專利名稱：用于檢測β-胡蘿卜素類色素的單克隆抗體及酶聯免疫方法與試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種能識別β -胡蘿卜素類色素的單克隆抗體和一種用于檢測β -胡蘿卜素類色素的酶聯免疫方法及試劑盒。
背景技術：
β -胡蘿卜素類色素有β -阿樸-8’ -胡蘿卜素醛、β -阿樸-8’ -胡蘿卜素酸乙
酯、葉黃素、辣椒紅、斑蝥黃、蝦青素等。目前，對β-胡蘿卜素類物質的檢測方法主要是儀器檢測法，如紙層析法、薄層層析法、柱層析法、分光光度法、高效液相色譜或液質聯用法。這些檢測方法需要配備昂貴的儀器和專業性強的操作人員，樣品的前處理復雜，檢測時間長，不利于大批量樣品的篩選， 不能在現場進行快速的檢測。酶聯免疫檢測方法(ELISA)是利用免疫反應(即抗原-抗體結合反應)的高度特異性和酶促反應的高度敏感性對藥物進行定性和定量分析的一種綜合性檢測技術。它具有操作簡便、高通量、高靈敏度、低費用等優點，能克服儀器檢測方法的不足。目前，國內外沒有針對β_胡蘿卜素類的ELISA檢測方法的文獻報道。對于小分子化合物ELISA檢測方法的建立，小分子化合物的抗體制備是核心部分，而合理設計半抗原又是關鍵。半抗原的化學結構不同，連接到載體蛋白上的化學位點就不同，交聯臂的化學性質也不同，而這是影響小分子化合物抗體性質的決定性因素。因此對小分子化合物進行化學結構改造，合理設計半抗原，將半抗原連接到載體蛋白上，是該發明的核心。申請人:檢索到一篇申請號為201010140887.6的發明專利，該專利提供了一種氧化α-紫羅酮和β_紫羅酮的方法，但是并沒有將其作為半抗原合成免疫原及應用于酶聯免疫檢測。

發明內容
本發明的第一個目的是提供一種能識別β_胡蘿卜素類色素的單克隆抗體。本發明的第二個目的是利用該單克隆抗體，建立一種能檢測β_胡蘿卜素類色素的ELISA方法。本發明的第三個目的是提供一種檢測β_胡蘿卜素類色素的酶聯免疫試劑盒。本發明的第四個目的是提供所述單克隆抗體在制備檢測β_胡蘿卜素類色素的酶聯免疫試劑盒中的應用。本發明的第五個目的是提供含有所述單克隆抗體的試劑盒在動物組織β-胡蘿卜素類色素殘留檢測中的應用。本發明是通過以下技術方案實現的一種能識別β_胡蘿卜素類色素的單克隆抗體，它是由保藏號為CCTCC NO C201146雜交瘤細胞DCC/C11所分泌的。
所述胡蘿卜素類色素指的是斑蝥黃、β -胡蘿卜素、β -阿樸_8’ -胡蘿卜素醛、葉
黃素、辣椒紅素、紫羅酮酸。所述雜交瘤細胞DCC/C11保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為 CCTCC NO C201146o所用的免疫原是通過半抗原β_紫羅酮酸與牛血清白蛋白偶聯制備得到的。進一步，本發明提供了一種檢測胡蘿卜素類色素的酶聯免疫方法，包括免疫原、包被原、抗體的制備以及樣品的處理和檢測，其步驟如下(I)將半抗原β_紫羅酮酸與牛血清白蛋白(BSA)偶聯得到免疫原；(2)將半抗原4-氧代-β-紫羅酮酸與卵清蛋白(OVA)偶聯得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原免疫小鼠，通過細胞融合與篩選得到保藏號為CCTCC NO C201146的雜交瘤細胞DCC/C11 ；(4)用保藏號為CCTCC NO C201146的雜交瘤細胞DCC/C11制備單克隆抗體；(5)用步驟⑵的包被原包被固相載體；(6)將待測樣品用體積比為乙酸乙酯氫氧化鈉(2% ) = 2 : I的混合溶液提取， 經乙酸乙酯萃取和氮氣吹干后，殘渣用樣品稀釋液溶解得到待測物；(7)對步驟￠)的待測物進行酶聯免疫檢測，其中樣品稀釋液的組分及配比為=NaCl8. 0g, KH2PO4 O. 2g，Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，KCl O. 2g，N，，N，- 二甲基乙酰胺20mL，加雙蒸水至IOOOmL0本發明以上述單克隆抗體和包被原作為核心試劑與常規的其他試劑組合，制成了能檢測胡蘿卜素類色素的酶聯免疫試劑盒，結合上述酶聯免疫方法，實現了對胡蘿卜素類色素的酶聯免疫檢測。本發明的有益效果是I、本發明制備的單克隆抗體能識別β -胡蘿卜素類色素中的斑蝥黃、β -胡蘿卜素、β-阿樸_8’ -胡蘿卜素醛、葉黃素、辣椒紅素、β_紫羅酮酸，專屬性強，靈敏度高。2、由于本發明采用β_紫羅酮酸作為半抗原，該半抗原保留了斑蝥黃、β_胡蘿卜素、β -阿樸_8’ -胡蘿卜素醛、葉黃素、辣椒紅素所共有的化學結構，由該半抗原制備的單克隆抗體可同時識別斑蝥黃、β -胡蘿卜素、β -阿樸_8’ -胡蘿卜素醛、葉黃素、辣椒紅素、 β-紫羅酮酸。3、本發明的ELISA方法和試劑盒能一次性測出待測物中斑蝥黃、β-胡蘿卜素、 β-阿樸-8’ -胡蘿卜素醛、葉黃素、辣椒紅素、β_紫羅酮酸的總含量，縮短了檢測時間，降低了檢測成本。4、本發明的ELISA方法和試劑盒檢測靈敏度高、精密度好、準確性好。


附圖I為本發明的技術路線圖。附圖2為本發明的單克隆抗體與斑蝥黃(CTX)標準品的間接競爭ELISA反應曲線，X軸為斑蝥黃(CTX)標準溶液濃度對數值，Y軸為斑蝥黃標準品溶液的光密度值除以 “零”孔光密度值(Β/Β0)。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做進一步說明。實施例I免疫原和包被原的制備I. I β -紫羅酮酸的合成準確量取蒸餾水30mL，加入到預冷的圓底燒瓶中；向燒瓶中加入液溴20g，攪拌2 小時后，形成A液備用。準確β_紫羅酮6g，溶解于二氧雜環己烷20mL中，形成B液。將B 液加入A液中，室溫下反應8小時。反應完成后，加入20%亞硫酸氫鈉直到淀粉碘化鉀試紙不再變藍。然后加入濃鹽酸至溶液中出現白色固體物質。過濾，將濾渣白色固體物質投入甲醇中，置60°C水浴攪拌至完全溶解后，過濾。將濾液置于_20°C過夜后過濾，濾餅置于 50°C真空干燥箱中干燥，得到的產物進行質譜鑒定為β_紫羅酮酸。1.2 β-紫羅酮酸-BSA的合成取β -紫羅酮酸93mg，1,3- 二環己基碳二亞胺(DCC) 50mg和N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 33mg溶解于二氧雜環己烷5mL，室溫避光攪拌8小時，反應產物過濾后形成A液。另取 BSA80mg溶解于磷酸鹽緩沖液(O. 01mol/L, pH8. O) 20mL中，形成B液。冰浴攪拌下，將A液滴加到B液；將反應12小時后的反應液于4000r/分鐘離心10分鐘；取上清裝入透析袋中， 對生理鹽水透析5-6天，即得偶聯物β-紫羅酮酸-BSA。離心后取上清冷凍干燥，置_20°C 保存，作為免疫原。1.3 4-氧代-β-紫羅酮的合成將β-紫羅酮20g和二氯甲烷60ml加入到三口瓶中；水浴加熱至37°C，加入15ml 含有2g碘化鉀的水溶液和6ml含有3g硫酸氫鈉的水溶液。攪拌條件下，再加入含有8g溴酸鈉的20ml水溶液,反應完成后，分離有機相。該有機相用8g無水硫酸鎂干燥后,旋蒸濃縮。用石油醚和丙酮進行柱層析，分離目標物質。將分離出來的目標物質旋蒸濃縮后，加入同體積的石油醚，置_20°C過夜后過濾。濾餅置于50°C真空干燥箱中干燥，得到的產物進行質譜鑒定為4-氧代-β -紫羅酮。I. 4 4_ 氧代 β -紫羅酮酸(4-keto-β-ionone acid)的合成準確稱取NaOH4g,溶于20mL水中，滴入溴素2mL,繼續攪拌。稱取4_氧代-β -紫羅酮粗品I. 2g，溶于二氧雜環己烷4mL，加入上述活化好的反應液中，至淀粉碘化鉀試紙不再變藍時停止反應。加入30%的NaHS0416mL，用二氯甲烷萃取除雜，對水相加入濃鹽酸酸化，靜置至出現紅色沉淀。沉淀過濾后，濾渣用二氯甲烷溶解，采用石油醚和乙醇柱層析，分離目標物質。將分離出來的目標物質旋蒸濃縮后，加入同體積的二氯甲烷，置于_20°C過夜后過濾。濾餅置于50°C真空干燥箱中干燥，得到的產物進行質譜鑒定為4-氧代-β -紫羅酮酸。I. 5 4_ 氧代-β -紫羅酮酸-OVA (4-keto-β-ionone acid-OVA)的合成取4-氧代β -紫羅酮酸48mg，加入N, N- 二甲基甲酰胺(DMF) 2mL，然后加入三乙胺60 μ L，再加入氯甲酸異丁酯60 μ L，室溫下攪拌反應60分鐘，形成A液。另取OVAlOOmg 溶解在30mL0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH7. 4)中，形成B液。將A液滴加到B液中，攪拌反應16小時。反應完成后，將反應液在5000r/分鐘、4°C離心10分鐘。取上清液對生理鹽水徹底透析，即得偶聯物4-氧代-β -紫羅酮酸-0VA。離心后取上清冷凍干燥，置_20°C保存，作為包被原。實施例2單克隆抗體的制備雜交瘤細胞的制備參照薛慶善《體外培養的原理與技術》(科學出版社2001年版)中的方法以實施例I制備的偶聯物紫羅酮酸-BSA免疫Balb/C小鼠(購自湖北省疾病預防控制中心實驗動物中心)。免疫程序是取含偶聯物β -紫羅酮酸-BSA 125 Ug 的蛋白溶液與等體積的弗氏完全佐劑(購自sigma公司)乳化后，于小鼠背部皮下多點注射。以后每間隔2周加強一次，換用不完全佐劑(購自sigma公司)乳化。最后于融合前三天(最好與上次免疫相隔4周以上)，腹腔注射，強化免疫，抗原量加倍，不加佐劑。融合時，取經最后強化免疫的Balb/C小鼠一只，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性血清)，在75%酒精中浸泡5分鐘消毒。無菌取出小鼠脾臟，分離出脾細胞，與新鮮制備的SP2/0骨髓瘤細胞(SP2/0骨髓瘤細胞來自本實驗室)按l-2X107fSP2/0與IO8 個免疫脾細胞(I 10 I : 15)的比例于50mL離心管中混勻，1500r/分鐘，離心10分鐘。倒凈上清(可用滅菌的濾紙吸干)，輕輕敲擊管底，使細胞沉淀略加松動。將裝有細胞混合物的離心管放于37°C水浴中。然后在I分鐘內慢慢滴入預溫至37°C的50%聚乙二醇 (PEG)O. SmL(購自sigma公司產品)，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌，繼續攪拌I分鐘。然后慢慢加入37°C預溫的1640 (購自Hyclone公司商業培養基)基礎培養基10mL。具體方法為 第一分鐘逐滴滴入ImL,第二分鐘加ImL,第3 4分鐘加3mL,第5分鐘加其余的5mL,每次加時需緩慢加入，并不斷輕輕地攪拌。最后加入30mL 1640液，也需慢慢加入。800r/m離心 5分鐘，去上清，于37°C放置5 8分鐘。用HAT (購自Sigma公司)培養基懸浮，同時也用 HAT培養基懸浮制備好的飼養脾細胞并與融合后的細胞混合，根據需要補加適量的HAT培養基，分種于96孔培養板中，約250 μ L/孔。一次融合可接種4 8塊96孔板。根據需要也可少種，一般按SP2/0的細胞數計算，每孔接種量約含IO4左右個SP2/0細胞。于37°C， 5% CO2培養箱中培養。融合后第二天開始觀察有無污染，于第4天補加I滴HAT培養基，第 8 10天吸去100 μ L培養基換HT (購自sigma公司)培養基100 μ L。待融合細胞集落長至培養孔1/4，培養基略變黃時，進行抗體檢測。采用4-氧代-β -紫羅酮酸-OVA作為篩選抗原，利用ELISA方法篩選出分泌抗斑蝥黃抗體的陽性孔。對篩選出來的陽性孔立刻用有限稀釋法(參照薛慶善《體外培養的原理與技術》科學出版社2001年版)進行克隆、篩選。 經過3 4次克隆，最終篩選出分泌抗β-胡蘿卜類色素抗體的單克隆雜交瘤細胞。對該細胞系進行了染色體計數，結果顯示，SP2/0的染色體的平均數為58，脾細胞染色體為40條， 而雜交瘤細胞的染色體數目在92 104之間，均高于兩親本細胞的染色體數目。雜交瘤細胞的染色體數目明顯多于骨髓瘤細胞SP2/0的染色體，說明融合細胞的確是SP2/0細胞與脾細胞的雜交產物。對篩選出的該單克隆雜交瘤細胞，申請人將其命名為DCC/C11，并于 2011年6月29日送交位于湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC) 保藏，其保藏號為CCTCC NO :C201146。腹水單抗制備與鑒定在接種前7天取Balb/c小鼠數只，每只小鼠腹腔注射 O. 5ml弗氏不完全佐劑進行預處理。用RPMI 1640基礎培養基懸浮由保藏號為CCTCC NO: C201146的雜交瘤細胞DCC/C11擴大培養的細胞，并將細胞數調至I X IO6個/mL，每只小鼠腹腔接種O. 5ml。待小鼠腹部明顯膨大，精神變差，瀕死不動時采集腹水。按照文獻方法(朱立平，陳學清.免疫學常用實驗方法.北京人民軍醫出版社，2000)，純化獲得單克隆抗體。采用購自ROCKLAND公司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)對本發明所得到的單克隆抗體進行亞型鑒定，結果為小鼠IgG1亞型。實施例3 ELISA檢測方法的建立3. I試劑的配制(本實施例使用的試劑除另注明外均采用以下方法配制)磷酸鹽緩沖液=NaCl8. 0g, KH2PO4 O. 2g，Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，KCl O. 2g，加超純水至IOOOmL,調節pH至7. 4 ;包被液-MNa2CO3 I. 5g，NaHCO3 2. 9g，加三蒸水至 IOOOmL,調節 pH 值至 9. 6 ；洗滌液NaCl8. 0g, KH2PO4 0. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g, KCl 0. 2g,吐溫 200. 5mL, 加超純水至IOOOmL,調節pH至7. 4 ;封閉液卵清蛋白0. Ig溶于IOOmL磷酸鹽緩沖液中；底物溶液由武漢飛遠科技有限公司提供。終止液2mol/L硫酸溶液。3. 2包被原濃度和抗體工作濃度的初步確定以方陣滴定法初步選擇包被原和抗體的工作濃度組合。使用包被液將包被原 4-keto-P -ionone acid-OVA 倍比稀釋成 0. 25,0. 5、1、2、4、8、16、32 μ g/mL 橫向包被酶標板；DCC/C11單克隆抗體使用抗體稀釋液(購自武漢飛遠科技有限公司)倍比稀釋成 I 500、I 1000、I 2000、I 4000、I 8000、I 16000、I 32000、I 64000、 I 128000縱向加入酶標板。方陣滴定結果見表1，初步選擇以下包被原濃度和抗體稀釋度組合(2，1000)、(4,4000)、(8,8000)和(16，16000)。結果如表1，初步確定包被原4-keto_0 -ionone acid-OVA的包被濃度為8 μ g/ mL，抗體工作濃度為I : 8000。表I DCC/C11單克隆抗體方陣滴定
權利要求
1.一種能識別β-胡蘿卜素類色素的單克隆抗體，其特征在于，它是由保藏號為CCTCC NO C201146雜交瘤細胞DCC/C11所分泌的。
2.權利要求I所述的雜交瘤細胞DCC/C11，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為 CCTCC NO C201146o
3.包含權利要求I所述的單克隆抗體的試劑盒。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，該試劑盒是用于檢測β_胡蘿卜素類色素的酶聯免疫試劑盒。
5.一種用于檢測β_胡蘿卜素類色素的酶聯免疫方法，包括免疫原、包被原、抗體的制備以及樣品的處理和檢測，其步驟如下(1)將半抗原β_紫羅酮酸與牛血清白蛋白偶聯得到免疫原；(2)將半抗原4-氧代-β-紫羅酮酸與卵清蛋白偶聯得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原免疫小鼠，通過細胞融合與篩選得到保藏號為CCTCCNO C201146的雜交瘤細胞DCC/C11 ；(4)用保藏號為CCTCCNO C201146的雜交瘤細胞DCC/C11制備單克隆抗體；(5)用步驟(2)的包被原包被固相載體；(6)將待測樣品用體積比為乙酸乙酯氫氧化鈉(2%) = 2 : I的混合溶液提取，經乙酸乙酯萃取和氮氣吹干后，殘渣用樣品稀釋液溶解得到待測物；(7)對步驟￠)的待測物進行酶聯免疫檢測，其中樣品稀釋液的組分及配比為=NaCl 8. 0g, KH2PO4 O. 2g，Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，KClO.2g，N，，N，- 二甲基乙酰胺20mL，加雙蒸水至IOOOmL0
6.權利要求I所述的單克隆抗體在制備檢測胡蘿卜素類色素的酶聯免疫試劑盒中的應用。
7.權利要求3或4所述的試劑盒在動物組織β-胡蘿卜素類色素殘留檢測中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種能識別β-胡蘿卜素類色素的特異性單克隆抗體和一種用于檢測β-胡蘿卜素類色素的酶聯免疫方法及試劑盒。本發明的單克隆抗體是由雜交瘤細胞DCC/C11所分泌的，該雜交瘤細胞保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NOC201146。本發明的酶聯免疫檢測方法包括免疫原、包被原、抗體的制備以及樣品的處理和檢測等步驟。本發明的酶聯免疫檢測方法及試劑盒能一次性測出樣品中斑蝥黃、β-胡蘿卜素、β-阿樸-8’-胡蘿卜素醛、葉黃素、辣椒紅素、β-紫羅酮酸的總含量，縮短了檢測時間，降低了檢測成本，同時具有檢測靈敏度高、精密度好、準確性好的特點。
文檔編號C07K16/44GK102585007SQ20121004521
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月27日 優先權日2012年2月27日
發明者劉振利, 廖峰, 彭大鵬, 戴夢紅, 潘源虎, 王玉蓮, 袁宗輝, 閆彩霞, 陳冬梅, 陶燕飛, 黃玲利 申請人:華中農業大學