專利名稱：一種胰島素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胰島素的制備方法，具體地說(shuō)，涉及一種包括兩步層析純化胰島素步驟的制備方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病。近年來(lái),全世界糖尿病的患病率都在迅猛增長(zhǎng)。而在中國(guó)，隨著人民生活方式的改變和老齡化進(jìn)程的加速，糖尿病的患病率呈快速上升趨勢(shì)，到2011年底，中國(guó)已經(jīng)確診的糖尿病患者人數(shù)超過(guò)了 9240萬(wàn)人，成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的另一個(gè)嚴(yán)重危害人民健康的重要慢性非傳染性疾病。糖尿病的急、慢性并發(fā)癥，尤其是慢性病并發(fā)癥累及多個(gè)器官，致殘、致死率高，嚴(yán)重影響患者的身心健康，并給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。胰島素治療一直被當(dāng)作是治療糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。上世紀(jì)70年代，人們通過(guò)基因工程技術(shù)開發(fā)出了重組人胰島素，到90年代，隨著胰島素技術(shù)的不斷發(fā)展，人們又相繼開發(fā)出了具有不同作用時(shí)間特點(diǎn)的新一代胰島素類似物，例如賴脯胰島素、門冬胰島素、賴谷胰島素、地特胰島素、德谷胰島素、甘精胰島素等。目前生產(chǎn)重組胰島素的方法一般是先通過(guò)基因工程合成胰島素原(pro-insulin)或胰島素前體(pre-proinsulin),再通過(guò)酶切形成胰島素。胰島素原由A鏈、B鏈、C鏈(又叫連接肽)組成，其由N端至C端的連接順序NH2-B鏈-Arg-Arg-C鏈-Lys-Arg-A鏈-COOH(參見附圖I)。為了促進(jìn)胰島素原的正確折疊，人們有時(shí)會(huì)在B鏈N端通過(guò)Arg或Lys連接融合蛋白或信號(hào)肽，形成胰島素前體。此外，為了生產(chǎn)不同結(jié)構(gòu)的胰島素類似物，人們會(huì)在胰島素的A鏈或B鏈上進(jìn)行氨基酸突變或是側(cè)鏈連接，形成胰島素類似物原或胰島素類似物前體，但是其C鏈、融合蛋白或信號(hào)肽與A鏈、B鏈的連接關(guān)系一般不會(huì)改變。胰蛋白酶和羧肽酶B是重組胰島素生產(chǎn)過(guò)程中不可或缺的雙酶。胰蛋白酶可以從肽鏈中精氨酸Arg或賴氨酸Lys的羧端切斷肽鏈(EC3. 4. 21. 4);羧肽酶B可以切除肽鏈羧端的堿性氨基酸，如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、鳥氨酸(EC3. 4. 17. 2)。在形成正確折疊的胰島素原或胰島素前體、或是胰島素類似物原或胰島素類似物前體后，用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切，可將C鏈和其他連接肽切除，形成正確折疊的胰島素或胰島素類似物(參見附圖I)。因此，目前通過(guò)基因工程生產(chǎn)重組胰島素的步驟一般為工程菌發(fā)酵表達(dá)胰島素原或胰島素前體、提取包涵體或可溶性表達(dá)產(chǎn)物、純化、復(fù)性、酶切、純化。在原核表達(dá)的現(xiàn)有技術(shù)中，通常是在通過(guò)復(fù)性步驟得到具有正確構(gòu)象的胰島素原或胰島素前體后，同時(shí)加入胰蛋白酶和羧肽酶B，酶切得到胰島素，然后再通過(guò)離子樹脂、HPLC等方法進(jìn)行純化(參見 EP0055945、CN90101415. X、CN86106574、CN200610117742. 8 等)。這種同時(shí)加入兩種酶的缺點(diǎn)是I.由于羧肽酶B只能酶切肽鏈羧端的堿性氨基酸，因此要等胰蛋白酶酶切后，羧肽酶B才能發(fā)揮作用，這樣會(huì)導(dǎo)致酶切作用不完全，效率低；2.兩種酶的作用位點(diǎn)不一致，會(huì)導(dǎo)致副產(chǎn)物多，酶切過(guò)程不易控制。在中國(guó)專利CN98813941. 3中，公開了另一種制備重組胰島素的方法，該方法在獲得正確構(gòu)象的胰島素前體后，先用胰蛋白酶酶切，形成具有正確構(gòu)象的Arg(B31)-胰島素，純化后再用羧肽酶B去除Arg (B31)-胰島素C端的Arg，形成正確構(gòu)象的胰島素，最后再用HPLC純化。該方法雖然分別采用胰蛋白酶和羧肽酶B進(jìn)行兩步酶切，但是在羧肽酶B酶切之后直接用HPLC進(jìn)行純化，會(huì)導(dǎo)致有些未與羧肽酶B反應(yīng)的Arg (B31)-胰島素與胰島素難以分離，影響最終產(chǎn)品的純度。該專利中最終人胰島素的純度為99%，由于胰島素制劑是注射到人體內(nèi)的藥物制劑，因此目前國(guó)際上對(duì)胰島素終產(chǎn)品純度的要求非常嚴(yán)格，規(guī)定單個(gè)雜質(zhì)的含量不能超過(guò)0. I %，雜質(zhì)總量不能超過(guò)0. 3%，即胰島素純度需要達(dá)到99. 7%以上。而上述專利的制備方法均不能達(dá)到該要求，實(shí)際上，在現(xiàn)有技術(shù)中，如要高回收率的制備純度達(dá)到99. 7%以上的胰島素，并且實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)是非常困難的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決上述現(xiàn)有問(wèn)題，提供一種包括兩步層析純化胰島素步驟的制備方法，該方法能提高酶切效率和酶切過(guò)程中的可控性，使胰蛋白酶和羧肽酶B作用完全，并且能徹底去除未與羧肽酶B反應(yīng)的胰島素前體，從而提高最終胰島素產(chǎn)品的純度和質(zhì)量，使最終胰島素純品的純度在99. 7%以上，并且回收率很高，可以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。因此，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種胰島素的制備方法，該方法包括以下步驟I.獲得正確構(gòu)象的胰島素原或胰島素前體；2.使用胰蛋白酶酶切步驟I的胰島素原或胰島素前體；3.純化步驟2的酶切產(chǎn)物；4.使用羧肽酶B酶切步驟3的純化產(chǎn)物；5.使用陽(yáng)離子交換層析純化步驟4的酶切產(chǎn)物。所述胰島素為任何A、B鏈羧端氨基酸選自非堿性氨基酸的人胰島素、胰島素類似物、胰島素衍生物，所述堿性氨基酸為精氨酸、賴氨酸、組氨酸、鳥氨酸等。優(yōu)選的胰島素包括但不限于人胰島素、賴脯胰島素、門冬胰島素、賴谷胰島素等。步驟I中所述正確構(gòu)象的胰島素原或胰島素前體可以通過(guò)各種本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)獲得。例如，可參見EP0055945發(fā)明詳述中步驟Al至Cl獲得正確構(gòu)象的人胰島素原，參見CN98813941. 3實(shí)施例5-5. 3獲得正確構(gòu)象的hGH-小胰島素原，參見CN90101415. X的各實(shí)施例(如實(shí)施例29)或CN 98114950. 2的各實(shí)施例(如實(shí)施例2)獲得正確構(gòu)象的胰島素類似物原等。此外,還可以通過(guò)US5358857、Villa-Komaroff et al.,PNAS，1978，75(8) :3727-3731,Thim et al，PNAS，1986,83 :6766-6770等文獻(xiàn)中介紹的方法獲得，或是采用其他公知肽合成技術(shù)制備，例如溶液法、固相合成法(J. Stewart等，《固相肽合成》，F(xiàn)reeman and Co. , San Francisco, 1969)、半合成法、基因工程法、DNA重組法等。步驟2中的胰蛋白酶可以從肽鏈中精氨酸Arg或賴氨酸Lys的羧端切斷肽鏈。用胰蛋白酶酶切步驟I中的胰島素原或胰島素前體，可以切除胰島素A鏈、B鏈之間的連接肽以及與B鏈連接的融合蛋白或信號(hào)肽，從而得到正確構(gòu)象的具有B31位精氨酸(ArgB31)的胰島素前體(參見附圖I)。所述使用胰蛋白酶進(jìn)行酶切的方法可通過(guò)各種本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行，例如以上述參考文獻(xiàn)中所公開的胰蛋白酶酶切條件進(jìn)行。具體的說(shuō)，可以先將步驟I中的胰島素原或胰島素前體配制成濃度為l_15mg/ml的溶液，調(diào)pH值至堿性環(huán)境，然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶與胰島素原或胰島素前體的質(zhì)量比為1/100-800，在4-15°C下反應(yīng)2-10小時(shí)，酶切反應(yīng)結(jié)束時(shí)用再將溶液調(diào)pH至酸性環(huán)境終止反應(yīng)。步驟3純化步驟的目的是去除未與胰蛋白酶反應(yīng)完全的各種副產(chǎn)物，得到純化的正確構(gòu)象的具有ArgB31的胰島素前體，該步驟可以通過(guò)各種本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行。例如可以通過(guò)陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、疏水層析、排阻層析、HPLC等之一或其組合的方法進(jìn)行純化。其中所述各種層析介質(zhì)可以是本領(lǐng)域常用的介質(zhì)，可以通過(guò)多種商業(yè)途徑購(gòu)得。例如，陽(yáng)離子交換介質(zhì)包括但不限于CM SepharoseT\SP S印harose 等，陰離子交換介質(zhì)包括但不限于DEAE Sepharose 、Q Sepharose 等,疏水層析介質(zhì)包括但不限于丁基瓊脂糖凝膠、苯基瓊脂糖凝膠、辛基瓊脂糖凝膠等，排阻層析介質(zhì)包括但不限于葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等。步驟4中的羧肽酶B可以切除肽鏈羧端的堿性氨基酸，如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、鳥氨酸，應(yīng)用羧肽酶B酶切步驟3所得到的純化的ArgB31_胰島素前體，可切去ArgB31，得到正確構(gòu)象的胰島素(參見附圖I)。所述使用羧肽酶B進(jìn)行酶切的方法可通過(guò)各種本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行，例如以上述參考文獻(xiàn)中所涉及的羧肽酶B酶切條件進(jìn)行。具體的說(shuō)，可以將步驟3中的純化產(chǎn)物配制成濃度為l-50mg/ml的溶液，調(diào)pH值至堿性環(huán)境，然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B與ArgB31_胰島素前體的質(zhì)量比為1/200-3000，在20_40°C下反應(yīng)0. 1-2小時(shí)，酶切反應(yīng)結(jié)束時(shí)再將溶液調(diào)pH至酸性環(huán)境終止反應(yīng)。步驟5純化步驟的目的是去除未與羧肽酶B反應(yīng)完全的具有ArgB31的胰島素前體，得到純化的正確構(gòu)象的胰島素。該步驟采用陽(yáng)離子交換層析進(jìn)行純化，具有以下優(yōu)點(diǎn)I-Arge31帶有正電荷，能與層析介質(zhì)牢固地結(jié)合，可使ArgB31胰島素前體與胰島素分離徹底；2.切去了 ArgB31的胰島素電荷發(fā)生變化，其洗脫時(shí)間也發(fā)生變化，此純化步驟可以去除步驟3中與ArgB31胰島素前體具有相同洗脫時(shí)間的微量雜質(zhì)；3.陽(yáng)離子交換層析的洗脫液不含有機(jī)溶液，可提高最終產(chǎn)品的安全性。其中所述陽(yáng)離子交換層析所采用的介質(zhì)可以是本領(lǐng)域常用的介質(zhì)，可以通過(guò)多種商業(yè)途徑購(gòu)得，包括但不限于CM Sepharose , SPSepharose 等。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟3包含陽(yáng)離子交換層析純化步驟，并且其層析介質(zhì)與步驟5中的陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)相同。發(fā)明人經(jīng)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在兩步層析純化中使用相同的陽(yáng)離子交換介質(zhì)，可使純化效果協(xié)同增加，使胰島素產(chǎn)品的最終純度更高，能達(dá)到99. 8%以上。優(yōu)選的，本發(fā)明所述胰島素的制備方法還可包含對(duì)步驟5的純化產(chǎn)物進(jìn)行精純的步驟。所述精純可采用本領(lǐng)域所公知的技術(shù)進(jìn)行，例如，可通過(guò)HPLC的方法進(jìn)行。本發(fā)明胰島素的制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)I.先后使用胰蛋白酶和羧肽酶B對(duì)胰島素原或胰島素前體進(jìn)行酶切，能夠提高酶切效率和酶切過(guò)程中的可控性，使胰蛋白酶和羧肽酶B作用完全。2.在羧肽酶B酶切ArgB31_胰島素前體后增加一次陽(yáng)離子交換層析的純化步驟，能徹底去除未與羧肽酶B反應(yīng)的胰島素前體，從而提高最終胰島素產(chǎn)品的純度和質(zhì)量，使最終胰島素純品的純度能達(dá)到99. 7%以上。
3.切除了 ArgB31的胰島素電荷發(fā)生變化，洗脫時(shí)間發(fā)生變化，步驟5的第二次純化可以去除步驟3中與ArgB31_胰島素前體具有相同洗脫時(shí)間的微量雜質(zhì)。4.本制備方法制備的胰島素，不僅雜質(zhì)總量低，低于0.3%，并且單個(gè)雜質(zhì)的含量也很低，都低于0. 1%。5.在步驟3和步驟5中使用相同的陽(yáng)離子交換介質(zhì)進(jìn)行層析純化，可使純化效果協(xié)同增加，使胰島素產(chǎn)品的最終純度更高，能達(dá)到99. 8%以上。6.本制備方法能應(yīng)用于任何A、B鏈末端不是精氨酸、賴氨酸、組氨酸、鳥氨酸的胰島素，應(yīng)用性廣。7.本制備方法方法簡(jiǎn)單，成本低，回收率高，可以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。


圖I :應(yīng)用胰蛋白酶和羧肽酶B將胰島素原酶切成胰島素的反應(yīng)流程示意圖。圖2 :實(shí)施例I中人胰島素的純度分析圖及局部放大圖。圖3 :實(shí)施例2中人胰島素的純度分析圖及局部放大圖。圖4 :實(shí)施例3中人胰島素的純度分析圖及局部放大圖。圖5 :實(shí)施例4中賴脯胰島素的純度分析圖及局部放大圖。圖6 :實(shí)施例5中賴谷胰島素的純度分析圖及局部放大圖。圖7 :實(shí)施例6中門冬胰島素的純度分析圖及局部放大圖。
具體實(shí)施例方式材料:膜蛋白酶、竣妝酶B購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司；CM Sepharose 、SP Sepharose 、DEAE Sepharose 、Q Sepharose 、苯基瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠購(gòu)自通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)貿(mào)易發(fā)展有限公司；Kromasil CS柱購(gòu)自阿克蘇諾貝爾管理有限公司。實(shí)施例I制備人胰島素根據(jù)歐洲專利EP0055945發(fā)明詳述中步驟Al至Cl獲得正確構(gòu)象的人胰島素原，并將其配制成lmg/ml的溶液。用濃氨水調(diào)節(jié)上述溶液pH值至8，然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶與人胰島素原的質(zhì)量比為I : 200，將混合液于15°C下反應(yīng)2小時(shí)，用鹽酸將pH值調(diào)為4以終止酶切反應(yīng)，得到ArgB31_人胰島素。將上述酶切后的溶液采用疏水層析進(jìn)行純化，采用苯基瓊脂糖凝膠作為層析介質(zhì)，洗脫液為溶于磷酸緩沖液的硫酸銨溶液，梯度0M-2M，得到純化的ArgB31_人胰島素前體。將純化后的ArgB31_人胰島素用pH為7. 5的IM Tris緩沖液配制成lmg/ml的溶液，然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B與ArgB31_人胰島素的質(zhì)量比為I : 200，將混合液于20°C反應(yīng)2小時(shí)，用鹽酸將pH值調(diào)為4以終止酶切反應(yīng)，得到人胰島素。將上述酶切后的溶液進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，采用快流速SPS印harose 作為層析介質(zhì)，洗脫液為NaCl溶液，梯度20mM-160mM，得到純化的人胰島素。將上述純化的人胰島素(經(jīng)氨基酸序列分析，所得結(jié)構(gòu)與預(yù)期一致)可以再經(jīng)過(guò)一次HPLC層析進(jìn)行精純，樹脂為Kromasil C8,流動(dòng)相為溶于0. 25M醋酸銨緩沖液的乙腈，梯度17% -35%，得到精純后的人胰島素，測(cè)定純度為99. 71% (圖2)。實(shí)施例2制備人胰島素根據(jù)中國(guó)專利CN98813941. 3實(shí)施例5_5. 3獲得正確構(gòu)象的hGH_小胰島素原融合蛋白，并將其配制成10mg/ml的溶液。用NaOH調(diào)節(jié)上述溶液pH值至10. 8，然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶與hGH-小胰島素原融合蛋白的質(zhì)量比為I : 100，將混合液于4°C下反應(yīng)5小時(shí)，用磷酸將PH值調(diào)為3. 5以終止酶切反應(yīng)，得到ArgB31_人胰島素。將上述酶切后的溶液進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，采用快流速CMS印harose 作為層析介質(zhì)，洗脫液為溶于IOmM檸檬酸緩沖液的NaCl溶液， 梯度75mM-225mM，得到純化的ArgB31-人胰島素前體。將純化后的ArgB31_人胰島素用pH8的50mM Tris-HCl緩沖液配制成10mg/ml的溶液，然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B與ArgB31_人胰島素的質(zhì)量比為I : 1000，將混合液于37°C反應(yīng)I小時(shí)，用磷酸將pH值調(diào)為3. 5以終止酶切反應(yīng)，得到人胰島素。將上述酶切后的溶液進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，采用快流速CMSepharose 作為層析介質(zhì)，洗脫液為溶于IOmM檸檬酸緩沖液的NaCl溶液，梯度75mM-225mM，得到純化的人胰島素。將上述純化的人胰島素(經(jīng)氨基酸序列分析，所得結(jié)構(gòu)與預(yù)期一致)可以再經(jīng)過(guò)一次HPLC層析進(jìn)行精純，樹脂為Kromasil C8,流動(dòng)相為溶于0. 25M醋酸銨緩沖液的乙腈，梯度17% _35%，得到精純后的人胰島素，測(cè)定純度為99. 85% (圖3)。實(shí)施例3制備人胰島素根據(jù)中國(guó)專利CN200610117742. 8實(shí)施例I (說(shuō)明書30_37段)獲得正確構(gòu)象的胰島素原，并將其配制成15mg/ml的溶液。用NaOH調(diào)節(jié)上述溶液pH值至12,然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶與胰島素原的質(zhì)量比為I : 400，將混合液于12°C下反應(yīng)3小時(shí)，用磷酸將PH值調(diào)為4以終止酶切反應(yīng)，得到ArgB31_人胰島素。將上述酶切后的溶液進(jìn)行陰離子交換層析,采用DEAE Sepharose 作為層析介質(zhì)，洗脫液為溶于0. IM Tris和50%乙醇溶液的NaCl溶液，梯度20mM-50mM，得到純化的ArgB31-人胰島素前體。將純化后的ArgB31-人胰島素配制成20mg/ml的溶液,并用NaOH調(diào)pH值至10,然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B與ArgB31_人胰島素的質(zhì)量比為I : 1500，將混合液于25°C反應(yīng)2小時(shí)，用磷酸將pH值調(diào)為3. 5以終止酶切反應(yīng)，得到人胰島素。將上述酶切后的溶液進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，采用快流速SPS印harose 作為層析介質(zhì)，用NaCl溶液作為洗脫液，梯度為0M-0. 5M，得到純化的人胰島素。將上述純化的人胰島素(經(jīng)氨基酸序列分析，所得結(jié)構(gòu)與預(yù)期一致)可以再經(jīng)過(guò)一次HPLC層析進(jìn)行精純，樹脂為Kromasil C8,流動(dòng)相為溶于0. 25M醋酸銨緩沖液的乙腈，梯度17% _35%，得到精純后的人胰島素，測(cè)定純度為99. 75% (圖4)。實(shí)施例4制備賴脯胰島素(LysmDrom-人胰島素)根據(jù)中國(guó)專利CN90101415.X實(shí)施例29(至說(shuō)明書第74頁(yè)第3段)得到正確構(gòu)象賴脯胰島素原，并將其配制成10mg/ml的溶液。用NaOH調(diào)節(jié)上述溶液pH值至11，然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶與賴脯胰島素原的質(zhì)量比為I : 600，將混合液于10°C下反應(yīng)4小時(shí)，用鹽酸將PH值調(diào)為2. 5以終止酶切反應(yīng)，得到ArgB31_賴脯胰島素前體。將上述酶切后的溶液先進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，采用快流速CMS印harose 作為層析介質(zhì)，洗脫液為溶于IOmM檸檬酸緩沖液的NaCl溶液，梯度75mM-225mM ;之后再進(jìn)行陰離子交換層析，采用DEAES印harose 作為層析介質(zhì)，洗脫液為溶于0. IM Tris和50%乙醇溶液的NaCl溶液，梯度20mM-50mM，得到純化的ArgB31_賴脯胰島素前體。將純化后的ArgB31-賴脯胰島素前體配制成10mg/ml的溶液,并用50mM Tris-HCl緩沖液調(diào)PH至8，加熱至35°C，然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B與賴脯胰島素前體的質(zhì)量比為I : 2000，將混合液于35°C反應(yīng)I小時(shí)，用鹽酸將pH值調(diào)為3以終止酶切反應(yīng)，得到賴
脯胰島素。
將上述酶切后的溶液進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，采用快流速CMS印harose 作為層析介質(zhì)，洗脫液為溶于IOmM檸檬酸緩沖液的NaCl溶液，梯度75mM-225mM，得到純化的賴脯胰島素。將上述純化的賴脯胰島素(經(jīng)氨基酸序列分析，所得結(jié)構(gòu)與預(yù)期一致)可以再經(jīng)過(guò)一次HPLC層析進(jìn)行精純，樹脂為Kromasil C8，流動(dòng)相為溶于0. 25M醋酸銨緩沖液的乙腈，梯度17% _35%，得到精純后的賴脯胰島素，測(cè)定純度為99. 86% (圖5)。本方法也可應(yīng)用于中國(guó)專利CN90101415. X中其他的胰島素類似物，制備方法同賴脯胰島素，最終產(chǎn)品經(jīng)純度分析都可達(dá)99. 8%。實(shí)施例5制備賴谷胰島素(Lys53Glum-人胰島素)根據(jù)中國(guó)專利CN 98114950. 2說(shuō)明書和實(shí)施例2得到正確構(gòu)象賴谷胰島素原，并將其配制成5mg/ml的溶液。用濃氨水調(diào)節(jié)上述溶液pH值至9，然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶與賴谷胰島素原的質(zhì)量比為I : 800，將混合液于4°C下反應(yīng)10小時(shí)，用鹽酸將pH值調(diào)為2以終止酶切反應(yīng)，得到ArgB31_賴谷胰島素前體。將上述酶切后的溶液采用排阻層析進(jìn)行純化，采用葡聚糖凝膠作為層析介質(zhì)，用5mM檸檬酸作為洗脫液，得到純化的ArgB31_賴谷胰島素前體。將純化后的ArgB31_賴谷胰島素前體配制成30mg/ml的溶液,并用NaOH調(diào)pH至9,然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B與賴谷胰島素前體的質(zhì)量比為I : 2500，將混合液于40°C反應(yīng)0. 5小時(shí)，用鹽酸將pH值調(diào)為2以終止酶切反應(yīng)，得到賴谷胰島素。將上述酶切后的溶液再進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，快流速CM Sepharose 作為層析介質(zhì)，用NaCl溶液作為洗脫液，梯度為0M-0. 5M，得到純化的賴谷胰島素。將上述純化的賴谷胰島素(經(jīng)氨基酸序列分析，所得結(jié)構(gòu)與預(yù)期一致)可以再經(jīng)過(guò)一次HPLC層析進(jìn)行精純，樹脂為Kromasil C8，流動(dòng)相為溶于0. 25M醋酸銨緩沖液的乙腈，梯度17% -35%，得到精純后的賴谷胰島素，測(cè)定純度為99. 71% (圖6)。本方法也可應(yīng)用于中國(guó)專利98114950. 2中其他的胰島素類似物，制備方法同賴谷胰島素，最終產(chǎn)品經(jīng)純度分析都可達(dá)99. 7%。實(shí)施例6制備門冬胰島素(Aspm-人胰島素)根據(jù)中國(guó)專利CN86106574和CN98813941. 3的方法得到正確構(gòu)象門冬胰島素原，并將其配制成5mg/ml的溶液。用NaOH調(diào)節(jié)上述溶液pH值至10，然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶與門冬胰島素原的質(zhì)量比為I : 600，將混合液于8°C下反應(yīng)5小時(shí)，用鹽酸將pH值調(diào)為2以終止酶切反應(yīng)，得到ArgB31_門冬胰島素前體。將上述酶切后的溶液先進(jìn)行陰離子交換層析，采用Q S印harose 作為層析介質(zhì)，用NaCl溶液作為洗脫液，梯度為0M-0. 5M;之后再進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，采用快流速SPS印harose 作為層析介質(zhì)，用NaCl溶液作為洗脫液，梯度為0M_0. 5M，得到純化的ArgB31_門冬胰島素前體。
將純化后的ArgB31_門冬胰島素前體配制成50mg/ml的溶液,并用NaOH調(diào)pH至10,然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B與門冬胰島素前體的質(zhì)量比為I : 3000，將混合液于30°C反應(yīng)I小時(shí)，用鹽酸將pH值調(diào)為3以終止酶切反應(yīng)，得到門冬胰島素。將上述酶切后的溶液進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，采用快流速SP Sepharose 作為層析介質(zhì)，用NaCl溶液作為洗脫液，梯度為0M-0. 5M，得到純化的門冬胰島素。將上述純化的門冬胰島素(經(jīng)氨基酸序列分析，所得結(jié)構(gòu)與預(yù)期一致)可以再經(jīng)過(guò)一次HPLC層析進(jìn)行精純，樹脂為Kromasil C8，流動(dòng)相為溶于0. 25M醋酸銨緩沖液的乙腈，梯度17% _35%，得到精純后的門冬胰島素，測(cè)定純度為99.85% (圖7)。
本方法也可應(yīng)用于中國(guó)專利CN86106574中其他的胰島素類似物，制備方法同門冬胰島素，最終產(chǎn)品經(jīng)純度分析都可達(dá)99. 8%。
權(quán)利要求
1.一種胰島素的制備方法，包括以下步驟 (O獲得正確構(gòu)象的胰島素原或胰島素前體； (2)使用胰蛋白酶酶切步驟I的胰島素原或胰島素前體； (3)純化步驟2的酶切產(chǎn)物； (4)使用羧肽酶B酶切步驟3的純化產(chǎn)物； (5)使用陽(yáng)離子交換層析純化步驟4的酶切產(chǎn)物； 其中所述胰島素為A、B鏈羧端氨基酸選自非堿性氨基酸的人胰島素或胰島素類似物或胰島素衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其中胰島素選自人胰島素、賴脯胰島素、門冬胰島素或賴谷胰島素。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其中步驟3中的純化步驟選自陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、疏水層析、排阻層析、HPLC之一或其組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其中步驟3中的純化步驟包含陽(yáng)離子交換層析純化，并且層析介質(zhì)與步驟5中的陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)相同。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其中步驟5中陽(yáng)離子交換層析的介質(zhì)選自CMSepharose 了“或 SP Sepharose 。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的制備方法，其還進(jìn)一步包括在步驟5后使用HPLC進(jìn)行精純的步驟。
7.一種胰島素的制備方法，包括以下步驟 (1)獲得正確構(gòu)象的胰島素原或胰島素前體； (2)使用胰蛋白酶酶切步驟I的胰島素原或胰島素前體； (3)使用CMSepharose 純化步驟2的酶切產(chǎn)物； (4)使用羧肽酶B酶切步驟3的純化產(chǎn)物； (5)再次使用CMSepharose 層析純化步驟4的酶切產(chǎn)物； (6)使用HPLC精純步驟5的酶切產(chǎn)物； 其中所述胰島素為A、B鏈羧端氨基酸選自非堿性氨基酸的人胰島素或胰島素類似物或胰島素衍生物。
8.一種胰島素的制備方法，包括以下步驟 (O獲得正確構(gòu)象的胰島素原或胰島素前體； (2)使用胰蛋白酶酶切步驟I的胰島素原或胰島素前體； (3)使用CM Sepharose ^P DEAE Sepharose ^*純化步驟 2 的酶切產(chǎn)物； (4)使用羧肽酶B酶切步驟3的純化產(chǎn)物； (5)再次使用CMSepharose 層析純化步驟4的酶切產(chǎn)物； (6)使用HPLC精純步驟5的酶切產(chǎn)物； 其中所述胰島素為A、B鏈羧端氨基酸選自非堿性氨基酸的人胰島素或胰島素類似物或胰島素衍生物。
9.一種胰島素的制備方法，包括以下步驟 (O獲得正確構(gòu)象的胰島素原或胰島素前體； (2)使用胰蛋白酶酶切步驟I的胰島素原或胰島素前體；(3)使用QSepharose 和SP Sepharose "*純化步驟2的酶切產(chǎn)物； (4)使用羧肽酶B酶切步驟3的純化產(chǎn)物； (5)再次使用SPSepharose 層析純化步驟4的酶切產(chǎn)物； (6)使用HPLC精純步驟5的酶切產(chǎn)物； 其中所述胰島素為A、B鏈羧端氨基酸選自非堿性氨基酸的人胰島素或胰島素類似物或胰島素衍生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中胰島素選自人胰島素、賴脯胰島素、門冬胰島素或賴谷胰島素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胰島素的制備方法，該方法包括兩步層析純化的步驟，能提高酶切效率和酶切過(guò)程中的可控性，使胰蛋白酶和羧肽酶B作用完全，并且能徹底去除未與羧肽酶B反應(yīng)的胰島素前體，從而提高最終胰島素產(chǎn)品的純度和質(zhì)量，使最終胰島素純品的純度能達(dá)到99.7%以上，并且回收率高，可以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/18GK102628072SQ20121007416
公開日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者李學(xué)勇, 王大梅 申請(qǐng)人:甘李藥業(yè)有限公司