14天的影響。圖14是本發明一種用于治療糖尿病的融合蛋白的融合蛋白DiExendin-4-Ig對正常ICR小鼠血糖曲線下面積的第16-20天的影響。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的說明。實施例1
如圖2所示，本實施例中，用于治療糖尿病的融合蛋白為2個Exendin-4-Linker與人IgG Fc突變體重組成的融合蛋白；Linker柔性肽段為(GlyJer)n, n=l-5 ；人IgG Fc突變體為IgGl Fc突變體，IgGl Fc突變體的氨基酸的突變位置為Glu233ftx)/Leu234Val/ Leu235Ala/AGly236 ；Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser 的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU索引。其中，兩端分別與Exendin-4連接的Linker為柔性肽段(GlyJer) η, η=3 ； 其中，一端與Exendin-4連接且另一端與人IgGl Fc Fc突變體連接的Linker為柔性
肽段(GlyJer )n，n=l。實施例2
如圖2所示，本實施例中，用于治療糖尿病的融合蛋白為2個Exendin-4-Linker與人 IgG Fc突變體重組成的融合蛋白；Linker柔性肽段為(Gly4Ser)n，n=l-5 ；人IgG Fc突變體為IgGl突變體，IgGl Fc突變體的氨基酸的突變位置為Glu233ftx)/Leu2;MVal/Leu235Ala/ AGly236 ；Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU 索引。其中，兩端分別與Exendin-4連接的Linker為柔性肽段(GlyJer) η, η=4 ； 其中，一端與Exendin-4連接且另一端與人IgGl Fc突變體連接的Linker為柔性肽段
(Gly4Ser) η, η=2。實施例3
如圖2所示，本實施例中，用于治療糖尿病的融合蛋白為2個Exendin-4-Linker與人 IgG Fc突變體重組成的融合蛋白；Linker柔性肽段為(Gly4Ser)n，n=l-5 ；人IgG Fc突變體為IgGl突變體，IgGl Fc突變體的氨基酸的突變位置為Glu233ftx)/Leu2;MVal/Leu235Ala/ AGly236 ；Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU 索引。其中，兩端分別與Exendin-4連接的Linker為柔性肽段(GlyJer) η, η=3 ； 其中，一端與Exendin-4連接且另一端與人IgGl Fc突變體連接的Linker為柔性肽段
(Gly4Ser) η, η=3。實施例4
如圖2所示，本實施例中，用于治療糖尿病的融合蛋白為2個Exendin-4-Linker與人 IgG Fc突變體重組成的融合蛋白；Linker柔性肽段為(Gly4Ser)η，η=1-5 ；人IgG Fc突變體為IgGl突變體，IgGl Fc突變體的氨基酸的突變位置為Glu233ftx)/Leu2;MVal/Leu235Ala/ AGly236 ；Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU 索引。其中，兩端分別與Exendin-4連接的Linker為柔性肽段(GlyJer) η, η=5 ； 其中，一端與Exendin-4連接且另一端與人IgGl Fc突變體連接的Linker為柔性肽段
(Gly4Ser) η, η=3。實施例5
本實施例中，用于治療糖尿病的融合蛋白為2個Exendin-4-Linker與人IgG Fc突變體重組成的融合蛋白；Linker柔性肽段為(GlyJer) η, η=1-5 ；人IgG Fc突變體為IgGl突變體，IgGl Fc 突變體的氨基酸的突變位置為 Glu233Pro/Leu234Val/Leu2;35Ala/ Δ Gly236 ； Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU索引。
10
實施例6
本實施例中，用于治療糖尿病的融合蛋白為2個Exendin-4-Linker與人IgG Fc突變體重組成的融合蛋白；Linker柔性肽段為(AlaJer2)n,n=l-5 ；人IgG Fc突變體為IgGl突變體，IgGl Fc 突變體的氨基酸的突變位置為 Glu233Pro/Leu234Val/Leu2;35Ala/ Δ Gly236 ； Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU編號系統。實施例7
本實施例中，用于治療糖尿病的融合蛋白為4個Exendin-4-Linker與人IgG Fc突變體重組成的融合蛋白；Linker柔性肽段為(GlyJer) η, η=1-5 ；人IgG Fc突變體為IgGl突變體，IgGl Fc 突變體的氨基酸的突變位置為 Glu233Pro/Leu234Val/Leu2;35Ala/AGly236 ； Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU索引。實施例8
本實施例中，用于治療糖尿病的融合蛋白為8個Exendin-4-Linker與人IgG Fc突變體重組成的融合蛋白；Linker柔性肽段為(GlyJer) η, η=1-5 ；人IgG Fc突變體為IgGl突變體，IgGl Fc 突變體的氨基酸的突變位置為 Glu233Pro/Leu234Val/Leu2;35Ala/ Δ Gly236 ； Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU索引。實施例9
一種用于治療糖尿病的融合蛋白的制備方法，該方法包括在適于表達該融合蛋白的條件下培養權利要求6的宿主細胞，宿主細胞經細胞培養、離心后，上清液分別用親和層析、 離子交換層析和分子篩層析純化；其中，分子篩層析中使用的是Superdex 200填料。其中， 親和層析中使用的是rfrotein A Sepharose FF親和填料；其中，離子交換層析中使用的是 Q Sepharose FF 填料。具體地，該融合蛋白的制備方法包括以下步驟
步驟(1)目的基因的獲得將Exendin-4的DNA序列、Linker的DNA序列和IgGl Fc突變體的DNA序列采用全基因合成的方式獲得目的基因DiExendin-4-Ig ；
步驟(2)克隆到合適的表達載體上目的基因DiExendin-4-Ig合成后經PCR擴增后， 將其克隆入表達載體pOptiVEC-TOPO中；
步驟(3)轉染入合適的宿主細胞中進行表達宿主細胞為CHO DG44細胞，待PCR、雙酶切和測序鑒定正確后，將正確的克隆大量擴增并進行線性化以進行CHO DG44細胞細胞轉染；
步驟(4)分離純化目的蛋白依次通過表達上清液預處理、親和層析、離子交換層析和分子篩層析相結合的純化工藝，經SDS-PAGE和HPLC檢測，其純度大于98%。實驗例1 重組DiExendin-4-Ig融合蛋白的設計及表達載體 pOptiVEC-DiExendin-4-Ig 的構建
1.重組DiExendin-4-Ig融合蛋白的設計。本發明根據哺乳動物細胞使用密碼子的偏愛性，已知Exendin-4片段和突變后人 IgGl Fc片段的氨基酸序列，設計了一段新的重組DiExendin-4-Ig融合蛋白，該融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0:11所示。其中前10位堿基是KOZAK序列，第11_67位堿基為小鼠Ig heavy chain的信號肽密碼子，第68-184、230-346位堿基為Exendin-4密碼子，第185_2四、347_361位堿基為連接肽密碼子，362-1039為堿基為人IgGl Fc突變體密碼子，最后三位堿基為終止密碼子。該融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :12所示，其中前19個氨基酸(劃線部分) 為信號肽序列。將設計好的上述序列采用全基因合成的方法制備。合成完成后，按照下面的PCR 體系擴增目的基因。100 μ 1 PCR 反應體系
權利要求
1.一種用于治療糖尿病的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為N個Exendin-4-Linker與人IgG Fc突變體重組成的融合蛋白；其中，Linker為一組由疏水氨基酸組成的柔性肽段，其氨基酸的個數少于25個；其中，人IgG Fc突變體為IgGl Fe、IgG2 Fc或IgG4 Fc突變體；其中，N為2-8個。
2.根據權利要求1所述的一種用于治療糖尿病的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白為2個Exendin-4-Linker與人IgGl Fc突變體重組成的融合蛋白。
3.根據權利要求1所述的一種用于治療糖尿病的融合蛋白，其特征在于所述人IgG Fc突變體為IgGl Fc突變體；IgGl Fc突變體的氨基酸的突變位置為Glu233ft~0/Leu234Val/Leu235Ala/ Δ Gly236/Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser 中的一個突變位置或者至少兩個位置的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU編號系統。
4.根據權利要求1所述的一種用于治療糖尿病的融合蛋白，其特征在于所述Linker為柔性肽段(GlyJer) η, η=1_5 或柔性肽段(Ala3Ser2) η, η=1_5。
5.根據權利要求2所述的一種用于治療糖尿病的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白為2個Exendin-4-Linker與人IgGl Fc突變體重組成的融合蛋白；其中，Linker 為柔性肽段(Gly4Ser) η, η=1_5 ；其中，IgGl Fc突變體的氨基酸的突變位置為Glu233ftO/Leu2;MVal/Leu235Ala/AGly236/Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU編號系統。
6.根據權利要求5所述的一種用于治療糖尿病的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白為2個Exendin-4-Linker與人IgGl Fc突變體重組成的融合蛋白；其中，兩端分別與Exendin-4連接的Linker為柔性肽段(GlyJer) η, η=3 ；其中，一端與Exendin-4連接且另一端與人IgGl Fc突變體連接的Linker為柔性肽段(Gly4Ser) η, η=1 ；其中，IgGl Fc突變體的氨基酸的突變位置為Glu233ftO/Leu2;MVal/Leu235Ala/AGly236/Ala327Gly/Ala330Ser/Pro331Ser的組合突變位置，其中突變位置編號依照EU編號系統。
7.根據權利要求1所述的一種用于治療糖尿病的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的表達載體為pOptiVEC-TOPO，所述融合蛋白在哺乳動物細胞中表達，所述細胞選自CHO細胞，HeLa細胞和BHK細胞。
8.根據權利要求1-7中任意一項所述的一種用于治療糖尿病的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白在治療I型、II型糖尿病的應用。
9.一種用于治療糖尿病的融合蛋白的制備方法，其特征在于該方法包括在適于表達該融合蛋白的條件下培養權利要求6的宿主細胞，宿主細胞經細胞培養、離心后，上清液分別用親和層析、離子交換層析和分子篩層析純化；其中，親和層析中使用的是rProtein A Sepharose FF親和填料；其中，離子交換層析中使用的是Q Sepharose FF填料；其中，分子篩層析中使用的是Superdex 200填料。
全文摘要
本發明涉及糖尿病治療藥物技術領域，特別涉及一種用于治療糖尿病的融合蛋白及其制備方法，融合蛋白為2-8個Exendin-4-Linker與人IgGFc突變體重組成的融合蛋白；Linker為柔性肽段；人IgGFc突變體為IgG1Fc、IgG2Fc或IgG4Fc突變體；本發明還公開了其制備方法，在CHO細胞中高效表達，通過親和、離子交換和分子篩層析得到的重組融合蛋白，其不僅具有Exendin-4可刺激胰島素的分泌、抑制餐后胰高血糖素的釋放的生物活性，還具有延長其在血清中半衰期的特點，用于Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的治療，有效減少病人的心理和生理負擔，使用安全且實用性強，可規?；a銷售。
文檔編號C07K1/22GK102558362SQ20121003785
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月17日 優先權日2012年2月17日
發明者沈虹 申請人:東莞金朗生物科技有限公司