專利名稱：重組蛋白混合物介導的牛結核病診斷方法及其試劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于免疫檢測技術領域。本發明涉及用于牛分支桿菌感染檢測的新型試劑盒及方法。
背景技術：
牛結核病(BovineTuberculosis)主要是由牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)感染引起的ー種人畜共患的慢性傳染病，結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)感染也可引起。世界各國均有發生，危害十分嚴重，給畜牧業帶來巨大的經濟損失和貿易限制，目前世界范圍內約有5000萬頭牛感染了結核病，毎年因此損失30多億美元。該病能通過未經巴氏消毒的奶及奶制品、接觸污染的氣溶膠或者動物尸體等傳染給人，從而嚴重威脅著公共衛生安全及人類健康，因此具有非常重要的公共衛生意義。世界衛生組織(WHO)指出“在存在牛結核病的國家，人類始終受到威脅，除非消滅牛結核病，否則人類結核病的控 制是不會成功的。”目前，ー些較發達國家和地區，如美國、澳大利亞和北歐等已基本消滅了牛結核病。但牛結核病在我國依然是最常見的多發性疾病之一，1985年和1987年兩次全國奶牛抽樣調查結果顯示，牛結核病的患病率分別達5. 83%和5. 43%ο近年來，隨著個體養牛戶的增加，結核病的陽性檢出率正逐年上升。目前我國一些省區牛結核病的發病率已達10. 18%以上，甚至更高。牛結核菌素皮內變態反應試驗(GB/T 18646)為世界動物衛生組織(OIE)規定的牛結核病檢驗的標準方法。結核菌素又稱為純化蛋白衍生物(purified proteinderivatives, PPD)，是將牛型或禽型分枝桿菌菌株接種適宜培養基培養，收獲培養物，經滅活、濾過除菌、提純或濃縮制成，其實際上是牛型或禽型分枝桿菌菌株在液體培養基中生長時產生的代謝物質，含有多種抗原成分，其中部分的抗原在禽分枝桿菌、結核分枝桿菌、牛分枝桿菌及非致病性環境分枝桿菌中廣泛存在，致使pro檢驗的特異性較差，在實際檢測時容易出現假陽性，而且pro生產エ藝復雜，生產過程中需要培養具有毒力的牛分枝桿菌，很難保證其安全性及各批次間pro質量的穩定。90年代后期國外發展起來的以PF1D為抗原的Y-干擾素(interferon-Y, IFN- Y )釋放試驗明顯提高了牛分枝桿菌檢測的靈敏性，其原理為致敏的外周血淋巴細胞在體外培養過程中，通過特異抗原(如PPD)刺激后被活化，從而高水平表達并分泌IFN- Y，通過相應的技術手段對培養上清中IFN-Y的釋放水平進行檢測(如ELISA)從而判斷其是否感染，其結果與淋巴細胞增生試驗具有很好的相關性。該方法避免了對機體的侵入性實驗，可以短時間內多次重復實驗，同時也摒棄了結核菌素試驗中操作和判斷上的主觀性，因此具有非常廣泛的應用前景，已在澳大利亞、新西蘭等國家進行了大量的田間試驗，目前國外已將該類牛結核病檢測試劑盒商品化，并被OIE所推薦使用，但因使用PH)作為刺激原，在實際使用過程中不可避免出現假陽性。為了提高牛分枝桿菌檢測特異性，國內外學者開始利用基因重組技術，重組表達了牛分枝桿菌的多種特異性蛋白，例如6kDa早期分泌性抗原性祀(The early secretedantigenic target6ku protein, ESAT-6)、MPB-64、MPB-70、MPB-63、熱休克蛋白 65 (Heatshock protein 65, HSP-65)、抗原 85B (antigen 85B, Ag_85B)、IOkDa 的培養濾液抗原(IOkDa culture filtrate antigen, CFP-10)等。然后，用這些重組蛋白中的一種或者多種混合(又稱“雞尾酒法”)作為包被抗原進行酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay,ELISA)檢測,通過檢測牛血清中相應的抗體水平進行牛結核病的血清學檢測，該方法雖然一定程度上提高了檢測的特異性，但其敏感性不夠理想，特別是感染早期及免疫低下者常出現假陰性。因此，研究更加敏感、特異的牛結核病新型檢測抗原和檢測方法，是控制牛結核病當務之急。本發明人通過基因重組技術表達了牛分枝桿菌的多種特異性蛋白，并將其進行組合，使得刺激原克服了 Pro的缺點，具有了生物安全、組分明確、含量穩定、成本低廉的優點。用多個重組蛋白進行組合作為刺激原替代PF1D進行皮內變態反應實驗和IFN-Y釋放試驗進行了反復研究，將兩種方法結合，很好地提高了實驗特異性的同時，也克服了單ー抗 原或“多抗原雞尾酒”血清學檢測敏感度不高等缺陷。

發明內容
本發明的目的在于提供用于牛分枝桿菌感染檢測的新型試劑及方法。本發明的發明原理為由于在皮內變態反應和Y-IFN釋放試驗中使用傳統的PPD作為刺激原時，存在著成分復雜，特異性差的缺點，而現有用來替代pro作為刺激原的重組牛結核桿菌蛋白的敏感性不理想。本發明嘗試用這些重組蛋白或其混合物替代pro作為刺激原，檢測牛分枝桿菌感染。首先，本發明提供了一種重組蛋白混合物介導的牛結核病診斷試劑，其中包括三種重組表達的牛分枝桿菌蛋白的混合物，所述重組蛋白混合物能夠有效刺激牛分枝桿菌感染動物產生DTH反應及刺激感染動物外周血淋巴細胞釋放IFN- Y。其中所述三種重組蛋白分別具有SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。本發明中，三種重組蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B的混合比例為I 2 Γ2 廣2，包括但不限于I 1 :1、2 2 1和I 1 :2，其中優選為I 1 :1。本發明對所述三種重組蛋白及其混合物進行了皮內變態反應和IFN-Y釋放試驗，實驗結果證明(I)本發明所述重組蛋白的混合物作為刺激原時，其檢測的特異性和靈敏度優于PPD作為刺激原的皮內變態反應試驗和IFN-Y釋放試驗；(2)本發明所述重組蛋白的混合物作為刺激原時，其檢測的特異性和靈敏度優于單一重組蛋白；(3)重組蛋白混合物作為刺激原時，其檢測的特異性和靈敏度優于相同蛋白的串聯共表達產物。在各種不同成分不同比例的重組蛋白混合物中，由CFP-10/ESAT-6、ΜΡΒ70和Ag85B的混合三種成分2: :1:1混合的混合物作為刺激原進行皮內變態反應時，能特異性的檢測牛分枝桿菌感染牛，且敏感度較高，最小刺激量可達0. 3mgg/ml。另ー方面，本發明還提供了ー種試劑盒，其中包括本發明所述的診斷試劑和ELISA檢測所需的試劑。所述ELISA檢測所需試劑包括但不限于包被緩沖液、洗滌緩沖液、酶標板和辣根過氧化物酶標記兔抗牛ニ抗等。另ー方面，本發明還提供了用于制備重組蛋白混合物介導的牛結核病診斷試劑的引物，其中包括4對引物，其中第一引物對的核苷酸序列為SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5,第二引物對的核苷酸序列為SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:7，第三引物對的核苷酸序列為SEQID N0:8和SEQ ID N0:9，第四引物對的核苷酸序列為SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11。另ー方面，本發明提供了所述引物在在制備牛分枝桿菌感染檢測或診斷試劑中的用途。另ー方面，本發明提供了ー種制備重組蛋白混合 介導的牛結核病診斷試劑的方法，該方法包括(a)PCR擴增獲得的編碼基因；(b)重組表達步驟(a)獲得的編碼基因得到3種重組蛋白；(C)將步驟(b)獲得的3種蛋白按比例混合得到牛分枝桿菌感染檢測試劑。在一個實施方案中，所述制備方法步驟(a)中PCR擴增所用4對引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO:4 至 SEQ ID NO: 11 所示。在一個實施方案中，所述制備方法步驟(b)中得到的三種重組蛋白的具有分別具有 SEQID NO: I、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3 的氨基酸序列。在一個實施方案中，其中步驟(C)中的混合比例混合比例為廣2 Γ2 :廣2，包括但不限于I :1 :1、2 2 1和I :1 :2，其中優選為2 1 :1。另ー方面，本發明提供了一種牛結核病診斷方法，該方法包括下述步驟(a)剃毛后測量牛頸部上1/3處皮膚厚度；(b)向測量部位施用權利要求I至3任一項所述的診斷試劑；(b) 72小時后，再測皮膚厚度，并計算該部位注射前后的皮厚差。在本發明的ー個具體實施方案中，所述診斷方法包括下列步驟a)在牛的頸部上1/3處剃毛，并用游標卡尺測量該部位的皮膚厚度；b)在剃毛部位用Iml注射器皮內注射O. Iml終濃度為O. 5mg/ml的本發明所述的重組蛋白混合物；c)注射72h后，游標卡尺測量注射部位的皮膚厚度，并計算該部位注射前后的皮厚差。該方法的判斷標準為當皮厚差小于2mm時判定為陰性,皮厚差> 2mm時判定為牛分枝桿菌感染陽性。另ー方面，本發明還提供了一種牛結核病診斷方法，該方法包括a)采集抗凝血，加入細胞培養板山)然后向上述細胞培養板中加入本發明所述的，37°C下共孵育24小時；c)收集上層血漿作為待檢樣品，用ELISA方法檢測血漿樣品中牛IFN-Y的釋放水平。本發明的優點本發明的檢測牛分枝桿菌感染的新型檢測試劑具有特異性高、生物安全、組分明確、含量穩定、成本低廉、可標準化生產等優點，本發明的新型牛分枝桿菌檢測試劑盒及方法克服了牛分枝桿菌血清學檢測方法和以pro為刺激原的皮內變態反應及IFN-Y釋放試驗的不足，具有較強的的特異性和敏感性，因此可用于牛結核病的臨床檢測。


圖I.牛分枝桿菌特異性蛋白PCR擴增產物電泳結果。泳道M DL2000plus分子量Marker ;泳道I :CFP-10/ESAT_6串聯基因產物；泳道2 :MPB70PCR擴增產物；泳道3 Ag85BPCR擴增產物。圖2.重組蛋白SDS-PAGE電泳結果。泳道I :CFP_10重組蛋白純化產物；純化產物對照；泳道2 ESA-6重組蛋白純化產物；泳道3 :串聯表達的CFP10/ESAT6重組蛋白純化產物泳道4 pET-32a(+)空載體標簽蛋白(PET)純化產物；泳道5 MPB70重組蛋白純化產物；泳道6 Ag85B重組蛋白純化產物。
圖3.重組蛋白MPB70和Ag85B作為CFP-10和ESAT-6的補充抗原的作用效果。每個點代表一個動物某注射部位的皮厚差，I代表CFP10/ESAT6、MPB70和Ag85B以等比例混合作為刺激原；2代表CFP-10/ESAT-6串聯蛋白。圖4.三種重組蛋白以不同混合方式作為皮內變態反應試驗刺激原的作用效果。每個點代表一個動物某注射部位的皮厚差，組合I代表CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B以2:1:1混合；組合2代表CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B等比例混合。圖5.重組蛋白混合物的劑量篩選結果。每個點代表一個動物某注射部位的皮厚差。圖6.載體標簽蛋白PET作為皮內變態反應試驗刺激原檢測結果。每個點代表一個動物某注射部位的皮厚差，PET代表載體標簽蛋白。
圖7.重組蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B混合物作為皮內變態反應試驗刺激原檢測牛結核陰性牛結果。每個點代表一個動物某注射部位的皮厚差，CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B以2:1:1混合作為刺激原，蛋白終濃度為O. 3mg/ml。圖8.重組蛋白CFP-10/ESAT-6、MPB70和Ag85B混合物(重組蛋白濃度為O. 3mg/ml)作為皮內變態反應試驗刺激原臨床檢測結果。每個點代表一個動物某注射部位的皮厚差，左圖代表檢測的40頭結核病陰性牛數據，右側圖為30頭結核病陽性牛數據。下面結合具體實施例，進ー步闡述本發明。本領域技術人員應理解，這些實施例僅用于說明本發明而絕不對本發明的范圍構成任何限制。除另有說明外，本申請中的所有科技術語都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。本申請中引用的任ー專利、專利申請和出版物在此引入作為參考。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常采用常規條件例如SambiOOk等人，分子克隆實驗室手冊' (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的方法。
實施例實施例I重組質粒的構建I. I牛分枝桿菌基因組DNA的提取用M. bovis Vallee III菌株(購自中國獸醫藥品監察所)培養物，參照細菌基因組DNA小量快速提取試劑盒(購自北京博大泰克基因技術有限責任公司)說明書所述方法進行。I. 2引物的設計根據GenBank 中 M. bovis AF2122/97 基因組 DNA(登錄號為 BX248333)的 ESAT-6、CFP-10和MPB70、Ag85B基因序列設計特異性引物，上游引物攜帶Bam H I酶切位點，下游引物攜帯Hind III酶切位點，引物由上海生エ生物技術有限公司合成，序列見表1(下劃線處為保護性堿基及酶切位點)。表I PCR引物名稱、序列及擴增產物的大小
權利要求
1.一種重組蛋白混合物介導的牛結核病診斷試劑，所述重組蛋白混合物由三種重組蛋白組成，所述三種重組蛋白分別具有SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的氨基酸序列。
2.權利要求I所述的重組蛋白混合物介導的牛結核病診斷試劑，其中所述三種重組蛋白的混合比例為I 2:1 2:1 2。
3.權利要求2所述的重組蛋白混合物介導的牛結核病診斷試劑，其中所述三種重組蛋白的混合比例為I :1 :1或2 :2 :1或I :1 :2。
4.ー種試劑盒，其中包括權利要求I至3任一項所述的診斷試劑和ELISA檢測所需的包被緩沖液、洗滌緩沖液、酶標板和辣根過氧化物酶標記鼠抗牛IFN-Y單抗等試劑。
5.用于制備權利要求I至3任一項所述診斷試劑的引物，其中包括4對引物，其中核苷酸序列如SEQ ID NO:4至SEQ ID NO: 11所示。
6.ー種制備權利要求I至3任ー項所述診斷試劑的方法，該方法包括(a)PCR擴增獲得重組蛋白編碼基因，其中PCR擴增使用權利要求5所述的引物；(b)重組表達步驟(a)獲得的編碼基因得到所述重組蛋白；(C)將步驟(b)獲得的重組蛋白混合得到所述診斷制劑。
7.權利要求6所述的制備方法，其中步驟(b)重組表達使用的宿主為大腸桿菌。
8.權利要求6或7所述的制備方法，其中步驟(c)中重組蛋白的混合比例為廣2Γ2 I 2。
9.一種重組蛋白混合物介導的牛結核病診斷方法，其中包括(a)用權利要求I至3任ー項所述的診斷試劑對待檢血液樣品進行處理；(b)用ELISA方法測定處理后血液樣品上層血漿中IFN-Y的釋放水平。
10.一種重組蛋白混合物介導的牛結核病診斷方法，其中包括(a)剃毛后測量牛頸部上1/3處皮膚厚度；(b)向測量部位施用權利要求I至3任ー項所述的診斷試劑；(b)72小時后，再測皮膚厚度，并計算該部位注射前后的皮厚差。
全文摘要
本發明屬于免疫檢測領域。本發明提供了重組蛋白混合物介導的牛結核病診斷方法及其試劑。所述試劑包括作為特異性刺激原的重組蛋白混合物，該重組蛋白混合物能夠刺激牛分枝桿菌感染動物產生DTH反應。利用本發明所述檢測試劑建立的皮內變態反應試驗與PPD皮內變態反應試驗相比，具有更高的特異性，可區分牛分枝桿菌感染和環境分枝桿菌感染，因此可有效用于牛結核病的臨床檢測。
文檔編號C07K14/35GK102692509SQ20121014713
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月11日 優先權日2012年5月11日
發明者侯紹華, 朱鴻飛, 袁維峰, 賈紅, 郭曉宇, 鑫婷 申請人:中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所