專利名稱：通過調節tim-1、tim-2和tim-4功能從而調節免疫應答的方法
通過調節TIM-1、TIM-2和TIM-4功能從而調節免疫應答的
方法本申請是2005年3月14日遞交的申請號為200580014074. X，發明名稱為“通過調節TIM-I、TIM-2和TIM-4功能從而調節免疫應答的方法”的分案申請。相關申請本申請對2004年3月12日提交的美國專利序列號第60/552，523，名為“通過調節TIM-I和TIM-2功能從而調節免疫應答的方法”，及2004年10月27日提交的美國專利序列號第60/622，559，名為“通過調節TIM-I和TIM-4功能從而調節免疫應答的方法”的權益提出要求。這些申請的全部教導都通過在此引述而全部合并于本文。關于聯邦-資助的研究和發展陳述這里描述的發明，全部或部分地，由國家健康基金協會號1R01NS045937-01，2R01NS355685-06,2R37NS30843-11，1R01AI44880-03，2P01AI39670-07，1P01NS38037-04 和1F31GM20927-01資助。美國政府擁有本發明的某些權益。
背景技術：
對外源或內源因子的過度免疫應答可能導致疾病，其可作為Thl-或Th2_介導的疾病的特征。Th2-介導的疾病實施例，哮喘，過敏性鼻炎(花粉熱)，過敏性皮炎(濕疹)和食物過敏，是非常普遍的，可影響20-40%的普通人群并造成ー個主要的公共健康問題。應對這些疾病的經濟開支是巨大的。僅哮喘ー項，1996年的健康保障費用估計為140億美元。此外，過去20年エ業國家中所有遺傳性過敏疾病的流行極大地上升了，而原因仍未明。エ業國家中哮喘的流行，其最為精確的數量，自從1982年以來已經增倍，并預期至2020年再次增倍。風濕性關節炎(RA)，ー種Thl疾病，是ー種普遍的人自身免疫疾病，在高加索人中流行率為 I % (Harris, B. J. et al. , 1997, In Textbook of Rheumatology 898-932),目前影響250萬美國人。RA以滑動關節的慢性炎癥和活性T細胞，巨噬細胞和漿細胞浸潤為特征，導致關節軟骨進行性破壞。這是關節疾病最嚴重的形式。多重硬化癥(MS)，另ー種Thl疾病，是最常見的中樞神經系統(CNS)神經脫髓鞘疾病，在北美影響350，000(0. 1%)人，而全世界為110萬。通常，MS被認為是ー種部分由前炎癥⑶4T(Thl)細胞介導的自身免疫疾病，該細胞識別與由抗原(Ag)遞呈細胞(APC)表達的MHC class II分子相連的特異髓磷脂多肽。另ー種Thl介導的疾病實施例，人類I型或胰島素-依賴的糖尿病(IDDM)，以胰島中beta細胞的自身免疫性破壞為特征。Beta細胞的損耗導致血液中葡萄糖水平調節能力的喪失。在人體出現糖尿病之前有一個長期的潛伏期。在此期間胰腺beta細胞的功能逐步消失。疾病的發展以出現拮抗胰島素，谷氨酸脫羧酶，和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)的自身抗體為指示。T輔助(Th)亞類以其產生不同細胞因子種類和提升特異免疫應答的能力進行區分。Thl細胞產生IFN Y并促進直接針對細胞內病原體的細胞-介導免疫。相反，Th2細胞產生細胞因子IL-4，IL-5，IL-13，激活針對細胞外病原體的肥大細胞和嗜曙紅細胞和直接B細胞。由極化Th細胞產生的特異細胞因子是促進前驅Th細胞分化的最初因子，但這些細胞也交聯調控其他亞類的功能活性。例如具報道IL-4是ー種促進Thp細胞分化為Th2效應細胞的有效因子。此外，1し-4拮抗正^^的生成。IL-10，另ー種Th2細胞產生的細胞因子，也被報道可抑制Thl分化和IFN Y-介導的巨噬細胞功能。相反地，Thl產生的IFNy可促進Thl的分化并抑制Th2細胞的増殖。這些細胞因子促進特異Th細胞亞類分化，同時抑制選擇分化命運的能力，造成不斷發展的極化應答結果。相應地，需要一種促進或抑制Thl或Th2應答發展的新的治療方法。這些新治療方法可以用于治療自身免疫和過敏性疾病，增強移植組織免疫耐受カ或減少癌癥患者的免疫耐受力。發明概述 此發明廣義上涉及調控Thl或Th2細胞活性從而調控免疫應答的藥物、組合物和方法。此發明部分基于這里描述的意外的發現，即tim-1和tim-4形成多肽復合物，并且此復合物的形成可調節T細胞活性和免疫應答。在某些方面，此方法提供了ー種在需要治療的病人中進行治療或防止Thl-介導的失調的方法，該方法包括給予病人治療有效劑量的藥物，其可減少tim-1, tim-2,或tim-4表達或活性。一些實施方案中，該病人患有自身免疫疾病。此發明的相關方面提供了在有需要的病人中引發Thl應答的方法，如患有增生疾病如癌癥的病人。此發明的相關方面也提供對患有Th2失調的病人進行治療的方法，如哮喘或過敏性疾病，或在病人中引發Th2應答，而其應答將是有益的，如患有自身免疫疾病的病人。此發明進ー步提供了在病人中調控免疫/移植耐受的方法，包括給予病人治療有效劑量的藥物，調控tim-1, tim-2,或tim_4活性,從而調控免疫耐受性。一些實施方案中，該藥物通過減少tim-1, tim-2,或tim_4表達或活性從而增加免疫/移植耐受性。在另ー實施方案中，該藥物通過增加tim-1, tim-2,或tim_4表達或活性從而減少免疫耐受性。此發明進ー步提供了在有需要的病人中增強或抑制T-細胞増殖的方法，該方法包括給予病人能有效增加或抑制T-細胞増殖數量的tim-4多肽。此發明的其他方面提供了一種在有需要的病人中進行治療，預防或減少A型肝炎感染的方法。某一實施方案中，A型肝炎感染的治療或預防是通過給予病人治療有效劑量的(i)包括tim-4IgV區域的多肽,或(II)包括與tim-4IgV區域和/或tim_4粘液素區域具有高度同源的氨基酸序列，或相似的氨基酸序列的多肽。此發明的相關方面提供了ー種通過給予病人治療有效劑量的包括tim-4IgV區域的多肽或包括與tim-4IgV區域，tim-4粘液素區域，或與其兩者具有高度同源，或相似的氨基酸序列的多肽，在病人中進行遺傳性過敏癥的預防或減少其發生可能性的方法。在另ー個實施方案中，多肽包括tim-4粘液素區域或具有與tim-4粘液素區域高度同源，或相似的氨基酸序列區域。此發明也提供了鑒定調控tim-l/tim-4復合物形成的藥物的方法，如鑒定促進或抑制復合物形成，或阻止tim-1結合tim-4的活性的藥物的方法。此發明的另一方面提供了鑒定模擬tim-4結合tim-1的藥物的方法，如作為tim_4的替代物激活tim_l活性從而調控免疫應答的藥物。此發明也提供了新的tim-4多肽，包括這些多肽的組合物，和其編碼核酸。在ー個特別方面提供了可溶的非膜錨定tim-4多肽。合適的可溶性多肽包括那些由粘液素區域的IgV和N-末端部分組成，但不包含tim-4跨膜區域的多肽。在一些實施方案中，可溶tim-4多肽還包含tim-4胞內區域。可溶tim-4多肽可作為結合tim_l并調控免疫應答的藥物使用。


圖I顯示Tim-2mRNA適合于在Th2細胞中表達。⑷由Thl (AE7)和Th2(D10G4)克隆制備的cDNA用tim-2和Tim_3引物進行RT-PCR。產物用I. 2%瓊脂糖凝膠分析。(B)D011. 10TCR轉基因⑶4T細胞在Thl或Th2極性條件下用0VA323-339刺激。在每輪刺激結束時提取RNA并制備cDNA。用特異的Tim-2引物對cDNA進行循環-樣品PCR。產物用
I.5%瓊脂糖凝膠分析。·圖2顯示Tim-2配基在活性APCs中表達。樹突狀細胞系，D2SC/1，和巨噬細胞系，RAff 264，在 20ng/ml LPS 和 5ng/ml IFNy的條件下孵育。激活-后48小吋，收集細胞并用生物素標記Tim_2Ig，生物素標記Tim-1 Ig，生物素標記Tim-3Ig，或生物素標記hlgG進行染色并用生物親和素-PC作為第二種檢測試劑。細胞用流式細胞計數分析。圖3Tim-2Ig的治療引發Th2細胞因子的應答和増殖。SJL小鼠用PLP 139-151免疫，并用Tim-2Ig，或hlgG或作為對照的PB S進行處理。免疫后10天收集器官并評估増殖和細胞因子的產生。Tim-2Ig(空心三角形)；PBS(實心圓形)；hIgG(實心方形)。(A)全部的脾細胞在缺失抗原的條件下培養48小吋。通過H3-胸腺嘧啶脫氧核苷的結合對增殖進行評估。(B)全部的脾細胞在系列濃度的PLP139-151多肽存在下培養48小吋。通過H3-胸腺嘧啶脫氧核苷的結合對增殖進行測定。(C)收集3 (A)和(B)中描述的上清，用ELISA評估 IL-2，IFN y，IL-4 和 IL-10 表達情況。圖4顯示Tim-IIg的治療引發增殖和Th2細胞因子的應答。SJL小鼠用PLP139-151免疫，并用Tim-llg，或hlgG或作為對照的PB S進行處理。免疫后10天收集器官并評估增殖和細胞因子的產生。Tim-IIg(空心圓形)；PBS(實心菱形)；hIgG(實心方形)。(A)全部的脾細胞在缺失抗原的條件下培養48小吋。通過H3-胸腺嘧啶脫氧核苷的結合對増殖進行評估。(B)全部的脾細胞在系列濃度的PLP 139-151多肽存在下培養48小時。通過H3-胸腺嘧啶脫氧核苷的結合對增殖進行測定。(C)收集4 (A)和(B)中描述的上清，用ELISA 評估 IL-2, IFN y，IL-4 和 IL-10 表達情況。圖5顯示在引發EAE期間用Tim_2Ig進行治療可以延緩疾病的發作和嚴重性。用溶于CFA的75iig PLP 139-151多肽免疫SJL/J小鼠，并靜脈內注射百日咳毒素。從0天至8天的每個交替日用Tim-2Ig，或作為對照的hlgG或PB S進行處理。根據EAE臨床征兆對小鼠進行監控。圖6顯示在引發EAE期間用Tim-IIg進行治療可以延緩疾病的發作和嚴重性。用溶于CFA的75iig PLP 139-151多肽免疫SJL/J小鼠，并靜脈內注射百日咳毒素。從0天至8天的每個交替日用Tim-llg，或作為對照的hlgG或PB S進行處理。根據EAE臨床征兆對小鼠進行監控。圖7顯示活性抗原遞呈細胞表達的Tim-I和tim_2配基，從Balb/c小鼠脾細胞純化出CD Ilb (巨噬細胞和樹突狀細胞)和CD Ilc (樹突狀細胞)并用LPS和gamma干擾素激活。激活-后24小時細胞用hlgG (紅線)，Tim-IIg生物素標記(綠色線)，或Tim-2Ig生物素標記(黃色線)進行染色。抗生物素-PE被用于第二種檢測試劑。所用樣本用流式細胞儀分析。Tim-I和tim-2配基的表達在活性抗原遞呈細胞中都是上調的。圖8顯示在Thl和Th2極化細胞系中Tim_2的表達情況。來源于C57BL/6和Balb/c小鼠的初始T細胞在存在IL-12和抗-IL-4 (Thl)或IL-4和抗-IL_12(Th2)的條件下用抗-CD3/CD28刺激進行極化。從細胞中提取RNA并制備cDNA。用特異的Taqman引物和探針對Tim-2相對于GAPDH的表達進行測定。與Thl細胞相比，Tim_2的表達更傾向于在Th2細胞中進行上調。圖9顯示Timl/Fc単一-治療可以使微小錯配的胰島移植得到存活。Balb/c小 鼠按240mg/kg的劑量用streptocotocin進行單一注射而患上糖尿病。來源于DBA/2的胰島移植物被移植到右腎的腎囊下。受體鼠在移植的0，2，4天按0. 25mg/小鼠的劑量用Tim1/Fc進行治療。圖10顯示Tim2/Fc単一-治療延緩排斥并使微小錯配的胰島移植得到存活。Balb/c小鼠按240mg/kg的劑量用streptocotocin進行單一注射而患上糖尿病。來源于DBA/2的胰島移植物被移植到右腎的腎囊下。受體鼠在移植的0，2，4天按0. 25mg/小鼠的劑量用Tim2/Fc進行治療。圖11顯示打!112/^(3與抗-0) 154協同增效可以引發MHC錯配移植耐受性。C57BL/6小鼠按260mg/kg的劑量用streptocotocin進行單一注射而患上糖尿病。來源于DBA/2的胰島移植物被移植到右腎的腎囊下。受體鼠在移植的0，2，4天按0. 25mg/小鼠的劑量用Tim2/Fc進行治療，并在移植的0，2天按0. 25mg/小鼠的劑量用MRl進行治療。圖12顯示Tim-4在巨噬細胞和成熟樹突狀細胞中，而非T細胞中表達。(a)利用Taqman定量PCR對Clontech多組織cDNA芯片進行重復試驗分析小鼠不同組織中Tim4mRNA的情況。(b)DOllOlOTcR轉基因T細胞在體外分化為ThI或TH2系，在每輪再刺激后從靜息細胞中制備RNA。RNA也可以由長-期T細胞克隆AE7 (ThI)和D 10. G4 (TH2)，及CHO-Tim_4穩定轉化系進行制備。顯示了兩次試驗的數據。(c) SJL/J脾和淋巴節細胞被純化為⑶11b+，CD llc+，B220+，和CD3+細胞群。顯示了超過5次試驗的數據。(d)用GM-CSF或Flt3L從骨髓細胞中制備體外培養的樹突狀細胞，一部分細胞用LPS刺激。Flt3L-制備的細胞轉變為漿細胞形式。顯示了 2次試驗的數據。(e)用CMS5 Flt3L-引發的腫瘤細胞注射CB6F1小鼠并制備體外培養的樹突狀細胞。轉化T細胞和B細胞的脾細胞按照類型進行分離。所有細胞類型用Tim-4Taqman RT-PCR對Tim_4mRNA表達進行定量。所有數據都以tim_4相對于GAPDH的表達量進行表示,并重復三孔。圖13顯示Tim-4配基在B細胞和活性T細胞中表達。全部的SJL/J脾細胞，無論經LPS和IFN- Y (用于B細胞)，或ConA(用于T細胞)激活或未激活的，都用B220-FITC或⑶3-FITC和Tim-4-Ig進行染色(用杭-人IgG-PE測定)。數據表明了四次単獨試驗的結果。圖14 顯不 Tim-4 與 Tim-I 特異交互作用。(a)經 Tim_l, Tim_3,或 Tim_4cDNA 轉染的CHO細胞用Tim-I-Ig(用抗-mIgG2a-PE檢測，用單獨的ニ抗作為對照)，Tim-2-Ig，或Tim-4-Ig (都用抗-hlgG-PE檢測，用hlgG作為對照)染色。分別用單克隆抗-Tim-I或抗-Tim-3可在細胞表面檢測到Tim-I和Tim_3，而用生物素標記的抗-HA對Tim_4進行檢測(用抗生物素-PE可見；所有都與同型對照進行比較)。數據表明了超過10次試驗的結果。(b)經Tim-I或Tim-4轉染的HEK293細胞按前述方法用Tim-I-Ig或Tim-4-Ig染色。為評估特異的染色情況，Tim-I-Ig預先與抗-Tim-I或抗-Tim_3共孵育，并用于Tim_4轉染細胞的染色。此外，Tim-I轉染細胞用抗-Tim-I或抗-Tim_3預先孵育并用Tim-4-Ig染色。數據表明了超過5次試驗的結果。圖15顯示可在正常T細胞中觀察到Tim-4-Tim-l的交互作用。(a)從全部脾細胞中分離⑶3+細胞并用抗-⑶3和抗-⑶28刺激。按前述用抗-Tim-I或Tim-4-Ig染色。(b)全部脾細胞用ConA刺激并按前述用抗-CD3或Tim-4-Ig染色。細胞在經Tim-4-Ig染色之前預先與抗-Tim-I或抗-Tim-3孵育從而評估Tim-I與Tim-4-Ig結合的特異性。(c,d)D0
11.IOTCR轉基因T細胞在體外分化為ThI和TH2細胞系并用PMA+Ionomycin+golgi Stop激活3小吋，并按前述用抗-Tim-I或Tim-4-Ig染色。激活的細胞用抗-CD4進行體外染色并用細胞因子抗體進行體內染色以確定其分化為ThI和Th2細胞系。數據表明了超過4次試 驗的結果。圖16顯示Tim-I-Ig在體外特異結合活性⑶Ilb+和⑶Ilc +細胞。來源于DO110. IOTcR轉基因小鼠或Balb/c小鼠的脾細胞用LPS和IFN-y刺激。CDllb+和CDllc+細胞通過MACS柱進行純化并在存在或缺失抗Tim-I或抗Tim-3單克隆抗體的情況下用生物素標記的Tim-I-Ig染色。抗生物素-PE被用于第二種檢測試劑。數據表明了 2次試驗的結果。圖17顯示Tim-I-Ig的治療引發T細胞的増殖。(a)來源于免疫SJL/J小鼠的脾細胞在體內用Tim-1-Ig，或hlgG或PBS對照處理，并用PLP 139-151多肽再刺激在體外培養48小吋。48小時后用3[H]胸腺嘧啶脫氧核苷共孵育以測定増殖情況，試驗重復三孔。
(b)按6a試驗中敘述的經PLP 139-151抗原刺激48小時的體外培養上清被用于細胞因子ELISAs ;顯示了 IL-2，IL-4，IL-10和INF-Y的表達情況。單獨分析來源于單獨小鼠(6只)的脾細胞，并顯示了所有小鼠的平均數值。誤差欄表示S.E.M值。數據表明4次獨立試驗的結果。黑色菱形，PBS ;黑色方形，hlgG ;空心三角形，Tim-I-Ig處理。圖18顯示Tim-4-Ig引發體內的T細胞增殖及體外促進T細月包的増殖。(a)來源于經Tim-4-Ig，或hlgG或PBS對照體內免疫的SJL/J小鼠的脾細胞，在缺失多肽再刺激的情況下體外培養48小吋。48小時后用3[H]胸腺嘧啶脫氧核苷共孵育以測定増殖情況，試驗重復三孔。缺失多肽再刺激的情況下體外培養48小時后收獲培養上清，并用于細胞因子ELISAs以測定在缺失抗原再刺激的情況下自然細胞因子的產生數量。來自于2個不同小鼠的脾細胞被分別測試三次，并顯示了其平均值。(b)來源于2只經Tim-4-Ig(T4)或hlgG(Hu)體內免疫的SJL/J小鼠的脾細胞被分離為CDllb+(Mac),B220+(B)dPra3+(T)細胞群并在缺失多肽再刺激的情況下進行重組。48小時后用3[H]胸腺嘧啶脫氧核苷共孵育以測定増殖情況。(c)用包被有特定濃度的抗-CD3，抗-CD28，和Tim-4-Ig或對照Igs的板對純化的SJL/JT細胞進行刺激。48小時后用3[H]胸腺嘧啶脫氧核苷共孵育以測定増殖情況，試驗重復三孔。數據表明了 2個相同試驗(左列)或5個相同試驗(右列)的結果。所有誤差欄表明重復孔的S.E.M.值。圖19顯示體內的Tim-I-Ig給藥在TH2_偏倚系統中引發了 TH2應答的增強和增Mo 雌性 Balb/c 小鼠注射 50 y gOVA323_339 和 4mg Imject alum (Pierce)并在 7 天后用50 u gOVA323-339和2mg alum加強注射。在免疫前4小時及7天加強免疫前4小時，及免疫后2，4，10天，小鼠用1001^11111-1-18，11186，或 250iilPB S 注射 5 次。第 14 天，處死小鼠，脾細胞被用于分析增殖和細胞因子。(a)存在OVA 323-339多肽條件下體外培養脾細胞48小吋。48小時后用3[H]胸腺嘧啶脫氧核苷共孵育以測定増殖情況，試驗重復三孔。OVA 323-339多肽體外刺激48小時后收集培養上清并用于細胞因子ELISAs ;顯示了 IL-2，IL-4，IL-10的表達情況。未得到明顯的IFN-Y表達。源于單獨小鼠(3只)的脾細胞分別重復三孔進行分析，并顯示了所有3只小鼠的平均值。黒色菱形，PBS ;黑色方形，hlgG ；空心三角形，Tim-I-Ig體內注射。圖20顯示了鼠tim-4位點的選擇性拼接圖，產生兩種可溶的tim_4形式。發明詳述I.綜述
本發明通常提供了新的調節免疫應答的方法和藥物。本發明的方法可以調控主體中針對Thl和Th2應答的免疫應答。Thl和Th2應答，某種程度上，是互斥的，正如初始⑶4+T輔助細胞分化為Thl和Th2效應細胞，其每種都可分泌不同的細胞因子。相應地，本發明誘導Thl-介導的失調的方法可以用于患有Th2-介導失調的主體，而誘導Th2-介導的失調的方法可以用于患有Thl-介導失調的主體。本發明ー個方面提供了對具有需要的主體進行免疫應答的調控的方法，該方法包括給予主體治療有效劑量的藥物，其可以調節tim-1和tim-4之間的結合。在此所述的某一實施方案中，以Thl免疫應答的提高作為免疫應答，并且藥物將增加tim-1，tim-2或tim_4的活性或表達，例如那些提高tim-1和tim-4之間的結合的藥物。在此所述方法的另ー個實施方案中，以Th2免疫應答的提高作為免疫應答，并且藥物將減弱tim-1，tim-2或tim_4的活性或表達，例如那些減弱tim-1和tim-4之間的結合的藥物。本發明進一歩提供了在需要治療的主體中進行治療或防止或減少遭受Th-I介導的疾病可能性的方法，該方法包括給予主體治療有效劑量的藥物，其可以減少tim-1，tim-2或tim-4的活性或表達。Thl-介導的疾病包括自身免疫疾病，如多發性硬化，I-型糖尿病，HashinotoJ s甲狀腺炎，Crohn’ s疾病，類風濕關節炎，系統性紅斑狼瘡，胃炎，自身免疫性肝炎，溶血性貧血，自身免疫血友病，自身免疫淋巴細胞增生綜合癥(ALPS)，自身免疫性葡萄膜視網膜炎，腎小球腎炎，Guillain-Barre綜合癥，銀屑病和重癥肌無カ。Thl-介導的疾病也包括宿主排斥移植物疾病(HVGD)和抑制物排斥宿主疾病。本發明進一歩提供了在需要治療的主體中進行治療或防止或減少遭受Th-2介導的疾病可能性的方法，該方法包括給予主體治療有效劑量的藥物，其可以增加tim-1，tim-2或tim-4的活性或表達。在某一實施方案中，Th2-介導的疾病是哮喘，過敏，過敏性鼻炎，胃腸過敏，食物過敏，嗜曙紅細胞增多，結膜炎或腎小球腎炎。在某一特別實施方案中，這里所述方法中使用的調節免疫應答的藥物包括多肽(I)SEQ ID NO :331-133 位氨基酸；(2) SEQID NO :431-134 位氨基酸；(3)與 SEQ ID NO:331-133位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(4)與SEQ IDNO :431-134位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(5)與tim-4多肽至少具有90%相同的氨基酸序列，該 tim-4 多肽包含 SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 9,SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11, SEQ ID NO :12中挑選的氨基酸序列。在另ー個特別的實施方案中，這里所述方法中使用的調節免疫應答的藥物包括多肽(I)SEQ ID NO :121-126 位氨基酸；(2) SEQ ID NO :221-129 位氨基酸；(3)與 SEQ ID NO:121-126位氨基酸至少具有90%相同或相似氨基酸序列；或(4)與SEQID NO :221-129位氨基酸至少具有90%相同或相似氨基酸序列。在另ー個實施方案中，藥物包括與SEQ ID NO1130-237 位氨基酸，SEQ ID NO :2127-288 位氨基酸，SEQ ID NO :3134-318 位氨基酸或 SEQID NO :4136-281位氨基酸至少具有80%，85%或90%相同或相似的氨基酸序列。這里所述方法的一個實施方案中，這里所述方法使用的調節免疫應答的藥物包括抗體，或其抗原-結合片段，其結合tim-1, tim-2或tim_4。在一個特別實施方案中，該藥物是ー種結合tim-4的抗體；抗體或片段可以結合，例如，tim-4IgV和/或粘蛋白區域。另ー個實施方案中，藥物是一種針對tim-1和tim-2,或tim-2和semaphorin_4A的雙特異抗體。減少tim-1，tim-2或tim-4活性的藥物包括反義RNA藥物。在另ー個實施方案中，藥物包
括與 SEQ ID NO :1130-237位氨基酸，SEQ ID NO :2127-288位氨基酸，SEQ ID NO :3134-318位氨基酸或SEQ IDNO :4136-281位氨基酸至少具有80%，85%或90%相同或相似的氨基酸序列。藥物也包括peptidomimetica和小分子,如小于2kDa的非多肽復合物。本發明進ー步提供藥物研究的方法,部分基于未預料的發現，即tim-1, tim-2或tim-4形成物理復合物，而這種作用將調節免疫應答。本發明的ー個方面提供了鑒定可調節tim-1多肽和tim-4多肽之間結合的藥物的方法，包括(a)在測試藥物存在的條件下將tim-1多肽和tim-4多肽相結合；(b)鑒定測試藥物對于tim_l多肽和tim_4多肽相結合的影響；從而鑒定調節tim-1多肽和tim-4多肽相結合的藥物。本發明也提供了調節免疫應答的藥物的方法，該方法包括(a)在測試藥物存在的條件下將tim-1多肽和tim-4多肽相結合；(b)鑒定測試藥物對于tim-1多肽和tim-4多肽相結合的影響；從而鑒定調節免疫應答的藥物。在某一實施方案中，步驟(b)包括在存在測試藥物的合適的對照情況下，t匕較tim-l/tim-4復合物的形成。在特別實施方案中，合適的對照包括在缺失測試藥物的情況下，第一種多肽和第二種多肽間復合物的形成。在另ー實施方案中，第一種多肽或第二種多肽或其兩者在細胞中都有表達。在另ー實施方案中，測定復合物的形成包括測試報告基因的表達，其中報告基因的表達依賴于復合物的形成。在另ー實施方案中，第一種多肽或第二種多肽或其兩者都標記突光素分子。在另ー實施方案中，tim-4多肽包括(I)SEQ ID NO :331-133位氨基酸；(2) SEQ ID NO:431-134位氨基酸；(3)與SEQ ID NO :331-133位氨基酸至少具有90%相同或相似氨基酸序列；或⑷與SEQ ID NO =431-134位氨基酸；或(5)與tim_4多肽至少具有90%相同的氨基酸序列，該 tim-4 多肽包含 SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 9,SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11, SEQ ID NO :12中挑選的氨基酸序列。而在另一實施方案中，tim-1多肽包括(I)SEQ ID NO :121-126 位氨基酸；(2) SEQ ID NO :221-129 位氨基酸；(3)與 SEQ IDNO 121-126位氨基酸至少具有90%相同或相似氨基酸序列；或(4)與SEQ ID NO :221-129位氨基酸至少具有90%相同或相似氨基酸序列。在另ー個實施方案中，tim-1多肽包括與SEQID NO :1130-237 位氨基酸，SEQ ID NO :2127-288 位氨基酸至少具有 80%，85%或 90%相同或相似的氨基酸序列。鑒定調節tim-1和tim-4結合的藥物的方法可以用于鑒定增加tim_l和tim_4結合的藥物，或減弱tim-1和tim-4結合的藥物。本方法并非限制于鑒定任何特定單個藥物類型。藥物可以是，例如，小復合物，抗體，多肽，核酸，或碳水化合物。此外，本發明的ー個方面提供了鑒定tim-4中對于tim-1和tim_4結合起關鍵作用的氨基酸殘基的方法，該方法包括(a)將以下兩種物質相結合⑴包含tim-4IgV區域的多肽，其中所述的tim-4IgV區域與SEQ ID NO :331-133殘基或SEQID NO :431-134殘基中所列的tim-4IgV區域具有ー個和10個氨基酸之間的位點相關性；(2) tim-1多肽，其中所述的tim-1多肽可以結合tim-4多肽；(b)測定多肽和tim-1多肽間復合物的形成；并且
(c)若復合物的形成與合適的對照不同，則將形成的復合物與合適的對照相比較，其中ー個氨基酸被鑒定為對于結合tim-1至關重要。
本發明的相關方面提供了鑒定tim-4中對于tim_4與tim_l結合起關鍵作用的氨基酸殘基的方法，該方法包括(a)將以下兩種物質相結合(I)包括tim-4粘蛋白區域的多肽，其中所述的tim-4粘蛋白區域與SEQ ID NO :3134-318殘基或SEQID NO :4136-281殘基中所列的tim-4粘蛋白區域具有ー個和10個氨基酸之間的位點相關性；(2) tim-1多肽，其中所述的tim-1多肽可以結合tim-4 ； (b)測定多肽和tim-1多肽間復合物的形成；并且
(c)若復合物的形成與合適的對照不同，則將形成的復合物與合適的對照相比較，其中ー個氨基酸被鑒定為對于結合tim-1至關重要。在鑒定tim-4中對于tim-4與tim_l結合至關重要的氨基酸的方法中的ー個實施方案中，合適的對照包括(l)tim-l多肽，和(2)包括SEQ ID NO :331-133氨基酸和/或SEQ ID N03 134-318氨基酸的對照多肽間形成的復合物。在另ー個實施方案中，tim-1多肽包括(I)SEQ ID NO :121-126 氨基酸；(2) SEQID NO :221-129 氨基酸；(3)與 SEQ ID NO:121-126氨基酸或SEQ ID N01 130-237氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(4)與SEQ ID NO :221-129氨基酸或SEQ ID NO :2127-288氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列。本發明的另ー個方面提供了測定所測多肽是否結合tim-1多肽的方法，其中所測多肽包括那些與SEQ ID NO :331-133氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列，該方法包括(a)將所測多肽與tim-1多肽相接觸；并且(b)測定多肽和tim-1多肽間復合物的形成；其中若檢測到復合物的形成則所測多肽被鑒定為與tim-1多肽相結合。在一個示范性實施方案中，tim-1 多肽包括(I)SEQ ID NO :121-126 氨基酸；(2) SEQ ID NO :221-129 氨基酸；(3)與SEQ ID NO :121-126氨基酸或SEQ IDNO :1130-237氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或⑷與SEQ ID NO :221-129氨基酸或SEQ ID NO :2127-288氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列。本發明的另ー個方面提供了測定所測多肽是否結合tim-4多肽的方法，其中所測多肽包括那些與SEQ ID NO :121-126氨基酸或SEQ ID NO 1 130-237至少具有90%相同或相似的氨基酸序列，該方法包括(a)將所測多肽與tim-4多肽相接觸；并且(b)測定多肽和tim-4多肽間復合物的形成；其中若檢測到復合物的形成則所測多肽被鑒定為與tim-1多肽相結合。在一個實施方案中，tim-4多肽包括(I)SEQ ID NO :331-133位氨基酸；(2) SEQID NO :431-134 位氨基酸；(3)與 SEQ IDNO :331-133 位氨基酸或 SEQ ID NO :3134-318 位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(4)與SEQ ID NO 4 31-134位氨基酸或SEQ ID NO :4136-281位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(5)與tim_4多肽至少具有90%相同的氨基酸序列，該tim-4多肽包含從SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :11，SEQ ID NO 12 中挑選的氨基酸序列。本發明的另ー個方面提供了防止或減少主體中患遺傳性過敏癥的方法，該方法包括給予主體治療有效性劑量的多肽，所述多肽包括(I)SEQ ID NO :331-133位氨基酸；(2)SEQ IDNO :431-134位氨基酸；(3)與SEQ ID NO :331-133位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或⑷與SEQ IDNO =431-134位氨基酸或SEQ ID NO 4的136-281位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(5)與tim-4多肽至少具有90%相同的氨基酸序列，該 tim-4 多肽包含從 SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 9,SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11, SEQ ID NO :12中挑選的氨基酸序列。本發明的另ー個方面提供了治療或防止或減少主體中遭受A型肝炎感染的可能性的方法，該方法包括給予主體治療有效性劑量的多肽，所述多肽包括(I)SEQ ID N0:3的31-133 位氨基酸；(2) SEQ ID NO 4 的 31-134 位氨基酸；(3)與 SEQ IDNO 3 的 31-133 位氨基酸或SEQ ID NO 3的134-318位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(4)與SEQ IDNO :4的31-134位氨基酸或SEQ ID NO :4的136-281位氨基酸至少具有90%相 同或相似的氨基酸序列；或(5)與tim-4多肽至少具有90%相同的氨基酸序列，該tim-4多肽包含從 SEQID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQID NO : 11，SEQ IDNO : 12中挑選的氨基酸序列。在一個實施方案中，主體并未患有A型肝炎。在另ー實施方案中，主體并未感染A型肝炎病毒。而在另一實施方案中，主體中抗A型肝炎抗體血清呈陰性。在另ー實施方案中，主體是兒童。在另ー實施方案中，遺傳性過敏癥的疾病包括哮喘，鼻炎，濕疹和花粉熱。本發明的另ー個方面提供了一種新的可溶性tim-4多肽。ー個方面提供了ー種包括ー種tim-4IgV區域，tim-4胞內區域,和一個縮短了的tim_4粘蛋白粘液素區域的分離多肽，其中該多肽不包括tim-4跨膜區域。本發明的另ー個方面提供了ー種包括ー種tim-4IgV區域,和一個截短的tim-4粘蛋白區域的分離多肽,其中該多肽不包括tim-4跨膜區域或tim-4胞內區域。在一種優選的實施方案中，可溶性tim-4多肽是ー種哺乳動物多肽，如人類或小鼠多肽。在一種特別的實施方案中，可溶性的tim-4多肽包括SEQ ID NO:331-133氨基酸或SEQ IDNO :431-134氨基酸。在另ー個實施方案中，可溶性tim_4多肽包括SEQ ID NO :9，10，11，12中所列的序列，雖然在其他實施方案中可溶的tim-4多肽不包括信號序列。在一些實施方案中，可溶性tim-4多肽與其他多肽融合，如増加其體內穩定性的多肽。在一些實施方案中，融合多肽包括免疫球蛋白Fe區域或ー種血清白蛋白多肽。本發明進ー步提供了編碼這里所述的可溶性tim-4多肽的核酸以及包括tim-4可溶性多肽和ー種藥物可接受載體的組合物。II.定義出于方便，在此集合了說明書、實施例、和權利要求中使用的某些術語。除非另有定義，所有這里使用的技術和科學術語具有本發明所屬領域中的普通技術人員通常理解上的相同含義。這里使用的詞“ー個”和“一個”指一個或多于ー個(例如，至少ー個)主體。根據實施例，“ー個元素”指一個或多于ー個元素。這里使用的術語“包括”，可以與術語“包括但不限干”交換使用。
這里使用的術語“或”，可以與術語“和/或”交換使用，除非文中清楚地指明其他意義。這里使用的術語“例如”，可以與術語“例如但不限干”交換使用。術語“核酸”指多聚核酸如脫氧核糖核酸(DNA)，及在適用的地方，指核糖核酸(RNA)。該術語應理解為也包括，作為等同物的，由核酸類似物形成的RNA或DNA類似物，及，如所述實施方案中所應用的，單鏈(正義或反義)和雙-鏈多聚核酸。術語“防止”是專業-公認的，當涉及某些情況下使用時，如局部復發(例如，疼痛)，ー種疾病如癌癥，一種復合癥狀如心臟病或其他任何醫學疾病，在此領域中是熟知的，并包括在情況發生之前給予復合物治療，使得與未接受復合物治療的主體相比，可使主體減少發病頻率，減弱嚴重性，或延緩醫學疾病的發作。這樣，癌癥的防止包括，例如，通過統計的和/或具有臨床意義的計數，與未接受治療的對照群體相比，接受預防疾病治療的病
人群體中可檢測到的癌癥生長的數量有所下降，并且/或者與未接受治療的對照群體相比，接受治療的群體中可檢測到的癌癥生長的發生將延緩。感染的防止包括，例如，與未接受治療的對照群體相比，接受治療的群體中感染診斷的數量將減少，并且/或者與未接受治療的對照群體相比，延緩接受治療的群體中感染癥狀的發作。疼痛的防止包括，例如，與未接受治療的對照群體相比，對于接受治療的群體遭受的疼痛，其發生頻率將減少，嚴重性將減弱，或可選地有所延緩。這里使用的術語“有效數量”指達到預期結果所需的預先給予的一定劑量的有效數量。本發明的化合物的有效劑量可以根據各種因素而變化，如疾病的階段，年齡，性別，及動物的體重。劑量方案可以進行調整以提供最優的治療反應。例如，可以按天注射ー些分離的劑量，或根據治療情況的緊急情況所顯示劑量可以適當地減少。這里使用的術語“主體”指任何脊椎動物，適宜地為哺乳動物，更適宜地為人類。主體的實施例包括人類，非-人類靈長類，嚙齒動物，豚鼠，兔，綿羊，豬，山羊，牛，馬，狗，貓，鳥，和魚。這里使用的多肽的“變體”指具有一個或更多氨基酸替換的一段氨基酸序列。變體可以具有“保守的”變化，其中替換的氨基酸具有相似的結構或化學特性(例如，將亮氨酸替換為異亮氨酸)。更罕見的，變體可以具有“非保守的”變化(例如，將氨基こ酸替換為色氨酸)。相似的次要輔基改變還包括氨基酸刪除或插入，或兩種兼有。此領域中熟知的計算機程序可以作為指南找出被替換，插入，或刪除后將不會擾亂生物或免疫活性的氨基酸殘基，例如，DNASTAR軟件。這里使用的“Thl-相關的失調”是一種異常相關的疾病或情況，例如，與參考相比，如，ー種正常對照，Thl細胞的活性增強(例如，Thl細胞的應答增強)或數量増加。Thl失調的實施例包括，例如，自身免疫失調(如多發硬化癥、風濕性關節炎、I型糖尿病和Crohn氏病)。這里使用的“Th2_相關的失調”是一種異常相關的疾病或情況，例如，與參考相比，如，ー種正常對照，Th2細胞的活性增強(例如，Th2細胞的應答增強)或數量増加。Th2失調的實施例包括，例如，哮喘，過敏，和抗體成分相關的失調(例如，風濕性關節炎)。這里使用的術語“類似物”包括，但不局限于，與參考序列相比，具有ー個或多個氨基酸替換，插入，和/或刪除的氨基酸序列。氨基酸替換可以是保守或非保守特性。保守的氨基酸替換包括將本發明的多肽的ー個或多個氨基酸替換為具有相似電荷，大小，和/或親水性特性的氨基酸。只有保守替換形成的類似物是功能等同的。非-保守氨基酸替換包括將多肽的一個或多個氨基酸替換為具有非相似電荷，大小，和/或親水性特性的氨基酸。氨基酸插入可由單ー氨基酸殘基或2到15個氨基酸組成的序列組成。刪除可以是ー個或多個氨基酸的移除，或氨基酸序列的不連續部分。刪除的氨基酸可以是連續的或非連續的。III. Tim氨基酸和核酸序列人類和小鼠的tim多肽序列描述于SEQ ID NOs :1_14和PCT公開No. WO03/002722，美國專利號 6066498，6204371，6288218，6084083，6414117，6562343，及美國專利申請公開號2003/0069196和2003/0124114，其教導通過在此引述全部整合于本文中。本發明的Tim-1, tim-2和tim_4的核酸和多肽根據進ー步的理解包括下列描述的核酸和變體的序列。變體核酸序列包括那些具有ー個或多個核酸差異的序列，如替換，插入或刪除，例如等位基因的變體；并且將，因此，包括與編碼野生-型tim-1，tim-2和tim-4核酸序列不同的編碼序列，例如，歸因于遺傳密碼的退化。例如，編碼tim-1的IgV區域的核酸可以是 與野生-型tim-1具有90%，95%，99%，或100%—致性的核酸序列。小鼠和人類tim-1多肽和核酸序列見美國專利申請公開號2003/0124114，其內容通過在此引述全部整合于本文中。人類tim-1多肽見Genbank Deposit No. NP_036338 (SEQID勵1)，并且。0嫩核酸序列見匪_012206(5￡0 ID NO :5)。小鼠的tim-1氨基酸和核酸(cDNA)序列分別見 Genbank DepositNo. NP_599009 (SEQ ID NO :2)及 NM_134248 (SEQ IDNO 6) o tim-1 在科技文獻中也指 HAVCRl，KMl，HAVCR，KM-I，TMD I。自然發生的人類tim-1等位基因變體氨基酸和核酸序列見美國專利申請公開號2003/0124114SEQ ID NOs :17-28。這些序列通過引述在此被整合。人類tim_lIgV區域跨越SEQ ID N0:1的21-126位殘基，而小鼠tim-lIgV區域跨越SEQ ID NO :2的21-129位殘基。人類tim-1粘蛋白區域跨越130-237位殘基。小鼠tim_l粘蛋白區域跨越127-288位殘基。人類和小鼠tim-1的額外區域，如信號序列，跨膜區域和胞內區域描述于McIntireet. al. , Nat. Immunol. (2001) ；2(12) :1109_16，其內容通過在此引述被合并于本文。小鼠TIM-2，一種類似的305個氨基酸的膜蛋白，與小鼠tim_l具有64%的一致性，與大鼠KIM-I具有60%—致性，與hHAVcr-1具有32%—致性。與TIM-1類似，TIM-2具有兩個胞外N-連接糖基化位點和ー個帶有多個0-連接糖基化位點的絲氨酸，蘇氨酸-富足粘蛋白區域。TIM-2也具有一個胞內酪氨酸激酶磷酸化模體，RTRCEDQVY。小鼠TIM-2多肽和核酸序列分別見美國專利申請公開號2003/0124114的序列5和8。額外的小鼠tim_2序列見 Genbank Deposit No. NP_599009 及 NM_134249。小鼠 tim_2 的 IgV 區域大約從 SEQID NO 13 的 25-127 位置。小鼠和人tim-4多肽和核酸的序列見美國專利申請公開號2003/0124114中描述，其內容通過在此引述而全部合并于本文。人tim-4的氨基酸序列(SEQ ID NO :3)和核酸(cDNA) (SEQID NO 7)序列分別見美國專利申請公開號2003/0124114, SEQ IDNOs 33和34中描述，同樣的，tim-4的等位基因變量氨基酸和核酸(cDNA)序列也分別在SEQ ID NOs 35和36中被描述。小鼠tim-4的兩種氨基酸序列在SEQ ID NO 4(NP 848874)和SEQ IDNO : 12中被描述。對應于SEQ ID NO : 12的核酸序列見SEQ ID NO :3 (NM_178759)。人tim_4的IgV區域橫跨SEQID NO 3的31-133位殘基，小鼠tim_4的IgV區域橫跨SEQID NO 4的31-134位殘基。人tim-4的粘蛋白區域橫跨SEQID NO 3的134-318位殘基。小鼠tim_4的粘蛋白區域橫跨SEQ ID NO 4的134-281位殘基。本發明也提供了變異tim-4多肽和編碼核酸。在本發明的一方面，變異tim-4多肽缺少ー個或多個外顯子，導致多肽缺少N-末端，C-末端或中間序列，或因為外顯子刪除而具有一個移碼的閱讀框。在某一實施方案中，本發明提供了缺失橫跨膜區域的可溶性tim-4多肽。在另ー實施方案中，本發明提供了缺失橫跨膜的區域和缺失所有或部分粘蛋白區域的可溶性tim-4多肽。在某一實施方案中，可溶性tim-4多肽缺失粘蛋白區域C-末端的10-40個氨基酸，15-30個氨基酸，或更適宜地18-25個氨基酸。在某一實施方案中，變異的可溶性tim-4多肽包括的氨基酸序列見SEQ ID NOs :9，10，或11。在另ー實施方案中，可溶性人tim-4多肽缺失SEQ ID NO :3的282-337殘基。本發明也提供了編碼所述的可溶性tim-4多肽的核酸。本發明的核酸進ー步被理解為包括上述多肽的變異體的核酸。變異體核酸序列包括的序列有ー個或多個核酸差異，比如，通過替換，増加或刪減，如等位基因變異體；并且將，因此包括不同于野生型tim-1或tim-4核酸序列的編碼序列，例如由于基因編碼退化所導致。例如，編碼tim-lIgV區域的核酸可以是與野生型tim-lIgV區域的序列至少有80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%，100%等同或相似的核酸序列。人和小鼠的tim 多肽序列在 PCT
發明者維杰伊·K·庫查魯, 修蒙尼·查克瓦替, 特麗·斯特羅姆, 鄭心校, 詹尼弗·梅耶斯 申請人:布賴漢姆婦女醫院, 貝斯以色列護理醫療中心