專利名稱：一種蛋清抗氧化肽及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種蛋清抗氧化肽及其制備方法。
背景技術：
中國是世界上最大蛋品生產和消費國，2005年全國城鎮居民家庭年消費鮮雞蛋 11. 14公斤/人，大大超過世界平均水平。雞蛋不僅營養豐富，且含大量具抗菌、抗病毒、抗癌癥、調節免疫等多種生理活性物質。如溶菌酶、抗生物素蛋白、卵鐵傳遞蛋白、特異性免疫球蛋白(IgY)和卵磷脂等備受關注，對人類健康起著非常重要的作用。有些已產業化并在醫學、營養保健和功能食品等方面具有廣泛的應用前景。隨著禽蛋產量大幅度增長，蛋品加工深度與技術含量不斷提高。到目前為止，主要有三種蛋清深加工方法，即傳統理化加工法、微生物發酵法以及蛋白酶體外酶解法。雞蛋清經蛋白酶適宜酶解后，除可在一定程度上改善其功能特性和降低過敏原性蛋白的抗原性外，還可產生一些具有特殊生物學活性的小肽。國內外學者關于蛋清蛋白酶解產物抗腫瘤、 抗高血壓、免疫調節等研究取得顯著成果。而對蛋清酶解產物抗氧化性的研究相對較少，更缺乏系統性。

發明內容
本發明以蛋清粉為原料，采用現代生物技術，以雞蛋清蛋白為原料，研究雞蛋清酶解產物的抗氧化性，采用超濾、離子交換和凝膠過濾等分離手段分離制備出了具抗氧化活性的生物活性肽-蛋清抗氧化肽，并對其抗氧化活性進行綜合評價。本發明的一方面在于，蛋清抗氧化肽的制備方法的技術方案包括如下步驟①蛋清酶解液制備將蛋清粉溶于磷酸鹽緩沖液中配制成蛋清液，蛋清液熱變性后冷卻；再按 10000U/g蛋白的比例向上述蛋清液中加入堿性蛋白酶，并用磷酸鹽緩沖液稀釋上述蛋清液濃度至8 12mg/mL,置于45 55°C反應4 6h ;再于沸水浴中滅酶,離心取上清液，即為蛋清酶解液；其中，上述磷酸鹽緩沖液為O. 05mol/L、pH8. O ；②超濾超濾分離步驟①獲得的蛋清酶解液，收集分子量< 3k Da的組分，濃縮；③DEAE-52離子柱層析由步驟②獲得的產物，經DEAE-52離子柱層析，依次以O. 00,0. 02,0. 05,0. 10、 O. 20mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，根據280nm處的吸光值圖譜，分別收集洗脫下來的各蛋白峰對應的組分，收集以O. 02mol/L NaCl溶液作為洗脫液的蛋白峰，濃縮；④Sephadex G-25凝膠柱層析步驟③所得的產物，經S印hadex G_25凝膠柱層析，洗脫液為蒸餾水，根據280nm 處的吸光值圖譜，分別收集洗脫下來的各蛋白峰對應的組分，其中平均分子量為273Da的蛋白峰為蛋清抗氧化肽。具體的，在上述的制備方法中，步驟①所述的蛋清液，是由蛋清粉溶于O. 05mol/L、 pH8. O磷酸鹽緩沖液中配制成濃度為80 150mg/mL。具體的，在上述的制備方法中，步驟①所述的熱變性的條件為，于80 90°C變性 25 35min。具體的，在上述的制備方法中，步驟①所述的沸水滅酶的時間為5 15min。具體的，在上述的制備方法中，步驟①所述的離心條件為3500 4500r/min離心 10 20min。具體的，在上述的制備方法中，步驟①所述的冷卻溫度為45 55°C。具體的，在上述的制備方法中，步驟②所述的超濾為在O. 3MPa條件下，用分子量為3kDa超濾膜超濾。具體的，在上述的制備方法中，步驟②所述的濃縮為真空濃縮至濃度為8 12mg/mL。具體的，在上述的制備方法中，步驟③所述的濃縮為真空濃縮至濃度為3 6mg/
mLo本發明的另外一方面在于，利用上述的制備方法制備得到的蛋清抗氧化肽。本發明突出效果為采用酶解、超濾、離子交換和凝膠過濾等生物技術手段，制備高活性的蛋清抗氧化肽，工藝技術路線合理。將蛋清粉水解為多肽物質，研究其抗氧化性， 并經過超濾、離子交換和凝膠過濾分離手段得到較純的具抗氧化活性的多肽，同時降低蛋白的抗原性，改善其功能特性，而且更利于吸收。該產品還可抑制和清除自由基，調整和改善生理功能，可應用于研制預防和治療慢性疾病藥物。為提高蛋清蛋白附加值、雞蛋深加工及應用開辟新途徑，市場前景廣闊。


圖1DEAE-52離子交換層析分離HEW-2洗脫圖譜；圖2DEAE-52分離各組分的超氧陰離子清除能力；圖3S印hadex G-25凝膠色譜分離HEW-2-2洗脫圖譜；圖4Sephadex G-25分離各組分的超氧陰離子清除能力；圖5蛋清抗氧化肽分離純化薄層層析圖，其中，I-未純化蛋清酶解液HEW ;2_經 3kDa超濾膜分離后抗氧化組分HEW-2 ;3_經DEAE-52離子交換層析后抗氧化組分HEW-2-2 ； 4-經S印hadex G-25凝膠過濾層析后抗氧化組分HEW-2-2-3。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。本發明實施例中所涉及的各試劑，如無特殊說明，均屬于常規試劑，可從商業途徑獲得。O. 05mol/L ρΗ8· O磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖溶液)50. OmL
O.2mol/L KH2PO4 溶液加入 46. 80mL O. 2mol/L NaOH，定容至 200mL。
蛋清粉、堿性蛋白酶蛋清粉購自大連韓偉食品有限公司，堿性蛋白酶購自無錫酶制劑廠；實施例II.蛋清酶解液制備蛋清粉和堿性蛋白酶分別溶于磷酸鹽緩沖液(O. 05mol/L, pH8. O)中備用，初始濃度均為100mg/mL。蛋清液85°C，變性30min，冷至50°C，分別測定蛋清液的蛋白含量及堿性蛋白酶的酶活性，然后按照10000U/g蛋白的比例加入酶液，用上述磷酸鹽緩沖液 (0. 05mol/L, pH8. 0)控制蛋清液終濃度為10mg/mL，50°C反應5h，沸水滅酶10min，4000r/ min離心15min,取上清液，即為蛋清酶解液,用HEW (Hydrolysates from Egg White)表示。2.超濾用3kDa超濾膜分離蛋清酶解液，在0. 3MPa下將蛋清酶解液分離成> 3kDa的截留液HEW-I和< 3kDa的透過液HEW-2，測定兩部分抗氧化性，濃縮備用。超濾組分抗氧化性測定。用3kDa超濾膜將HEW分成HEW-I和HEW-2兩部分。在5mg/ mL相同濃度下，HEW、HEW-1和HEW-2的超氧陰離子清除率分別為12. 75%,8. 41%U5. 94%。 由此看出，HEW-2比HEW具更強的超氧陰離子清除能力。文獻也表明，分子量< 3kDa多肽的抗氧化性更為理想。超濾分離出具較強抗氧化性組分HEW-2，經過真空濃縮至10mg/mL，再經DEAE-52 離子柱層析分離。3. DEAE-52離子交換層析超濾分離出強抗氧化活性的部分經DEAE-52離子交換層析(40X 200mm)，洗脫液依次為0. 00,0. 02,0. 05,0. 10,0. 20mol/L NaCl水溶液，進行梯度洗脫。上樣濃度10mg/mL, 上樣體積5mL，洗脫速度80mL/h，部分收集器每管收集4mL，檢測收集液280nm處吸光度和抗氧化性，判斷抗氧化肽分離效果，將各組分合并濃縮，備用。由圖I可知，HEW-2經DEAE-52離子交換層析分離，不同鹽濃度洗脫液梯度洗脫得到5個蛋白峰，分別為HEW-2-1 (蒸餾水洗脫峰)、HEW-2-2 (0. 02mol/mL NaCl洗脫峰)、HEW-2-3(0. 05mol/mLNaCl 洗脫峰)、HEff-2-4(0. 10mol/mL NaCl 洗脫峰)和 HEW-2-5 (0. 20mol/mLNaCl 洗脫峰)。各分離組分對超氧陰離子的清除率如圖2所示，在0. 5mg/mL濃度時，HEW-2-1無清除活性，HEW-2-2清除率為2. 08%, HEff-2-3清除率為I. 19%, HEff-2-4清除率為0. 30%, HEW-2-5清除率為0. 60%。可見，組分HEW-2-2對超氧陰離子清除能力最強。重復上述步驟,制備大量HEW-2-2組分,真空濃縮至5mg/mL,再經Sephadex G-25 凝膠色譜分離。4. Sephadex G-25 凝膠色譜DEAE-52離子交換層析分離得具較強抗氧化性組分經Sephadex G_25凝膠色譜柱 (13 X 440mm)進一步分離，洗脫液為蒸餾水，組分HEW-2-2的上樣濃度5mg/mL，上樣體積為 ImL,洗脫速度40mL/h,部分收集器每管收集ImL,檢測收集液在280nm處的吸光值和抗氧化性來判斷抗氧化肽分離效果，將各組分合并濃縮，備用。由圖3可知,HEW-2-2經Sephadex G_25凝膠層析分離獲得3個組分,根據凝膠層析分離原理，先流出的蛋白峰比后流出的蛋白峰分子量大，因此三個蛋白峰平均分子量由大到小的順序依次為HEW-2-2-l > HEff-2-2-2 > HEW-2-2-3。各組分對超氧陰離子的清除率如圖4所示，在O. 5mg/mL蛋白濃度下，HEW-2-2-1的清除率為O. 59 %, HEff-2-2-2的清除率為I. 20%,HEff-2-2-3清除率最高，達到2. 41 %，是HEW-2-2-1的4. I倍。從峰面積上看，HEW-2-2-3的含量也最多。可見，經Sephadex G-25凝膠色譜分離能得到活性較強的蛋清抗氧化肽HEW-2-2-3。由此可見，分子量< 3kDa的蛋清酶解多肽，經逐步分離得到抗氧化性較強的多肽，其分子量相對較小。5.薄層層析鑒定雞蛋清抗氧化肽純度薄層層析時用硅膠板作支持物，正丁醇冰醋酸水(3 : I : I)作展開劑，其中加入O. 4%茚三酮。層析后在85°C顯色15min。由薄層層析圖5可看出，未經純化的雞蛋清酶解液是各種肽和氨基酸的混合物， 各組分別遷移率不同，故經染色劑染色后連成一片(圖5中的I);經超濾分離后，從薄層層析結果(圖5中的2)可以看出減少了很多條帶，說明已經除去大量雜蛋白j5DEAE-52纖維素離子交換層析分離得到的強抗氧化組分HEW-2-2，薄層層析染色后呈現3個點(圖5中的3),初步確定其由3個組分組成；最后經Sephadex G_25凝膠色譜分離出蛋清抗氧化肽 HEW-2-2-3，在薄層層析中呈現單一點(圖5中的4)，說明蛋清抗氧化肽已基本上得到純化， 且通過凝膠色譜估測其相對分子量約為273Da。由表I所示雞蛋清酶解液經過逐步分離純化，對超氧陰離子IC5tl由33.41mg/ mL降低到5. 63mg/mL，最終純化倍數達到5. 63，分離得到薄層層析純度的蛋清抗氧化肽 HEW-2-2-3，其對超氧陰離子IC5tl為5. 63mg/mL，蛋白回收率為13. 42%。表I雞蛋清抗氧化肽的分離純化
權利要求
1.一種蛋清抗氧化肽的制備方法，其特征在于其方法包括①蛋清酶解液制備將蛋清粉溶于磷酸鹽緩沖液中配制成蛋清液，蛋清液熱變性后冷卻；再按ιοοοου/g蛋白的比例向上述蛋清液中加入堿性蛋白酶，并用磷酸鹽緩沖液稀釋上述蛋清液濃度至8 12mg/mL,置于45 55°C反應4 6h ;再于沸水浴中滅酶,離心取上清液，即為蛋清酶解液；其中，上述磷酸鹽緩沖液為O. 05mol/L、pH8· O ；②超濾超濾分離步驟①獲得的蛋清酶解液，收集分子量< 3k Da的組分，濃縮；③DEAE-52尚子柱層析由步驟②獲得的產物，經DEAE-52離子柱層析，依次以O. 00,0. 02,0. 05,0. 10、O.20mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，根據280nm處的吸光值圖譜，分別收集洗脫下來的各蛋白峰對應的組分，收集以O. 02mol/L NaCl溶液作為洗脫液的蛋白峰，濃縮；④SephadexG-25凝膠柱層析步驟③所得的產物，經S印hadex G-25凝膠柱層析，洗脫液為蒸餾水，根據280nm處的吸光值圖譜，分別收集洗脫下來的各蛋白峰對應的組分，其中平均分子量為273Da的蛋白峰為蛋清抗氧化肽。
2.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟①所述的蛋清液，由蛋清粉溶于O.05mol/L、pH8. O磷酸鹽緩沖液中配制成濃度為80 150mg/mL。
3.根據權利要求I或2所述的制備方法，其特征在于步驟①所述的熱變性的條件為，于 80 90°C變性 25 35min。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟①所述的沸水滅酶的時間為5 15min。
5.根據權利要求I或4所述的制備方法，其特征在于步驟①所述的離心條件為3500 4500r/min 離心 10 20min。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟①所述的冷卻溫度為45 55°C。
7.根據權利要求I或6所述的制備方法，其特征在于步驟②所述的超濾為在O.3MPa 條件下，用分子量為3kDa超濾膜超濾。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于步驟②所述的濃縮為真空濃縮至濃度為8 12mg/mL。
9.根據權利要求I或8所述的制備方法，其特征在于步驟③所述的濃縮為真空濃縮至濃度為3 6mg/mL。
10.如權利要求I所述的制備方法制備出的蛋清抗氧化肽。
全文摘要
本發明公開一種蛋清抗氧化肽的制作方法。主要以雞蛋蛋清粉為原料，經熱變性、酶解、超濾、離子交換、凝膠過濾、真空濃縮干燥等工藝分離純化得到高活性的蛋清抗氧化肽。本方法用堿性蛋白酶將雞蛋清酶解，分離得到低分子量、具高抗氧化活性的蛋清酶解肽，除降低蛋白的抗原性，改善其功能特性，且更利于吸收外，該產品還可抑制和清除自由基，調整和改善生理功能，可應用于研制預防和治療慢性疾病藥物。為提高蛋清蛋白附加值、雞蛋深加工及應用開辟新途徑，市場開發前景廣闊。
文檔編號C07K1/34GK102586376SQ201210045000
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月24日 優先權日2012年2月24日
發明者吳巧麗, 姜淑娟, 孫洋, 牟光慶, 王瑞雪, 錢方 申請人:大連工業大學